Name: 无细胞生产蛋白脂质体，用于功能分析和靶向膜蛋白的抗体开发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习使用小麦无细胞系统高效合成膜蛋白并制备蛋白脂质体，用于功能分析、药物靶点筛选和抗体开发。该方法成功率高，可在短时间内获得高质量蛋白脂质体。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由日本医学研究开发署（AMED）资助，资助编号为JP20am0101077，项目名称为支持药物发现和生命科学研究的平台项目（创新药物发现和生命科学研究支持基础，BINDS）。本工作还部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目（编号20K05709）的支持。

1. pEU 表达质粒的制备
注意：pEU 表达质粒应在片段中包含起始密码子、目标膜蛋白的开放阅读框以及终止密码子（见图1）。在需要时，于适当位置添加检测或纯化标签序列。亚克隆可采用限制性酶切或无缝克隆方法。本文描述的是使用无缝克隆方法的实验方案。
<ol>
	<li>准备插入DNA片段。
	<ol>
		<li>使用cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，引物为引物1和引物2。引物1和引物2分别包含15 bp的重叠序列，用于无缝克隆（见 材料表). 
		注意：不要在细胞中被加工并从成熟蛋白中切除的序列（如信号序列）。合成蛋白的加工在小麦细胞-free系统中不会发生。无需添加Kozak序列。pEU-E01-MCS载体含有E01翻译增强子。</li>
		<li>加入 1/25 体积的 Dpn使用 I 型限制性内切酶处理 PCR 产物，以去除模板质粒 DNA。在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并将浓度调整至20–50 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线性化 pEU-E01-MCS 载体。
	<ol>
		<li>使用 pEU-E01-MCS、引物 3 和引物 4 进行反向 PCR。</li>
		<li>加入1/25体积的 Dpn将 I 型限制性内切酶加入反向 PCR 产物中，37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商的建议纯化PCR产物。将浓度调整至20–50 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将2 µL插入DNA片段、2 µL线性化载体和4 µL 2x无缝克隆酶混合液混合。</li>
	<li>转化 大肠杆菌 将无缝克隆产物转化至JM109菌株中。使用涂布棒将菌液均匀涂布于LB-氨苄青霉素琼脂平板上。 
	注意：pEU 载体含有氨苄青霉素抗性标记。</li>
	<li>使用引物5和引物6分别从pEU质粒的多克隆位点（MCS）的5’端和3’端对构建的表达质粒进行测序验证。</li>
	<li>扩增并纯化表达质粒。
	<ol>
		<li>培养质粒转化后的菌株 E. coli 在37 ˚C、125次/分钟振荡条件下，将JM109菌株接种于150 mL LB-氨苄青霉素培养基中过夜培养。</li>
		<li>使用市售质粒提取中量试剂盒提取并纯化质粒。将质粒溶解于500 µL TE缓冲液中。 
		警告：请勿使用质粒小提试剂盒进行质粒提取，因其无法提供足够质量和数量的质粒。</li>
		<li>加入500 µL苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），剧烈振荡5分钟，然后在17,800 ×g下离心5分钟&#160;x g 室温下，将上层质粒溶液转移至新离心管中。 
		注意：佩戴一次性手套，以保护皮肤免受苯酚和氯仿的伤害。 
		注意：为了去除质粒提取试剂盒中的RNase污染，需使用苯酚-氯仿法纯化质粒。</li>
		<li>加入 500 µL 氯仿以彻底去除苯酚。剧烈振荡 5 分钟，然后在 17,800 ×g 下离心 5 分钟 x g 室温下将上层质粒溶液转移至新离心管中。</li>
		<li>加入2.5倍体积的乙醇和1/8倍体积的7.5 M醋酸铵，于-30 °C保存1小时。</li>
		<li>在 17,800 离心 x g 4 °C 下离心 10 分钟。用 500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀。小心移除上清液，将沉淀静置 5 分钟以晾干。</li>
		<li>将表达质粒完全溶解于100 µL超纯水中。使用260 nm处的吸光度测定质粒浓度，并将浓度调整至1 mg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外转录
注意：在转录和翻译步骤中，请使用DNase和核酸酶-free的塑料管和枪头。避免对塑料器皿进行高压灭菌，以防污染。
<ol>
	<li>在新的塑料管中收集超纯水。 
	注意：请勿使用经DEPC处理的水，因为残留的DEPC会强烈抑制反应。转录与翻译应使用新制备的超纯水。</li>
	<li>通过混合以下组分配制转录反应体系：115.2 µL 超纯水、40 µL Transcription Buffer LM、20 µL NTP混合液、2.4 µL 80 U/µL RNase抑制剂、2.4 µL 80 U/µL SP6聚合酶以及20 µL 1 mg/mL pEU表达质粒。轻轻翻转混匀试剂，短暂离心。</li>
	<li>将转录反应体系于37 °C孵育6小时。</li>
	<li>轻轻翻转混匀反应液，短暂离心。应立即用于翻译反应，否则需冷冻并保存于-80 °C。</li>
	<li>通过电泳确认转录产物。
	<ol>
		<li>将100 mL 1x TAE缓冲液与1 g琼脂糖混合，在微波炉中加热以制备1%琼脂糖TAE凝胶。</li>
		<li>取1 µL转录反应产物，加入3 µL水和4 µL 2x上样染料。 
		注意：RNA无需变性处理。</li>
		<li>将4 µL上述混合液与2 µL DNA ladder标记物加入琼脂糖TAE凝胶加样孔中。</li>
		<li>以100 V电压电泳20分钟。</li>
		<li>将凝胶置于溴化乙锭溶液中染色30分钟。使用紫外透射仪和凝胶成像系统观察mRNA的ladder条带模式。 
		注意：若观察到小于500 bp的弥散条带，则提示mRNA可能发生降解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 翻译所需材料的准备
<ol>
	<li>配制翻译缓冲液。
	<ol>
		<li>在50 mL离心管中，将27 mL新配制的超纯水与S1、S2、S3和S4的40x储存液各0.75 mL分别混合。 
		注意：根据所需1x翻译缓冲液的最终体积，按比例调整试剂用量。 
		警告：使用后，不得储存或再次冷冻多余的1x翻译缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制肌酸激酶储存液。将冻干的肌酸激酶溶解于超纯水中，使其终浓度为20 mg/mL。将溶液分装至0.2 mL 8联PCR管中，每管10至50 µL。用液氮速冻后，于-80 °C保存。 
		警告：肌酸激酶溶液解冻后不得再次冷冻。</li>
	<li>清洗透析杯（0.1 mL规格），以去除透析膜中的甘油。 
		注意：透析杯有多种不同规格。小规格透析杯（0.1 mL）用于小规模测试（第5.4节），大规格透析杯（2 mL）用于大规模制备（第5.5节）。大规格透析杯的透析膜可省略清洗步骤。
	<ol>
		<li>取1 mL超纯水加入新的1.5 mL离心管中。将小规格透析杯（0.1 mL）插入管内，再向透析杯中加入0.5 mL超纯水。</li>
		<li>室温孵育至少30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 脂质体的制备
注意：本文描述了两种脂质体的制备方案。一种使用即用型冻干脂质体（第4.1节），另一种通过水合薄脂膜来制备脂质体（第4.2节）。
<ol>
	<li>使用冻干脂质体来制备脂质体。 
	注意：制备蛋白脂质体的一种更简便方法是使用市售的Asolectin脂质体。Asolectin是一种从大豆中提取的天然脂质。
	<ol>
		<li>打开含有10 mg冻干Asolectin脂质体的西林瓶（参见材料表），向瓶底加入200 µL翻译缓冲液（第3.1节）。密封西林瓶并孵育10分钟。</li>
		<li>将西林瓶置于涡旋混合器上剧烈振荡1分钟。</li>
		<li>将西林瓶插入一个50 mL离心管中，以500 x g离心1分钟，使内容物沉降至管底。</li>
		<li>使用移液器将Asolectin脂质体悬液（50 mg脂质/mL）转移至新的1.5 mL离心管中。应立即用于翻译反应；否则需在液氮中速冻后于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过水合薄脂膜的方法制备脂质体。
	<ol>
		<li>若脂质以粉末形式出售，将其溶解于氯仿或适当的有机溶剂中，配制成10–100 mg/mL的浓度。 
		注意：可使用纯化或合成的两亲性脂质来制备薄脂膜。Asolectin的纯化方法已有文献报道38。功能化修饰的脂质（如生物素化脂质、荧光标记脂质和佐剂脂质）可添加至基础脂质中，以制备具有特定功能的脂质体。</li>
		<li>将含有50 mg脂质的脂质溶液转移至旋转蒸发瓶中。</li>
		<li>使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，并将脂质均匀地铺展在蒸发瓶底部内壁上，形成一层薄脂膜。</li>
		<li>将蒸发瓶置于真空干燥器中，在负压条件下静置过夜，以彻底去除残留溶剂。</li>
		<li>向蒸发瓶中加入1 mL翻译缓冲液。旋转蒸发瓶，使缓冲液充分覆盖薄脂膜表面。孵育5分钟，使脂膜充分水合。</li>
		<li>使用超声波均质仪或超声清洗器对蒸发瓶进行超声处理。期间应不时改变蒸发瓶的角度，确保溶液充分接触脂膜。确保薄脂膜完全从瓶壁剥离，并形成均匀乳化的脂质体悬液。 
		注意：含生物素化脂质的脂质体的电子显微镜图像见图1。</li>
		<li>将脂质体悬液（50 mg脂质/mL）转移至新的1.5 mL离心管中。如不立即使用，需在液氮中速冻后于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 体外翻译
<ol>
	<li>将小麦胚芽提取物置于室温水中浸泡几分钟，快速解冻。解冻后立即轻轻颠倒混匀，短暂离心后置于冰上冷却，直至使用。 
	注意：使用后应将小麦胚芽提取物在液氮中迅速冷冻，并于 -80 °C 保存。该提取物可耐受多次冻融循环。</li>
	<li>解冻 20 mg/mL 肌酸激酶储备液。取 5 µL 储备液与 45 µL 翻译缓冲液混合，配制 2 mg/mL 肌酸激酶工作液。 
	注意：不建议将肌酸激酶反复冻存。</li>
	<li>根据需要解冻脂质体或 mRNA。</li>
	<li>进行小规模蛋白质翻译。
	<ol>
		<li>移除步骤 3.3.2 中准备好的试管和透析杯（0.1 mL）中的水分。</li>
		<li>向试管中加入 1 mL 翻译缓冲液，向透析杯中加入 300 µL 翻译缓冲液。 
		注意：若透析杯底部未接触到 1.5 mL 试管中的翻译缓冲液液面，需向试管中额外加入 50–100 µL 缓冲液。</li>
		<li>通过混合 15.6 µL 翻译缓冲液、2.4 µL 2 mg/mL 肌酸激酶、12 µL 50 mg/mL 脂质体、15 µL 小麦胚芽提取物和 15 µL mRNA 配制翻译反应混合液。轻轻颠倒混匀后短暂离心。</li>
		<li>使用 200 µL 移液器吸取 60 µL 翻译反应混合液。</li>
		<li>将移液器吸头插入透析杯内翻译缓冲液的液面下方，缓慢而轻柔地排出反应混合液。用盖子盖好透析杯以防止蒸发。 
		注意：反应混合液会自然沉降至杯底并形成双层结构。切勿通过混合或摇动干扰双层结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行大规模翻译（图 1）。
	<ol>
		<li>将 22 mL 翻译缓冲液倒入 25 mL 试管中。将一个大尺寸透析杯（2 mL）插入试管，并向透析杯中加入 2 mL 翻译缓冲液。</li>
		<li>通过混合 130 µL 翻译缓冲液、20 µL 2 mg/mL 肌酸激酶、100 µL 50 mg/mL 脂质体、125 µL 小麦胚芽提取物和 125 µL mRNA 配制翻译反应混合液。用移液器轻轻混匀。</li>
		<li>使用 1,000 µL 移液器吸取全部翻译反应混合液（500 µL），按照步骤 5.4.5 的方法将反应混合液注入透析杯中。用盖子盖好透析杯以防止蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将反应体系在 15 °C 下孵育 24 小时。</li>
	<li>用移液器充分混匀透析杯中的反应液，然后将粗制蛋白脂质体悬液转移至新试管中。 
	注意：建议使用平底 1.5 mL 试管收集小规模翻译产生的蛋白脂质体。离心后，脂质体会在试管底部角落形成致密且易于观察的沉淀。</li>
</ol>
6. 蛋白脂质体的纯化
<ol>
	<li>将含有粗制蛋白脂质体悬液的离心管在 4 °C 下以 17,800 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。用移液器将蛋白脂质体沉淀重悬于 PBS 中（小规模：1 mL，大规模：10 mL）。</li>
	<li>重复离心和洗涤蛋白脂质体操作，再进行两轮。</li>
	<li>洗涤后，加入少量 PBS，用移液器充分重悬蛋白脂质体沉淀。使用微量移液器测定悬液体积，并加入 PBS 将体积调整至 60 µL（小规模）或 500 µL（大规模）。将悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>取 10 µL 蛋白脂质体悬液转移至新的 PCR 管中用于 SDS-PAGE 分析。将剩余样品分装成小份，以便必要时使用。在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
7. SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色
<ol>
	<li>向10 µL蛋白脂质体悬浮液中加入70 µL水和40 µL 3x SDS-PAGE上样缓冲液。 
	注意：请勿煮沸SDS-PAGE样品，因为膜蛋白会发生聚集，在电泳过程中难以进入丙烯酰胺凝胶。此外，应在SDS-PAGE上样缓冲液中加入足量还原剂（例如终浓度为3%的2-巯基乙醇），以防止氧化。</li>
	<li>在电泳槽中安装一块5%–20%的梯度SDS-PAGE凝胶。上样3 µL、6 µL和12 µL的蛋白脂质体样品，同时上样2 µL蛋白质分子量标记物以及BSA标准品系列。</li>
	<li>以52 mA、400 V恒流电泳30分钟。</li>
	<li>用考马斯亮蓝（CBB）染料染色凝胶1小时。用热水脱色并扫描凝胶图像。</li>
	<li>使用NIH Image J软件（https://imagej.nih.gov/ij/）定量每道中膜蛋白条带的强度，并利用BSA标准品系列估算合成膜蛋白的含量。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种高效制备膜蛋白的方法，具有操作简便、高度可重复且易于放大的优点。该方法还有望降低需要大量膜蛋白的实验所耗费的时间与成本。与双层膜法或透析法相比，双层透析法的生产效率提高了4–10倍（图2B）45。在极端情况下，使用双层透析法相较于双层膜法，某种离子通道和转运蛋白的产量分别提高了30倍和20倍（数据未显示）。本方案的高产量特性在用于免疫的抗原制备中具有显著优势。蛋白脂质体常被用作免疫抗原，以开发抗膜蛋白抗体。嵌入蛋白脂质体中的高浓度、高纯度膜蛋白能够有效刺激免疫反应并诱导抗体产生41,47。利用该双层透析法，可在数天内轻松制备出含有数毫克膜蛋白的蛋白脂质体用于免疫。事实上，我们课题组已利用该方法成功合成G蛋白偶联受体（GPCRs）、离子通道和claudin蛋白，并将其作为免疫原注射小鼠，获得了针对这些蛋白的单克隆抗体31,<sup ...

膜蛋白是诊断和治疗中最重要的药物靶点之一。事实上，约一半的小分子药物靶向膜蛋白，例如G蛋白偶联受体（GPCRs）和离子通道1。多年来，研究人员一直致力于膜蛋白的生物化学、生物物理和结构研究，以阐明其结构与功能2,3。此外，针对膜蛋白的单克隆抗体开发也正在积极进行，以加速功能与结构研究，并推动治疗和诊断应用的发展4,5,6,7,8,9。所有这些研究都需要大量高纯度的膜蛋白10。例如，抗体开发需要数毫克具有天然构象的纯化膜蛋白；而X射线晶体学则需要更大数量的高纯度膜蛋白。然而，膜蛋白的大规模生产仍是当前膜蛋白研究中的一个瓶颈11。膜蛋白具有复杂的结构，包含一个或多个跨膜螺旋，在细胞稳态中发挥重要作用。异源过表达膜蛋白会带来多种障碍，例如膜蛋白在局部高浓度下聚集，或干扰细胞信号通路。即使表达成功，后续的样品制备步骤也面临困难。例如，制备蛋白脂质体需要在膜蛋白的溶解、纯化和稳定化方面具备高水平的技术和专业经验，且耗费大量时间和精力12,13。
另一方面，近几十年来出现了一些先进技术，能够在不使用活细胞的情况下生产蛋白质14,15,16,17,18。无细胞蛋白合成技术可在试管中重建翻译反应。由于不存在细胞表达系统所具有的限制，无细胞系统具有合成多种难以在细胞中表达或对细胞具有毒性的蛋白质的潜力。将纯化的细胞提取物或重建的翻译机制与模板mRNA、氨基酸和能量来源混合，可在短时间内合成重组蛋白。在膜蛋白的合成中，通常向无细胞反应体系中添加由脂质或两亲性分子构成的某些支架，例如脂质体、双层胶束（bicelles）、纳米盘（nanodiscs）或共聚物19,20,21,22,23,24。合成的膜蛋白可与这些支架相互作用，并在水中保持稳定。无细胞合成的膜蛋白已广泛应用于功能研究和抗体生产25,26,27,28,29,30,31。
在本实验方案中，我们描述了一种利用小麦细胞-free系统和脂质体高效制备蛋白脂质体的无细胞方法。小麦细胞-free蛋白合成系统是一种强大的体外翻译系统，其提取物来源于小麦胚芽15,32,33。小麦胚芽含有丰富的翻译机制，且翻译抑制因子较少。作为真核生物的小麦，其翻译机制适用于真核蛋白的翻译，且翻译效率几乎不受模板mRNA密码子使用偏好的影响。利用小麦细胞-free系统，我们已成功合成了多种蛋白质，包括蛋白激酶34,35、泛素连接酶36、转录因子37以及膜蛋白，成功率较高。在膜蛋白的合成过程中，我们向翻译反应体系中加入脂质囊泡（liposome）作为支架19,38。膜蛋白的疏水结构域可与脂双层相互作用，并自发整合入脂质体中。尽管对翻译反应混合物进行常规离心即可实现蛋白脂质体的简单纯化20，但密度梯度离心可用于严格分离蛋白脂质体与小麦内源性蛋白。已有多种内在膜蛋白利用小麦细胞-free系统成功合成，并广泛应用于各类研究与开发中25,38,39,40,41,42,43,44。此外，我们还开发了用于大规模生产的“双层透析法”45,46。在该方法中，将杯状透析装置浸入底物供给缓冲液中，杯内形成两层结构：上层为翻译反应混合物，下层为底物供给缓冲液，如图1所示。通过该装置，可在反应混合物的顶部和底部持续高效地供给底物并清除副产物，从而长时间维持优异的翻译效率（图2A和图2B）45。

<table><tbody><tr><td>&amp;times;3 SDS-PAGE上样缓冲液</td><td></td><td></td><td>含10% 2-巯基乙醇</td></tr><tr><td>5-20% 线性梯度 SDS-PAGE 凝胶</td><td>ATTO</td><td>E-D520L</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>使用超纯水稀释乙醇。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Takara Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Nakalai tesque</td><td>02406-95</td><td>由于该试剂具有潮解性，打开后需将其全部溶于水中，并于-30℃保存。&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>氨苄西林钠</td><td>Nakalai tesque</td><td>02739-74</td><td></td></tr><tr><td>大豆磷脂酰胆碱脂质体，冻干粉</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-PLE-ASL</td><td>小瓶中含有10 mg冻干脂质体。</td></tr><tr><td>BSA 标准品</td><td></td><td></td><td>1000 纳克、500 纳克、250 纳克、125 纳克 BSA / 10 &amp;micro;L &amp;times;1 SDS-PAGE 上样缓冲液</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝凝胶染色</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>目的 cDNA 克隆</td><td></td><td></td><td>携带 cDNA 克隆或合成 DNA 片段的质粒</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Nakalai tesque</td><td>08402-84</td><td></td></tr><tr><td>冷却培养箱</td><td></td><td></td><td>温度范围为 0 到 40 &amp;deg;C 或更宽。</td></tr><tr><td>肌酸激酶</td><td>罗氏诊断</td><td>04524977190</td><td></td></tr><tr><td>透析杯（0.1 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，10K 截留分子量，0.1 mL</td></tr><tr><td>透析杯（2 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88404</td><td>Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，10K 截留分子量，2 mL</td></tr><tr><td>DNA ladder 标记物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD1703</td><td>FastDigest DpnI</td></tr><tr><td>E. coli 菌株 JM109</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>ATTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5%）</td><td>中村 tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 蒸发瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶扫描仪</td><td></td><td></td><td>我们使用文档扫描仪和LED免疫仪作为替代。</td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>目标脂质</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>NTP 混合物</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-NTP</td><td>ATP、GTP、CTP、UTP 混合物，每种 25 mM</td></tr><tr><td>无核酸酶 25 mL 管</td><td>IWAKI</td><td>362-025-MYP</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶塑料管</td><td>沃森生物实验室</td><td></td><td>请勿高压灭菌。需与其他实验分开使用。</td></tr><tr><td>无核酸酶吸头</td><td>沃森生物实验室</td><td></td><td>请勿高压灭菌。需与其他实验分开使用。</td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR纯化试剂盒</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740609</td><td>NucleoSpin 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒</td></tr><tr><td>pEU-E01-MCS 载体</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-11</td><td></td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>质粒大量提取试剂盒</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740410</td><td>NucleoBond Xtra Midi</td></tr><tr><td>引物1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td>5&amp;rsquo;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&amp;rsquo;&lt;br/&gt; 基因特异性引物，正向。大写字母表示用于无缝克隆的重叠序列，小写字母 nnnn 表示非特异性碱基&amp;hellip;（20-30 bp）显示基因特异性序列。</td></tr><tr><td>引物 2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td>5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&amp;rsquo;&lt;br/&gt; 基因特异性引物，反向。大写字母表示需添加的用于无缝克隆的重叠序列。小写字母 nnnn&amp;hellip;.（20-30 bp）显示基因特异性序列。</td></tr><tr><td>引物 3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td>5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'&#039;&lt;br/&gt; 用于载体线性化的正向引物。下划线部分在无缝克隆中作为重叠区域。</td></tr><tr><td>引物 4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td>5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 用于载体线性化的反向引物。下划线部分在无缝克隆中作为重叠区域。</td></tr><tr><td>引物 5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td>5&amp;rsquo;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&amp;rsquo;&lt;br/&gt; 测序引物，正向</td></tr><tr><td>引物 6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td>5&amp;rsquo;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&amp;rsquo;&lt;br/&gt; 测序引物，反向</td></tr><tr><td>蛋白质分子量标记物</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td>Precision Plus Protein 标准品</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无缝克隆酶混合物</td><td>New England BioLabs</td><td>E2611L</td><td>Gibson组装预混液&lt;br/&gt; 其他无缝克隆试剂也可获得。</td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶 &amp;和 RNase 抑制剂</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-ENZ</td><td></td></tr><tr><td>水下电泳系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>转录缓冲液 LM</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-5TB-LM</td><td></td></tr><tr><td>翻译缓冲液</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-SUB-SGC</td><td>SUB-AMIX SGC (&amp;times;40) 储存液（S1、S2、S3、S4）。&lt;br/&gt; 准备 &amp;times;使用前通过混合储备液 S1、S2、S3、S4 与超纯水配制 1 倍翻译缓冲液。</td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td>建议每次实验时使用超纯水制备系统制备超纯水。请勿进行高压灭菌。&lt;br/&gt; 我们使用 Milli-Q Reference 和 Elix10 系统制备了超纯水。&lt;br/&gt; 可使用市售无核酸酶水（非DEPC处理水）作为替代。开瓶后注意防止污染。</td></tr><tr><td>超声波均质机</td><td>Branson</td><td>SONIFIER 450D-Advanced 型号</td><td>超声波清洗器可作为替代品。</td></tr><tr><td>紫外透射仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小麦胚芽提取物</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-WGE-7240</td><td>WEPRO7240</td></tr></tbody></table>

无细胞合成蛋白脂质体用于膜蛋白的功能分析及抗体开发

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

膜蛋白在多种细胞过程中发挥着关键作用，并执行重要的生物学功能。在药物发现领域，膜蛋白具有重要的医学意义，因为超过一半的药物都以膜蛋白为靶点。然而，由于难以大量制备具有正确构象和活性的高质量膜蛋白，膜蛋白的生化、生物物理及结构研究以及抗体开发一直面临挑战。本文介绍一种“双层透析法”，利用小麦胚芽无细胞表达系统、脂质体和透析杯，可在短时间内以高成功率高效合成膜蛋白并制备纯化的蛋白脂质体。该方法可实现毫克级产量的膜蛋白表达，适用于G蛋白偶联受体（GPCRs）、离子通道、转运蛋白和四跨膜蛋白等。这种无细胞表达方法有助于显著减少制备高质量蛋白脂质体所需的时间、成本和工作量，为膜蛋白的功能分析、药物靶点筛选及抗体开发提供了理想的技术手段。

采用本方案，可在较短时间内获得部分纯化的蛋白脂质体。代表性结果如图2A所示。利用双层透析法（小规模）成功合成了A、B和C类共25种G蛋白偶联受体（GPCR），并通过离心和缓冲液洗涤实现部分纯化。尽管合成蛋白的产量因蛋白种类而异，但使用大型透析杯时，每反应通常可合成50至400 µg的膜蛋白。由于小麦细胞-free系统具有高度可扩展性，通过增加反应次数可轻松获得数毫克的膜蛋白。使用小型透析杯进行预实验即可充分评估目标蛋白在双层透析法中的表达效率。根据所获得的表达量，可估算使用大型透析杯生产目标蛋白的产量。
本方案适用于膜蛋白的表达，尤其适用于具有多个跨膜螺旋的膜蛋白。在大多数情况下，含有三个或更多跨膜螺旋的膜蛋白在合成后可有效整合至蛋白脂质体中（图2B），从而实现较高的蛋白脂质体制备效率。单跨膜螺旋蛋白通常能够顺利合成；然而，由于其疏水区域较小，很难整合到脂质体中。对于含有两个跨膜螺旋的蛋白，其是否能够锚定在脂质体上，取决于其跨膜螺旋的暴露方式。
<p cl...

本方案描述了一种利用小麦无细胞系统和脂质体，通过双层透析法高效制备高质量蛋白脂质体的无细胞方法。该方法为膜蛋白的功能分析、药物靶点筛选以及抗体开发提供了适宜的技术手段。

膜蛋白在多种细胞过程中发挥着关键作用，并执行重要的生物学功能。膜蛋白在药物研发中具有重要的医学意义……

所有膜蛋白都是药物发现中的重要靶点。目前，膜蛋白的大规模生产仍是开展生物化学、生物物理及结构研究的主要瓶颈。该方法可用于在体外高效合成膜蛋白，并在较短时间内以高成功率制备纯化的蛋白脂质体。加入适当的试剂（包括无细胞表达质粒）以制备转录反应体系后，通过轻柔翻转或轻弹管壁混匀管内物质，并在微型离心机中短暂离心。离心后，将转录反应体系在37摄氏度下孵育六小时，随后进行混匀和再次离心。为制备翻译缓冲液，需用新鲜的超纯水稀释储存液。对于小规模透析，使用超纯水清洗100微升透析杯，以去除透析膜中的甘油。向一个新的1.5毫升离心管中加入1毫升超纯水，并将小规模透析杯插入管中。然后向透析杯中加入500微升超纯水，在室温下孵育30分钟。制备脂质体时，将含有50毫克脂质的脂质溶液转移至蒸发烧瓶中。将烧瓶置于旋转蒸发仪中以蒸发溶剂。当烧瓶底部表面形成一层薄而均匀的脂质膜后，将烧瓶转移至负压真空干燥器中，过夜以彻底去除残留溶剂。第二天早晨，从干燥器中取出烧瓶，检查脂质薄膜。向烧瓶中加入1毫升翻译缓冲液，旋转烧瓶使缓冲液均匀覆盖脂质薄膜。五分钟后，对烧瓶进行超声处理，期间偶尔改变角度，使溶液能够接触整个脂质膜表面。当脂质完全从烧瓶中剥离且脂质体悬浮液变得均匀时，停止超声处理。随后将脂质体悬浮液转移至新的1.5毫升离心管中。在进行体外蛋白质翻译之前，将一管小麦胚芽提取物从-80摄氏度冰箱取出，置于室温水中数分钟，以快速解冻材料。解冻提取物后，立即通过轻柔倒置混匀管内物质。然后离心收集，并将管置于冰上。加入小麦胚提取物 mRNA 和脂质体以制备翻译反应混合物。轻轻倒置或轻弹离心管以混匀管内成分，并在微量离心机中短暂离心。进行小规模体外蛋白质翻译时，从小型透析杯和管中除去水，向管中加入1毫升翻译缓冲液，向杯中加入300微升。取60微升翻译反应混合物。将移液枪吸头插入透析杯的翻译缓冲液中，然后缓慢而轻柔地注入混合物。密度较高的反应混合物会自发沉降至杯底并形成一层。用盖子盖住透析杯以防止蒸发。若要进行大规模翻译反应，向一个25毫升的离心管中加入22毫升翻译缓冲液，并将一个2毫升的透析杯放入该离心管中。向透析杯中加入2毫升翻译缓冲液。取 500 微升翻译反应混合物，缓慢轻柔地将其注入杯中的翻译缓冲液内。在 15 摄氏度下孵育反应 24 小时。次日，用移液器充分混匀透析杯中的反应液，并将粗制蛋白脂质体悬浮液转移至新的离心管中。为了纯化蛋白脂质体，通过离心将粗悬浮液中的蛋白脂质体沉淀。然后用适量的冰预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，洗涤三次。洗涤后，将蛋白脂质体沉淀充分重悬于少量PBS中，并使用微量移液器测定悬浮液的体积。然后加入 PBS 调整悬浮液的体积。将每种悬浮液转移至新的微量离心管中。为进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，向 10 微升每种蛋白脂质体悬浮液中加入 70 微升水和 40 微升 3 倍浓缩的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液。在电泳槽中制备5%至20%的梯度SDS-PAGE凝胶。每孔分别加入2微升蛋白质分子量标记物、3微升、6微升和12微升的各蛋白脂质体样品，以及10微升牛血清白蛋白标准品。加样后进行电泳，随后用考马斯亮蓝染色液对凝胶染色。最后，用热水轻轻振荡脱色，并扫描凝胶图像。按照本方案操作，可在短时间内轻松制备出含有三个或更多跨膜螺旋的多种膜蛋白蛋白脂质体。在此双层透析方法中，可在较长时间内持续向反应混合物的上层和下层供应底物并有效去除副产物，从而实现优异的翻译效率。双层透析法相较于单独使用双层法或透析法，可使产物得率提高4至10倍。通过离心收集合成的蛋白脂质体，并用洗涤缓冲液进行部分纯化，可显著缩短膜蛋白的纯化流程。该无细胞体系易于操作且具有高度可扩展性。该方法还可用于表达利用其他方法难以制备的膜蛋白。对于涉及或靶向膜蛋白的研究与实验，例如抗膜蛋白抗体的制备、SPR、ELISA 和 AlphaScreen 等，该方法具有极高的应用价值。

cell-free-production-proteoliposomes-for-functional-analysis-antibody

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

无细胞生产蛋白脂质体，用于功能分析和靶向膜蛋白的抗体开发

为了检测蛋白质与其靶向脂质的相互作用，我们使用了MACS技术以及与磁珠偶联的Annexin V，并采用靶向脂质和Annexin...

磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（LIMACS）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。...

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

本文介绍了两种将膜蛋白快速重组到融合性蛋白脂质体中的超快方案，以及将此类蛋白脂质体与目标脂双层融合、从而在无去垢剂条件下将这些膜蛋白递送至融合后脂双层的方法。结合使用这两种方法，可实现复杂多组分膜系统的快速且易于控制的组装。...

使用融合性互补电荷蛋白脂质体实现膜蛋白在脂双层中的无去垢剂超快重构。

含有单链两亲性分子（特别是脂肪酸）的脂质体由于单链两亲性分子独特的化学性质，表现出与含有二酰基磷脂的脂质体不同的特性。本文介绍了部分或完全由这些两亲性分子组成的脂质体的制备、纯化及使用方法。...

含脂肪酸脂质体的制备、纯化与应用

本文描述了抗原性脂质体纳米颗粒的制备方法及其在体外和体内刺激B细胞活化的应用。in vitro 和 in vivo...

用于产生疾病特异性抗体的抗原性脂质体

本方案描述了自下而上构建可合成RNA和蛋白质的人工细胞的方法、材料、设备及步骤。人工细胞的内部水相包含S30细菌裂解液，该裂解液通过水包油乳液转移法被封装于脂质双层（即稳定的脂质体）内。...

利用无细胞细菌提取物、脂质体和乳剂转移制备蛋白质合成型人工细胞

本文介绍了一种利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术测定膜蛋白寡聚状态的实验方案。...

用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

共翻译插入预形成的纳米盘中，可实现无变性剂接触条件下，在明确的脂质环境中研究无细胞合成的膜蛋白。本方案描述了关键系统组分的制备方法，以及提高表达效率和样品质量的关键参数。...

膜蛋白共翻译插入预制纳米盘

本方案描述了使用商用的无细胞蛋白表达试剂盒来生产以纳米盘为支撑的膜蛋白，这些膜蛋白可用作亚单位疫苗中的抗原。...

无细胞规模化生产及佐剂添加的Chlamydia muridarum重组主要外膜蛋白用于疫苗开发

本文介绍了使用脂质双层支撑微球逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及利用该系统检测活化T细胞突触输出的方法。...

制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

学习使用小麦无细胞系统高效合成膜蛋白并制备蛋白脂质体，用于功能分析、药物靶点筛选和抗体开发。该方法成功率高，可在短时间内获得高质量蛋白脂质体。

无细胞合成蛋白脂质体用于膜蛋白的功能分析及抗体开发

探索更多视频