无细胞合成蛋白脂质体用于膜蛋白的功能分析及抗体开发

所有膜蛋白都是药物发现中的重要靶点。目前，膜蛋白的大规模生产仍是开展生物化学、生物物理及结构研究的主要瓶颈。该方法可用于在体外高效合成膜蛋白，并在较短时间内以高成功率制备纯化的蛋白脂质体。

加入适当的试剂（包括无细胞表达质粒）以制备转录反应体系后，通过轻柔翻转或轻弹管壁混匀管内物质，并在微型离心机中短暂离心。离心后，将转录反应体系在37摄氏度下孵育六小时，随后进行混匀和再次离心。为制备翻译缓冲液，需用新鲜的超纯水稀释储存液。

对于小规模透析，使用超纯水清洗100微升透析杯，以去除透析膜中的甘油。向一个新的1.5毫升离心管中加入1毫升超纯水，并将小规模透析杯插入管中。然后向透析杯中加入500微升超纯水，在室温下孵育30分钟。

制备脂质体时，将含有50毫克脂质的脂质溶液转移至蒸发烧瓶中。将烧瓶置于旋转蒸发仪中以蒸发溶剂。当烧瓶底部表面形成一层薄而均匀的脂质膜后，将烧瓶转移至负压真空干燥器中，过夜以彻底去除残留溶剂。

第二天早晨，从干燥器中取出烧瓶，检查脂质薄膜。向烧瓶中加入1毫升翻译缓冲液，旋转烧瓶使缓冲液均匀覆盖脂质薄膜。五分钟后，对烧瓶进行超声处理，期间偶尔改变角度，使溶液能够接触整个脂质膜表面。

当脂质完全从烧瓶中剥离且脂质体悬浮液变得均匀时，停止超声处理。随后将脂质体悬浮液转移至新的1.5毫升离心管中。在进行体外蛋白质翻译之前，将一管小麦胚芽提取物从-80摄氏度冰箱取出，置于室温水中数分钟，以快速解冻材料。

解冻提取物后，立即通过轻柔倒置混匀管内物质。然后离心收集，并将管置于冰上。加入小麦胚提取物 mRNA 和脂质体以制备翻译反应混合物。

轻轻倒置或轻弹离心管以混匀管内成分，并在微量离心机中短暂离心。进行小规模体外蛋白质翻译时，从小型透析杯和管中除去水，向管中加入1毫升翻译缓冲液，向杯中加入300微升。取60微升翻译反应混合物。

将移液枪吸头插入透析杯的翻译缓冲液中，然后缓慢而轻柔地注入混合物。密度较高的反应混合物会自发沉降至杯底并形成一层。

用盖子盖住透析杯以防止蒸发。若要进行大规模翻译反应，向一个25毫升的离心管中加入22毫升翻译缓冲液，并将一个2毫升的透析杯放入该离心管中。向透析杯中加入2毫升翻译缓冲液。

取 500 微升翻译反应混合物，缓慢轻柔地将其注入杯中的翻译缓冲液内。在 15 摄氏度下孵育反应 24 小时。次日，用移液器充分混匀透析杯中的反应液，并将粗制蛋白脂质体悬浮液转移至新的离心管中。

为了纯化蛋白脂质体，通过离心将粗悬浮液中的蛋白脂质体沉淀。然后用适量的冰预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，洗涤三次。洗涤后，将蛋白脂质体沉淀充分重悬于少量PBS中，并使用微量移液器测定悬浮液的体积。

然后加入 PBS 调整悬浮液的体积。将每种悬浮液转移至新的微量离心管中。为进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，向 10 微升每种蛋白脂质体悬浮液中加入 70 微升水和 40 微升 3 倍浓缩的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液。

在电泳槽中制备5%至20%的梯度SDS-PAGE凝胶。每孔分别加入2微升蛋白质分子量标记物、3微升、6微升和12微升的各蛋白脂质体样品，以及10微升牛血清白蛋白标准品。加样后进行电泳，随后用考马斯亮蓝染色液对凝胶染色。

最后，用热水轻轻振荡脱色，并扫描凝胶图像。按照本方案操作，可在短时间内轻松制备出含有三个或更多跨膜螺旋的多种膜蛋白蛋白脂质体。在此双层透析方法中，可在较长时间内持续向反应混合物的上层和下层供应底物并有效去除副产物，从而实现优异的翻译效率。

双层透析法相较于单独使用双层法或透析法，可使产物得率提高4至10倍。通过离心收集合成的蛋白脂质体，并用洗涤缓冲液进行部分纯化，可显著缩短膜蛋白的纯化流程。该无细胞体系易于操作且具有高度可扩展性。

该方法还可用于表达利用其他方法难以制备的膜蛋白。对于涉及或靶向膜蛋白的研究与实验，例如抗膜蛋白抗体的制备、SPR、ELISA 和 AlphaScreen 等，该方法具有极高的应用价值。