小鼠骨髓移植操作用于克隆性造血研究

本方案将帮助研究人员理解三种不同骨髓移植方法的生理效应，以及这些方法如何影响克隆性造血研究中的实验结果。全身照射骨髓移植可能对心血管器官产生不利影响，并改变疾病的发病机制。因此，我们实验室开发了两种替代方法，以尽量减少或避免潜在的副作用。

演示实验操作的是来自我实验室的研究生 Eunbee Park 和博士后研究员 Megan Evans。进行胸部和腹部屏蔽时，将可调节托盘和X射线辐照仪放置在适当距离，以实现均匀辐照。将麻醉后的小鼠仰卧于一块平坦的金属板上，并使它们头尾相反地放置。用胶带将小鼠的四肢固定在金属板上，放置铅屏蔽块，使其下端与剑突骨对齐，上端靠近胸腺位置。

屏蔽后，将小鼠放入照射仪中，以两次5.5 Gy剂量的辐射进行照射，两次照射间隔4至24小时。进行头部屏蔽时，小心地用胶带将小鼠的四只脚固定于腹部。将小鼠放入锥形固定器中，并将固定器滑入铅屏蔽装置的槽内，使小鼠的头部和耳朵完全被覆盖，仅暴露身体其余部分以接受辐射。

屏蔽后，将小鼠放入照射器中，以每次5.5 Gy的剂量进行照射，各次照射之间间隔4至24小时。每次放射处理后，将麻醉的小鼠置于铺有加热垫的笼子中，并持续监测直至其完全恢复。为分离骨骼，先用70%乙醇对供体小鼠的皮肤进行消毒，然后在肋骨下方做一小段横向皮肤切口。

紧握切口两侧的皮肤，向头部和足部方向反向撕开，并将皮肤从所有四肢剥离。在肩部和肘关节处剪开，用实验室擦拭纸清除附着在肱骨上的肌肉和结缔组织。小心地使股骨与髋骨之间的关节脱位。

使用钝头剪刀沿股骨头处剪切，以分离腿部。在膝关节处剪开，分离股骨和胫骨。用实验室擦拭纸仔细去除附着在骨骼上的肌肉和结缔组织。

然后将相同基因型小鼠的骨骼取出，分别放入含有20毫升冰上预冷的无菌PBS的50毫升锥形管中。在生物安全二级柜中分离骨髓细胞时，使用18号针头在无菌500微升微量离心管底部打一个小孔，并将该管放入含有100微升冰上预冷的无菌PBS的单独无菌1.5毫升微量离心管中。

所有试管准备就绪后，移除含有分离骨骼的试管中的 PBS，并将骨骼转移至无菌的 100 毫米细胞培养皿中。使用精细镊子和小型剪刀小心切除每根骨骼两端的骨骺，并将最多六根骨骼放入每支 500 微升的试管中。所有骨骼切割完成后，通过离心法提取骨髓细胞。

如果骨髓内容物已完全移除，骨骼应呈现白色半透明状，并在1.5毫升微量离心管底部形成一个相对较大的红色沉淀。进行骨髓细胞移植时，将分离得到的骨 marrow 细胞悬浮于无血清 RPMI 培养基中，每只待注射小鼠取200微升细胞悬液装入一支0.5毫升胰岛素注射器中。在确认足底反射消失后，缓慢将全部细胞悬液注入每只麻醉受体动物的眶后静脉。

然后将一滴丙帕他卡因滴入小鼠眼睛以缓解疼痛。在密切监测下，让小鼠恢复意识。比较三种骨髓移植预处理方法对供体细胞植入效果的影响。

移植后一个月，通过流式细胞术分析外周血和心脏组织中供体细胞的比例。在此代表性分析中，接受全身照射的受体小鼠外周血中，单核细胞、中性粒细胞和B细胞几乎被完全清除，并被供体骨髓来源细胞的子代细胞所取代。此外，受体心脏内原有的单核细胞和中性粒细胞群体也几乎完全被供体来源的细胞所替代。

在部分屏蔽照射组中，供体来源的心脏免疫细胞替代程度较低。屏蔽区域内的受体小鼠骨髓细胞可能影响了外周血重建水平，使其低于接受全身照射的小鼠。在未进行BMT预处理的组中，移植后四周可在受体小鼠的外周血和心脏中检测到供体来源的细胞。

此外，Tet2 缺陷的供体细胞随时间推移逐渐扩增。相比之下，移植野生型供体细胞的受体小鼠中，供体细胞的克隆扩增极小。这些实验模型的优化将有助于更深入地研究克隆性造血驱动基因在心血管代谢性疾病和癌症等全因死亡相关疾病中的作用。

我们希望本实验方案能够帮助研究人员研究克隆性造血，以探讨其在心血管疾病及其他疾病状态中的作用机制。