Name: 小鼠骨髓移植程序研究克隆造血症 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解三种小鼠骨髓移植方法用于研究克隆造血症的生理效应。本方案展示全身照射、屏蔽照射及无预处理移植技术，帮助研究人员减少心血管副作用并优化实验结果。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院向 K. Walsh（资助号：HL131006、HL138014 和 HL132564）、向 S. Sano（资助号：HL152174）提供的资助，美国心脏协会向 M. A. Evans（资助号：20POST35210098）提供的资助，以及日本心脏基金会向 H. Ogawa 提供的资助。

所有涉及动物实验的操作均已获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 预处理前
<ol>
	<li>在照射前约24小时，将受体小鼠置于添加抗生素的饮水中（5 mM 磺胺甲噁唑，0.86 mM 甲氧苄啶）。此步骤是必要的，以防止感染，因为照射后免疫系统将受到抑制，并需在照射后持续维持2周。此时，应为小鼠补充营养/补水凝胶，以促进进食，并防止照射后体重下降和脱水。</li>
</ol>
<img alt="显示大鼠放置位置、头部屏蔽装置及成像精度距离测量的 MRI 装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61875/61875fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：显示不同预处理装置的图像。（A）使用伽马射线（铯-137）的全身照射 pie-cage 装置：辐射束从照射仪后方沿 y 轴方向射出（水平照射）。（B）使用 X 射线的小鼠笼全身照射装置：将小鼠笼置于反射室内。辐射束从照射仪顶部以锥形射出（垂直照射）。辐射源到笼子的距离为 530 mm。（C）X 射线照射仪中的可调节托盘：该装置用于使用 X 射线进行部分屏蔽照射。辐射束从照射仪顶部以锥形射出（垂直照射）。辐射源到托盘的距离为 373 mm，半径为 250 mm。（D）胸部屏蔽：将麻醉后的小鼠放置在托盘上。小鼠以仰卧位相互倒置放置，四肢完全伸展。铅屏蔽的下端与剑突骨对齐，上端与胸腺对齐。（E）腹部屏蔽：将麻醉后的小鼠按胸部屏蔽装置的方式放置，铅屏蔽的下端与肛门对齐，上端位于膈肌下方。（F）使用伽马射线（铯-137）的头部屏蔽照射装置：将麻醉后小鼠的前爪固定，小鼠置于锥形固定器中。黑色铅屏蔽（已标记）覆盖小鼠头部和耳朵。辐射束从照射仪后方沿 Y 轴方向射出（水平照射）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61875/61875fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 受体小鼠的预处理（可选）
<ol>
	<li>全身照射
	<ol>
		<li>将受体小鼠放入均匀分隔的扇形笼中，或放入反射室内的小鼠笼中，并置于计算好的半径范围内，以确保接受相同的照射剂量；但建议每个扇形笼最多放置8只小鼠，每个小鼠笼最多放置5只小鼠，以保证照射均匀（图1A,B）。</li>
		<li>为实现完全的骨髓清除，需确保受体小鼠接受总剂量为11 Gy的辐射，分两次给予，每次5.5 Gy，两次间隔时间为4–24小时。 
		注：虽然在两次照射之间间隔4小时可获得最佳移植效果，但该间隔可延长至24小时，这在人力和/或照射设备不可用时尤为便利。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>部分屏蔽照射
	<ol>
		<li>通过腹腔注射氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）对受体小鼠进行麻醉。在屏蔽过程中，固定小鼠体位至关重要，以确保照射均匀并有效保护目标器官。</li>
		<li>对于胸部和腹部屏蔽，将X射线照射仪的辐射束垂直对准小鼠（图1C）。
		<ol>
			<li>将麻醉后的小鼠仰卧于平板上，辐射源位于上方并居中。将小鼠背对背倒置放置，四肢完全伸展（图1D,E）。 
			注：本实验所用X射线照射设施允许每次最多两只小鼠置于可实现均匀照射的有效半径范围内。有效半径基于辐射源与托盘之间的距离计算，但可同时照射的动物数量取决于具体的照射仪型号。</li>
			<li>使用胶带将小鼠的脚爪固定在平板上，以确保在照射过程中小鼠保持不动。放置铅屏蔽材料，覆盖需要保护的区域。</li>
			<li>对于胸部屏蔽，通过测量小鼠剑突骨至胸腺的长度，并计算足以抵御辐射源的铅屏蔽厚度，来准备铅屏蔽。放置铅屏蔽时，使其下端与剑突骨对齐，上端则靠近胸腺（图1D）。</li>
			<li>对于腹部屏蔽，通过测量小鼠肛门至膈肌的长度，并计算足以抵御辐射源的铅屏蔽厚度，来准备铅屏蔽。放置铅屏蔽时，使其下端与肛门对齐，上端位于膈肌下方（图1E）。 
			注：在各实验组间保持铅屏蔽定位的一致性，可能有助于减少因小鼠体型差异带来的变异。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于头部屏蔽，将铯照射仪的辐射束水平对准小鼠。
		<ol>
			<li>小心地用胶带将麻醉小鼠的前肢固定于腹部，以确保前肢完全暴露于照射剂量下，不被屏蔽材料遮挡。</li>
			<li>进行头部屏蔽时，将小鼠放入锥形固定器中，该固定器可嵌入铅屏蔽装置内。将小鼠放入锥形固定器后，将其滑入铅屏蔽装置的插槽中（图1F）。铅屏蔽应完全覆盖小鼠头部和耳朵（约3.2 cm），其余身体部分暴露以接受照射。可通过将固定器进一步推入或拉出屏蔽装置，调节其在屏蔽装置内的位置，以适应不同体型的动物。</li>
			<li>将小鼠放入照射仪中，使其身体垂直于辐射源进行照射。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对小鼠进行两次5.5 Gy的照射（总剂量为11 Gy），两次照射间隔时间为4–24小时。</li>
		<li>每次照射后，将装有麻醉小鼠的笼子置于加热垫上或红色加热灯下，以防止低体温并促进麻醉恢复。 
		注：使用加热灯时必须注意避免麻醉小鼠过热，因其无法自主逃离热源。如上所述，动物的摆放位置及铅屏蔽的厚度可能因照射仪的具体特性（如辐射类型、射束方向等）而在不同研究中有所差异。研究人员需根据实际情况调整实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 骨组织分离
注意：供体小鼠与受体小鼠的年龄应尽量相近，且在8至12周龄之间。建议使用至少3只小鼠作为细胞供体（而非单只小鼠），以尽量减少个体间异质性（即使使用相同基因型的小鼠）。一只小鼠的六块骨骼（两根股骨、两根胫骨和两根肱骨）可获得约4000万个未分选的骨髓细胞。通常，向每只受体小鼠移植500万个骨髓细胞即可确保成功植入。
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死供体小鼠（首选方法，以避免细胞受到化学物质污染），并将每只小鼠放置于吸水垫上。</li>
	<li>使用70%乙醇喷雾对皮肤进行消毒。</li>
	<li>在肋骨下方的皮肤上做一个小的横向切口，用手紧握切口两侧的皮肤，向头部和足部方向反向撕开。将四肢的皮肤全部剥离。</li>
	<li>在肩部和肘关节处剪开，借助Kimwipe纸去除附着的肌肉和结缔组织，以获取肱骨。</li>
	<li>小心地脱位股骨与髋骨之间的髋关节。使用钝头剪刀沿股骨头剪开，分离下肢。在膝关节处剪开，分离股骨和胫骨，并借助Kimwipe纸小心去除附着的肌肉和结缔组织，以收获股骨和胫骨。 
	注意：此步骤中需特别注意保持骨骺完整。任何因破损而导致无菌性丧失的骨骼应予以丢弃。除股骨、胫骨和肱骨外，还可收集髋骨和脊柱骨。如需收集脊柱骨，可使用研钵和研杵将骨骼压碎成小块，以收获骨髓细胞。</li>
	<li>将相同基因型小鼠的分离骨骼放入相应标记的50 mL锥形管中，每管加入20 mL预冷的无菌PBS，并置于冰上保存，待后续使用。需特别注意将骨骼正确放入对应基因型的管中。</li>
	<li>对每只供体动物重复上述步骤，每处理一只小鼠后更换手套，并使用70%乙醇清洁剪刀及其他器械。</li>
</ol>
4. 骨髓细胞分离
注意：以下步骤需在生物安全二级柜中进行。
<ol>
	<li>准备离心管套装：使用18 G针头在无菌0.5 mL微量离心管底部打一个小孔，然后将其放入含有100 μL冰上预冷的无菌PBS的无菌1.5 mL微量离心管中。 
	注意：由于仅能将六根骨骼放入0.5 mL微量离心管中，建议准备足够数量的管套装，以便同时处理所有骨骼。</li>
	<li>吸除PBS，并将分离得到的骨骼转移至无菌100 mm细胞培养皿中。用精细镊子夹住每根骨骼，使用经高压灭菌的小剪刀小心剪去两端的骨骺，然后将剪好的骨骼放入已准备好的管套装中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以10,000 × g离心35秒。</li>
	<li>离心后，确认骨髓已成功从骨骼中脱离。骨骼应呈现白色且半透明，1.5 mL微量离心管底部应有相对较大的红色沉淀物。弃去0.5 mL微量离心管。 
	注意：若肉眼检查未在1.5 mL管底部观察到骨髓，则需再次剪切骨骼并重复步骤4.3。</li>
	<li>用1 mL冰上预冷的PBS重悬骨髓，然后将相同基因型的细胞悬液转移至对应的50 mL锥形管中。</li>
	<li>使用10 mL注射器连接18 G针头，将细胞悬液反复吹打10次以解离细胞。</li>
	<li>通过70 μm细胞筛过滤单细胞悬液。加入额外的冰上预冷PBS至终体积为10 mL，并使用移液器辅助轻柔重悬细胞。</li>
	<li>在4 °C条件下，以310 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用10 mL无血清RPMI培养基重悬细胞沉淀。保留30 μL用于细胞计数。</li>
	<li>使用细胞计数仪测定细胞浓度，并计算移植所需的细胞悬液体积。以100% BMT为例，每只受体小鼠需要5 × 106个骨髓细胞。 
	注意：对于竞争性BMT，需准备总共5 × 106个骨髓细胞，包含供体细胞（例如CD45.2+）和竞争细胞（例如CD45.1+）的混合物。强烈建议多准备部分骨髓细胞。例如，若每实验组有10只受体小鼠，通常应准备足够用于12只受体小鼠的细胞量。</li>
	<li>将计算好的细胞悬液体积转移至新的50 mL锥形管中。在4 °C条件下，以310 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用计算好的体积的无血清RPMI培养基重悬细胞，以达到适当的细胞密度和体积。通常，200 μL为经眶后注射的最佳体积。</li>
</ol>
5. 将骨髓细胞移植到经辐照的小鼠体内
<ol>
	<li>用 5% 异氟烷麻醉受体小鼠。</li>
	<li>在小鼠麻醉期间，使用胰岛素注射器和 28–30 G 针头，将 200 μL 骨髓细胞缓慢注射至眶后静脉。
	<ol>
		<li>或者，可通过尾静脉静脉注射和股骨髓内注射方式递送供体细胞，最大体积分别为 0.2 mL 和 25 μL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞注射完成后，在眼球表面滴加一滴含丙帕卡因的眼药水以缓解疼痛。随后可让动物恢复意识。</li>
</ol>
6. 非预处理小鼠的骨髓细胞移植
<ol>
	<li>通过吸入5%异氟烷对受体小鼠进行麻醉。</li>
	<li>使用28–30 G胰岛素注射器，将5 × 106个未分选的骨髓细胞从任一基因型小鼠经眶后途径注射至未经辐照的受体小鼠体内。</li>
	<li>连续3天重复步骤6.1和6.2，使受体小鼠总共接受1.5 × 107个骨髓细胞的移植。 
	注意：由于在无预处理条件下进行的过继性骨髓移植需要连续3天实施骨髓细胞注射，每次注射应交替使用不同眼睛。</li>
	<li>注射后，向受影响的眼睛滴加一滴含有丙帕卡因的眼药水。</li>
</ol>

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<li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li>
<li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在克隆性造血研究中，我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、部分屏蔽照射骨髓移植，以及一种较少使用的无需预处理的骨髓移植方法（过继性BMT）。这些方法已被用于评估克隆性造血对心血管疾病的影响。研究人员可根据其研究的具体目的对这些方法进行相应修改。
克隆性造血模型 
克隆性造血是指突变的造血细胞与野生型细胞竞争，并随时间推移获得克隆优势的现象。为了建立这种竞争的模型，可将含有遗传背景不同细胞混合物的骨髓移植给小鼠。通常，该混合物包含经荧光标记或不同全白细胞标记物（如 CD45.1 和 CD45.2）标记的突变型细胞和野生型细胞。例如，在构建模拟 Tet2 介导的克隆性造血（CH）的模型时，我们对致死剂量辐照的受体小鼠进行竞争性骨髓移植，通常将来自 CD45.1 Tet2+/+ 供体的 90% 细胞与来自 CD45.2 Tet2-/-、Tet2+/-...

克隆性造血（clonal hematopoiesis, CH）是一种在老年人群中常见的状态，由携带遗传突变的造血干细胞和祖细胞（HSPC）克隆扩增所致1。研究表明，到50岁时，大多数个体的每个HSPC中平均已积累五个外显子突变2，但这些突变中的大多数对个体几乎不产生或仅产生轻微的表型影响。然而，如果某个突变偶然赋予HSPC竞争优势——例如促进其增殖、自我更新、存活能力，或上述能力的某种组合——则可能导致该突变克隆相对于其他HSPC优先扩增。随着突变的HSPC不断生成成熟的血细胞，该突变将在造血系统中持续扩散，从而在外周血中形成一个独特的突变细胞群体。尽管已有数十个候选驱动基因的突变被发现与造血系统中的克隆事件相关，其中以DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）和十一个易位2（TET2）基因的突变最为常见3。多项流行病学研究发现，携带这些遗传突变的个体患心血管疾病（CVD）、中风以及全因死亡的风险显著升高3,4,5,6,7。尽管这些研究已证实CH与心血管疾病及中风发生率升高之间存在关联，但我们尚不清楚这种关系是因果性的，还是与衰老过程共存的表象。为了更深入理解这一关联，需要建立能够准确模拟人类CH状态的合适动物模型。
我们课题组及其他研究团队已利用斑马鱼、小鼠和非人灵长类动物建立了多种克隆性造血（CH）动物模型8,9,10,11,12,13,14。这些模型通常采用通过移植基因修饰细胞实现的造血重建方法，有时结合Cre-lox重组系统或CRISPR系统。该策略可针对造血细胞中的特定基因突变进行分析，以评估其在疾病发生中的作用。此外，这些模型常使用同源品系细胞或报告细胞，以区分突变细胞与正常细胞或野生型细胞的效应。在多数情况下，需采用预处理方案以成功植入供体造血干细胞。
目前，将骨髓移植至受体小鼠的方法主要分为两类：1）清髓性预处理和2）非预处理移植。清髓性预处理可通过两种方法实现，即全身照射（TBI）或化疗15。TBI通过给予受体致死剂量的γ射线或X射线照射，导致快速分裂细胞内的DNA断裂或交联，使其无法修复16。白消安和环磷酰胺是两种常用的化疗药物，可破坏造血微环境，并同样引起快速分裂细胞的DNA损伤。清髓性预处理的最终结果是造血细胞发生凋亡，从而摧毁受体的造血系统。该策略不仅有助于供体造血干细胞和祖细胞（HSPC）的成功植入，还可通过抑制受体免疫系统防止移植物排斥。然而，清髓性预处理存在严重副作用，包括对组织器官及其驻留免疫细胞的损伤，以及对原有骨髓微环境的破坏17。因此，已有研究提出替代方法以克服这些不良影响，尤其是在保护目标器官方面。这些方法包括对受体小鼠进行局部屏蔽照射以及向未经预处理的小鼠进行过继性骨髓移植（BMT）9,17。通过铅板屏蔽胸部、腹腔、头部或其他区域，可使特定组织免受辐射损伤，并维持其驻留免疫细胞群体。另一方面，向未经预处理小鼠进行HSPC的过继性BMT还具有额外优势，即能够保留原有的造血微环境。在本论文中，我们描述了在小鼠中采用多种移植方案后HSPC植入的实验流程与结果，具体包括将HSPC移植至接受TBI处理的小鼠、接受部分屏蔽照射的小鼠以及未经预处理的小鼠。总体目标是帮助研究人员理解每种方法的不同生理效应，以及它们在克隆性造血（CH）和心血管疾病研究背景下对实验结果的影响。

<table><tbody><tr><td>0.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>1/2 cc 低剂量胰岛素注射器</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>无水乙醇（200 proof）</td><td>Fisher chemical</td><td>200559</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>BD 1 ml 结核菌素注射器，25G，5/8 英寸针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头，18G（1.22 mm × 25 mm）</td><td>Becton Dickinson</td><td>395195</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>铯-137 照射仪</td><td>J. L. Shepherd&amp;nbsp;</td><td>Mark IV</td><td>设备</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm 经组织培养处理的细胞培养皿</td><td>Life Sciences</td><td>353003</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>Fisherbrand 70 &amp;mu;m 无菌细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>Isothesia（异氟烷）溶液</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>溶液</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Zoetis</td><td>043-304</td><td>注射剂</td></tr><tr><td>Kimwipes 精密擦拭纸</td><td>Kimtech Science</td><td>KCC34155</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4（1X）</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>溶液</td></tr><tr><td>RadDisk &amp;ndash; 啮齿类动物照射盘</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>常规耗材</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（1X）</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>培养基</td></tr><tr><td>磺胺甲噁唑和甲氧苄啶</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td>注射剂</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td>注射剂</td></tr><tr><td>X 射线照射仪</td><td>Rad source</td><td>RS-2000</td><td>设备</td></tr></tbody></table>

小鼠骨髓移植操作用于克隆性造血研究

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

克隆性造血是一种常见的与年龄相关的状态，由造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的累积所致。驱动基因的突变可赋予细胞适应性优势，导致HSPC克隆扩增，并持续产生携带该体细胞突变的子代白细胞。由于克隆性造血已被证实与心脏病、中风及死亡率相关，因此建立能够模拟这些过程的实验体系，对于理解这一新型风险因素背后的机制至关重要。在小鼠中，常采用涉及骨髓清除性预处理的骨髓移植技术（例如全身照射，TBI）来研究免疫细胞在心血管疾病中的作用。然而，此类方法不可避免地会对骨髓微环境以及其他关注部位（如心脏和大脑）造成同时损伤。因此，本实验室开发了两种替代方法，以尽量减少或避免TBI可能引起的副作用：1）加用辐射屏蔽的骨髓移植；2）向未经预处理的小鼠进行过继性骨髓移植（adoptive BMT）。在加用屏蔽的器官中，局部微环境得以保留，从而可在不影响组织驻留免疫细胞功能的前提下分析克隆性造血。相比之下，向未经预处理小鼠进行的过继性骨髓移植还具有额外优势，即不仅器官的局部环境，而且造血微环境均得以完整保留。本文中，我们比较了三种不同的造血细胞重建方法，并讨论其在心血管疾病中研究克隆性造血时的优势与局限性。

为了比较三种BMT/预处理方法对供体细胞植入效果的影响，通过流式细胞术分析了移植后1个月外周血和心脏组织中供体细胞的比例。分离的细胞经特异性白细胞标记物染色，以鉴定不同亚群的白细胞。在这些实验中，野生型（野生型 C57BL/6（CD45.2）供体骨髓细胞被输注至 WT B6.SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ（CD45.1）受体小鼠以区分供体细胞与受体细胞。所用流式细胞术设门策略此前由Wang等描述。9 在 补充图1.
接受全身照射（TBI）处理的组别在两次间隔4小时、每次5.5 Gy的总致死性辐射剂量（合计11 Gy）后，接受了5 × 106个骨髓细胞。在受体小鼠的外周血中，单核细胞、中性粒细胞和B细胞几乎完全被清除，并被供体骨髓来源细胞的子代细胞所取代。此外，受体小鼠心脏中驻留的单核细胞和中性粒细胞群体也几乎完全被供体来...

我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、屏蔽照射骨髓移植以及无预处理的骨髓移植方法（过继性BMT），用于小鼠模型中克隆性造血的研究。

克隆性造血是一种常见的与年龄相关的疾病，由造血干细胞和祖细胞中体细胞突变的累积所致……

本方案将帮助研究人员理解三种不同骨髓移植方法的生理效应，以及这些方法如何影响克隆性造血研究中的实验结果。全身照射骨髓移植可能对心血管器官产生不利影响，并改变疾病的发病机制。因此，我们实验室开发了两种替代方法，以尽量减少或避免潜在的副作用。演示实验操作的是来自我实验室的研究生 Eunbee Park 和博士后研究员 Megan Evans。进行胸部和腹部屏蔽时，将可调节托盘和X射线辐照仪放置在适当距离，以实现均匀辐照。将麻醉后的小鼠仰卧于一块平坦的金属板上，并使它们头尾相反地放置。用胶带将小鼠的四肢固定在金属板上，放置铅屏蔽块，使其下端与剑突骨对齐，上端靠近胸腺位置。屏蔽后，将小鼠放入照射仪中，以两次5.5 Gy剂量的辐射进行照射，两次照射间隔4至24小时。进行头部屏蔽时，小心地用胶带将小鼠的四只脚固定于腹部。将小鼠放入锥形固定器中，并将固定器滑入铅屏蔽装置的槽内，使小鼠的头部和耳朵完全被覆盖，仅暴露身体其余部分以接受辐射。屏蔽后，将小鼠放入照射器中，以每次5.5 Gy的剂量进行照射，各次照射之间间隔4至24小时。每次放射处理后，将麻醉的小鼠置于铺有加热垫的笼子中，并持续监测直至其完全恢复。为分离骨骼，先用70%乙醇对供体小鼠的皮肤进行消毒，然后在肋骨下方做一小段横向皮肤切口。紧握切口两侧的皮肤，向头部和足部方向反向撕开，并将皮肤从所有四肢剥离。在肩部和肘关节处剪开，用实验室擦拭纸清除附着在肱骨上的肌肉和结缔组织。小心地使股骨与髋骨之间的关节脱位。使用钝头剪刀沿股骨头处剪切，以分离腿部。在膝关节处剪开，分离股骨和胫骨。用实验室擦拭纸仔细去除附着在骨骼上的肌肉和结缔组织。然后将相同基因型小鼠的骨骼取出，分别放入含有20毫升冰上预冷的无菌PBS的50毫升锥形管中。在生物安全二级柜中分离骨髓细胞时，使用18号针头在无菌500微升微量离心管底部打一个小孔，并将该管放入含有100微升冰上预冷的无菌PBS的单独无菌1.5毫升微量离心管中。所有试管准备就绪后，移除含有分离骨骼的试管中的 PBS，并将骨骼转移至无菌的 100 毫米细胞培养皿中。使用精细镊子和小型剪刀小心切除每根骨骼两端的骨骺，并将最多六根骨骼放入每支 500 微升的试管中。所有骨骼切割完成后，通过离心法提取骨髓细胞。如果骨髓内容物已完全移除，骨骼应呈现白色半透明状，并在1.5毫升微量离心管底部形成一个相对较大的红色沉淀。进行骨髓细胞移植时，将分离得到的骨 marrow 细胞悬浮于无血清 RPMI 培养基中，每只待注射小鼠取200微升细胞悬液装入一支0.5毫升胰岛素注射器中。在确认足底反射消失后，缓慢将全部细胞悬液注入每只麻醉受体动物的眶后静脉。然后将一滴丙帕他卡因滴入小鼠眼睛以缓解疼痛。在密切监测下，让小鼠恢复意识。比较三种骨髓移植预处理方法对供体细胞植入效果的影响。移植后一个月，通过流式细胞术分析外周血和心脏组织中供体细胞的比例。在此代表性分析中，接受全身照射的受体小鼠外周血中，单核细胞、中性粒细胞和B细胞几乎被完全清除，并被供体骨髓来源细胞的子代细胞所取代。此外，受体心脏内原有的单核细胞和中性粒细胞群体也几乎完全被供体来源的细胞所替代。在部分屏蔽照射组中，供体来源的心脏免疫细胞替代程度较低。屏蔽区域内的受体小鼠骨髓细胞可能影响了外周血重建水平，使其低于接受全身照射的小鼠。在未进行BMT预处理的组中，移植后四周可在受体小鼠的外周血和心脏中检测到供体来源的细胞。此外，Tet2 缺陷的供体细胞随时间推移逐渐扩增。相比之下，移植野生型供体细胞的受体小鼠中，供体细胞的克隆扩增极小。这些实验模型的优化将有助于更深入地研究克隆性造血驱动基因在心血管代谢性疾病和癌症等全因死亡相关疾病中的作用。我们希望本实验方案能够帮助研究人员研究克隆性造血，以探讨其在心血管疾病及其他疾病状态中的作用机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠骨髓移植程序研究克隆造血症

本视频展示了如何利用同种异体造血干细胞和可诱导移植物抗宿主病（GvHD）的脾源性异反应性T淋巴细胞，在经致死剂量照射的受体小鼠中诱导肠道移植物抗宿主病。该实验方案有助于建立严重的急性肠道GvHD模型，以深入理解该疾病的发病机制，并开发创新的治疗策略。...

通过同种异体骨髓与脾细胞移植在小鼠模型中诱导移植物抗宿主病

本方案描述了一种无需处死小鼠即可进行股骨骨髓（BM）连续取样的操作流程。该方法可支持对小鼠骨髓组成进行长期的纵向研究，并能够连续获取骨髓内的细胞，用于离体（ex...

活体小鼠股骨骨髓穿刺

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

我们描述了一种通过白消安预处理使受体小鼠的骨髓被普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠骨髓细胞所替代的实验方案，该方法无需进行照射。该技术可用于研究骨髓细胞在中枢神经系统中的聚集情况。...

白消安作为骨髓抑制剂在小鼠中建立稳定高水平骨髓嵌合体

通过颅骨的活体荧光显微镜（IVFM）结合遗传性动物模型，用于研究造血细胞归巢并植入骨髓（BM）微环境的过程。...

结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

本方案提供了建立竞争性小鼠骨髓移植实验的逐步指南，用于研究造血干细胞/祖细胞功能，而无需通过细胞分选对干细胞进行预先纯化。...

竞争性移植评估造血干细胞适应性

本文描述了建立转导-移植小鼠模型所使用的方法学。详细阐述了进行骨髓移植时应避免的技术性错误。读者应清楚理解高病毒滴度、转染/转导以及照射的重要性。...

骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。...

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

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利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

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