利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

该方案结合了利用诱导性多能干细胞生成人类心血管细胞类型的技术优势，以及一种多功能方法，可在不到72小时内生成跳动的心脏类球体。这些心脏类球体可用于疾病建模和药物测试。这种简便技术的主要优势之一是，可在标准的12孔板中生成近1000个跳动的心脏类球体。

最重要的是，可使用基于成像的技术对每一个心肌球进行收缩功能检测。在微波炉中融化琼脂糖后，将其放入生物安全柜中，静置冷却三分钟。用移液器吸取700 µL熔融琼脂糖，小心地加入至9×9阵列的硅胶微模具中，注意避免产生气泡。

将模具小心地放置在预冷的冰块上，以加快琼脂糖凝固。待琼脂糖变为半透明后，小心弯曲微模具的边缘，使琼脂糖复制品松动，并从四周轻轻剥离，将其从硅胶微模具上分离。将含有81个圆形凹孔的琼脂糖微组织培养板转移至无菌的12孔板中，然后向琼脂糖微组织培养板中加入2 mL PBS，并在显微镜下检查是否存在滞留气泡或形状不规则的孔穴。

将琼脂糖凝胶板浸入2 mL 70%乙醇中过夜，随后在生物安全柜中进行紫外线照射处理1小时。移除70%乙醇，用蒸馏水洗涤两次，再用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。胰酶消化并中和后，对诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞进行计数，随后将细胞悬液置于冰上。

在新的离心管中，混合诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞。随后，在不接触凹槽的情况下，从孔板和细胞接种室中移除 PBS，并逐滴加入 200 微升细胞悬液。将细胞置于 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中静置 2 小时，使其沉降。

在琼脂糖模具周围加入微组织制备培养基，以覆盖内腔表面。24小时后，观察圆形凹陷处是否形成自组装且致密的球状体。每两天更换一次培养基，以维持球状体的生长。

通常在48小时后，可观察到类球体的自发性搏动。将各类细胞分别培养于基底膜基质培养基或明胶包被的腔室载玻片上。轻柔地将心脏微组织从圆形凹槽中冲洗出来，并收集至15毫升离心管中。

吸去培养基，并用一毫升 PBS 清洗细胞或微组织。然后用含有 4.2% PFA 的固定液固定细胞或微组织，并在室温下孵育。吸去 PFA 溶液，加入一毫升透化溶液孵育细胞或微组织。

然后，吸除溶液，并用 2 至 3 毫升 PBS 洗涤。向细胞中加入 500 至 1000 微升封闭液，对于腔室载玻片至少孵育 1 小时，对于微组织则孵育 3 至 4 小时。将样本在封闭液中与偶联抗体一起孵育，腔室载玻片孵育 1 小时，心脏微组织则在 4 摄氏度下孵育过夜。

用500微升0.1% Tween 20洗涤腔室载玻片三次，每次间隔5分钟，然后用PBS进行最后一次洗涤。用2毫升0.1% Tween 20洗涤心脏微组织五次，每次间隔20分钟，然后额外再进行一次20分钟的最终洗涤。

在共聚焦显微镜观察前，用 DAPI 孵育细胞或微组织，然后小心地将心肌微组织转移至 35 毫米玻璃底培养皿中，并加入 PBS 浸没微组织。使用宽口或 1 毫升移液器吸头将微组织从圆形凹槽中用培养基冲洗出来，转移至 15 毫升离心管中，静置使其沉降。随后，吸除上清液，并用 1 毫升 PBS 洗涤。

加入 200 至 300 微升酶消化缓冲液，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。然后轻轻吹打微组织 1 分钟，并重复孵育步骤。孵育结束后，使用常规的 1 毫升移液枪头剧烈吹打微组织，将其消化为单细胞。

获得混浊的细胞悬液后，立即加入含有5%胎牛血清（FBS）的5毫升培养基进行中和。将细胞悬液通过40微米细胞筛过滤，并计数总细胞数量。在4°C条件下，以300 × g离心5分钟，对单细胞悬液进行离心处理。

吸弃上清液，将细胞重悬于含有FITC标记的Annexin V和碘化丙啶（propidium iodide）或TO-PRO-3死细胞排除染料的Annexin结合缓冲液中，冰上孵育10分钟。孵育结束后，向细胞悬液中加入300 µL Annexin结合缓冲液，转移至圆底FACS管中，用于流式细胞术分析。通过相差显微镜观察经纯化的人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞。

不同细胞类型的纯度通过免疫染色和流式细胞术确定。肌钙蛋白T用作心肌细胞的标志物，纯度超过90%。血小板内皮细胞黏附分子CD31和波形蛋白分别用作内皮细胞和心脏成纤维细胞的标志物，其指示的纯度分别超过98%和96%。

免疫荧光染色显示，心肌细胞体积最大，主要位于微组织的中心区域，而内皮细胞则分散分布于整个微组织中，心脏成纤维细胞则主要占据微组织的周边区域。使用该方案一步消化法结合Liberase TL酶消化微组织，可在体外培养两周后获得高存活率的细胞，且凋亡细胞较少。心脏微组织暴露于高浓度阿霉素一小时即可诱导出剂量依赖性的心脏毒性。

微组织的收缩性以及向量运动生成了伪热图，用以展示微组织整体的平均收缩特征。心肌微组织的收缩运动产生了正向峰，分别测量为收缩速度、舒张速度以及搏动频率，其中搏动频率通过两个收缩周期之间的时间计算得出。心肌微组织的收缩功能在体外培养的四周内保持稳定。

细胞加热是本实验方案中最重要的步骤之一，必须注意将细胞悬液逐滴加入琼脂糖阵列中，以确保细胞在微孔中均匀分布，并防止溢出。采用这些微组织的优化辐射方案后，可将其用于高通量测序技术，例如单细胞RNA测序（single cell RNA-seq）或单细胞ATAC测序（single cell ATAC-seq），以研究不同处理条件下所导致的细胞特异性基因表达模式。