火虫 Thermobia domestica 中的卵显微注射与高效交配用于基因组编辑

由于家石蛾（Thermobia domestica）是一种基部昆虫，对该物种进行遗传学研究将有助于揭示昆虫关键创新特征演化背后的机制，例如主动飞行和变态发育。本实验方案涵盖了从种群维持到卵显微注射的基本技术，以建立家石蛾作为实验室模式物种的研究体系。该方法还可用于其他遗传学工具的应用，如RNI介导的基因敲低以及家石蛾的转基因技术。

将野生型和突变型种群饲养在较大的塑料容器中，定期投喂人工鱼食，容器内放置带顶部通气孔的塑料杯盛水，提供折叠的纸片供昆虫藏匿，并铺设多层棉层用于产卵。所有T. domestica培养物均置于37摄氏度的培养箱中，并将每个容器内的相对湿度维持在60%至80%。为准备卵收集种群，将约20只雄性与20只雌性成虫转移至中等大小的容器中，容器内需提供食物、水源、一张折叠纸以及一小块多层棉层用于产卵。建立多个种群以在短时间内获得大量分期明确的胚胎。

注射当天，将容器内的棉絮更换为新的棉絮。八小时后，用镊子分开棉层，从分层的棉絮中收集卵。使用湿润的画笔将卵排列在双面胶带上，卵与卵之间保持两毫米的距离。

所有卵子应调整方向，使卵子的长轴朝向注射侧。注射过程中，用画笔轻轻按压卵子以确保牢固固定。使用微量移液器将两微升的gRNA CAS9溶液吸入玻璃注射毛细管中。

注射前确保溶液中无气泡。如有必要，轻弹针头以去除气泡。用镊子轻微折断针尖以优化其形状，防止堵塞，并在一系列注射过程中获得更好的耐用性。

将针头插入卵的长轴中点，注入少量溶液。根据针尖形状，在注射过程中调整电子显微注射仪的设置。将注射后的卵置于适当大小的容器中，在37摄氏度、相对湿度为60%至80%的条件下培养。

定期检查注射后的卵，丢弃受损的卵以防止真菌生长。如果卵表面真菌生长过多，用70%乙醇清洁卵表面。孵化前，将带有注射卵的载玻片浸入滑石粉中，使双面胶表面均匀覆盖一层滑石粉。

这将防止孵化的若虫堆积。将涂有粉末的玻片转移至一个中等大小的容器中，容器内放置食物、水和一张折叠的纸。使用吸管器或画笔将G1代若虫分离至24孔板中。

持续提供人工常规鱼类饲料。将24孔板放入带有水源的较大容器中，以维持60%至80%的湿度。使用镊子夹住若虫或成虫的尾须并轻轻拉取，将其收集到含有50微升乙醇的0.2毫升离心管中。收集的样品应于-20摄氏度长期保存。

将样本管敞口置于70摄氏度的加热块上15分钟，以蒸发乙醇。在产卵后八小时内向胚胎注射gRNA-CAS9核糖核蛋白复合物，可在gRNA靶向位点产生插入或缺失（indels）。这会导致注射世代的部分细胞发生双等位基因突变，通常获得嵌合型突变表型。

当使用该方案注射靶向 white 基因的 gRNA 时，32.6% 的 G0 代若虫在复眼和背部区域表现出部分色素缺失。通过基因组 PCR 结合异源双链迁移率分析，对 G0 代成虫的生殖系转化及 G1 代突变个体进行评估。在 G1 代样本中，野生型与突变型样本之间的条带模式差异清晰可辨。

在衣鱼中进行基因组编辑为分析昆虫早期性状背后的遗传机制提供了一种可靠的方法。这有助于揭示它们取得巨大成功以及我们自身成功背后的奥秘。