卵子微弹射和有效交配的基因组编辑在火布拉特 热比亚家
October 20th, 2020
我们为卵子的饲养、微喷射和在基因组编辑后生成和维持突变菌株的火布拉特 热比亚家用菌 株的有效交配提供了详细的协议。
因为 Thermobia domestica 是一种基底昆虫，所以对该物种的遗传研究将阐明昆虫关键创新进化的潜在机制，例如动力飞行和。该协议涵盖了从培养维持到鸡蛋显微注射的基本技术，以将 Thermobia 作为实验室模型物种实施。该方法还可用于其他遗传工具的应用，例如 RNI 介导的基因敲低和热成像中的转基因。
将野生型和突变种群维持在一个大塑料容器中，里面装有普通的人造鱼食，水装在顶部有通风孔的塑料杯中，用折叠纸藏住昆虫，用分层棉花产卵。将所有 T.domestica 培养物保存在 37 摄氏度的培养箱中，并将每个容器内的相对湿度设置为 60% 至 80%为了准备卵收集菌落，将大约 20 只雄性和 20 只雌性成虫转移到一个中等大小的容器中，里面装有食物、供水、折叠纸和一小块分层棉花用于产卵。建立多个菌落，在短时间内获得大量分期胚胎。
注射当天，用新棉花更换容器内的棉花。八小时后，通过使用镊子分离分层棉花，从分层棉花中收集鸡蛋。使用湿油漆刷将鸡蛋对准双面胶带，鸡蛋之间保持 2 毫米的距离。
所有鸡蛋的方向都应使鸡蛋的纵轴面向注射侧。在注射过程中，用画笔轻轻按压鸡蛋，以便牢牢握住。使用微量加载器将 2 μL gRNA CAS9 溶液加载到玻璃注射毛细管中。
注射前确保溶液中没有气泡。如有必要，轻敲针头以去除气泡。用镊子稍微折断针尖，以防止堵塞，并在一系列注射过程中获得更好的耐用性，从而优化针尖的形状。
将针头插入鸡蛋纵轴的中点，并注入少量溶液。在注射过程中，根据针尖的形状调整电子微量注射器的配置。将注射的鸡蛋保存在适当大小的容器中，相对湿度为 60% 至 80%，温度为 37 摄氏度。
定期检查注射的鸡蛋并丢弃受损的鸡蛋，以避免真菌生长。如果鸡蛋上生长了过多的真菌，请用 70% 乙醇清洁鸡蛋表面。孵化前，将载玻片与注射的鸡蛋浸入滑石粉中，以涂在双面胶带的表面。
这将防止孵化的若虫堆叠。将粉末涂层载玻片转移到装有食物、水和折叠纸的中型容器中。用吸气器或画笔将 G1 若虫分离到 24 孔板中。
维持人工常规鱼食的供应。将 24 孔板放入一个较大的容器中，该容器有湿度为 60% 至 80% 的供水 使用镊子从若虫或成虫身上捏出一个尾部，然后将它们收集到含有 50 微升乙醇的 0.2 毫升管中。将收集的样品储存在零下 20 摄氏度下进行长期储存。
将打开盖子的样品管放在 70 摄氏度的加热块上 15 分钟，以蒸发乙醇。在产卵后的前 8 小时内在胚胎中注射 gRNA CAS9 核糖核蛋白复合物会导致 gRNA 靶向位点出现插入缺失。这会导致注射一代的一些细胞出现双等位基因突变，并且通常会获得突变的嵌合表型。
当该方案用于注射旨在靶向白色基因的 gRNA 时，32.6% 的 G0 若虫在其复眼和背侧区域表现出部分色素沉着丧失。通过基因组 PCR 评估 G0 成体和突变 G1 个体的种系转化，然后进行异源双链迁移率测定。在 G1 样品中，野生型样品和突变型样品之间的差异带模式可以清楚地区分。
Thermobia 中的基因组编辑为分析昆虫早熟性状的遗传机制提供了一种可靠的方法。它有助于探索他们和我们取得巨大成功背后的秘密。
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概述
本文介绍了一种全面的协议，用于养殖和微注射火蚁Thermobia domestica的卵，通过基因组编辑促进突变株的生成和维护。所概述的方法将增强Thermobia作为遗传学研究实验室模型物种的应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 昆虫生物学
- 实验室协议
背景
- Thermobia domestica是一种基础昆虫物种。
- 对这个物种的遗传学研究可以揭示昆虫进化的见解。
- 昆虫的关键创新包括有力飞行和变态。
- 该协议支持在Thermobia中应用遗传工具。
研究目的
- 将Thermobia domestica建立为遗传研究的模型生物。
- 提供卵微注射的详细方法。
- 促进野生型和突变种群的维护。
所用方法
- 在大型塑料容器中维持培养。
- 卵的微注射用于基因组编辑。
- 定期喂食人工鱼食。
- 设置环境条件为37°C和60-80%湿度。
主要结果
- 成功建立卵收集的繁殖群。
- 高效生成研究用的分期胚胎。
- 维持野生型和突变株。
- 应用遗传工具进行进一步研究。
结论
- Thermobia domestica是遗传学研究的一个有前景的模型。
- 所概述的协议增强了遗传操作的可行性。
- 未来的研究可以利用这些方法获得进化见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Genome editing in Thermobia domestica enables functional genetic interrogation in a basal insect model, supporting evolutionary and developmental biology pipelines. The protocol's robust microinjection and colony management steps facilitate reproducible generation of mutant strains, expanding the toolkit for non-traditional model systems. This capability strengthens early discovery and target validation for insect biology and comparative genomics portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of gene function in a basal insect lineage.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene-phenotype relationships.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of evolutionary innovations.
- Provides a platform for functional target validation in non-model organisms.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized protocols for embryo microinjection and mutant generation.
- Delivers reproducible, quantitative phenotypic outputs for downstream analysis.
- Prepares validated biological systems for genetic screening workflows.
- Enables scalable colony management for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with comparative studies of gene function across insect taxa.
- Supports continuity from genetic manipulation to phenotypic assessment.
- Provides a foundation for translational biomarker discovery in evolutionary contexts.
- De-risks preclinical model selection by expanding available genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early genetic manipulation to phenotypic screening and comparative analysis in insect models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in a basal insect system.
- Screening: Provides reproducible mutant phenotypes for assay development and validation.
- Analytics: Supports quantitative assessment of gene editing outcomes via PCR and mobility assays.
- Translational Research: Facilitates cross-species genetic comparisons relevant to evolutionary biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other non-traditional insect models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function studies and evolutionary hypotheses.
- Operational Value: Standardizes microinjection and colony management for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions in comparative genomics and model selection.
- Portfolio Impact: Expands the range of genetically tractable insect models for R&D prioritization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and insect colony management.
- Needs access to controlled incubators and humidity regulation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible mutant generation.
- Adaptation may be necessary for other insect species with differing biology.
- Limitations include species-specific handling and environmental requirements.
