人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

该方案能够以高通量方式检测细胞电生理特性，适用于快速发展的诱导性多能干细胞来源心肌细胞技术。该技术的主要优势在于，与传统的膜片钳技术相比，其操作更简便、劳动强度更低，同时仍能获得相当的实验结果。因此，该方案可拓展用于基于人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的大规模毒性筛选项目。

例如，全面的体外致心律失常评估。为准备用于实验的诱导性多能干细胞来源的心肌细胞培养物，首先在24孔板的每个孔中，将150微升1:60的基底膜基质加入直径10毫米的圆形玻璃盖玻片（编号0）上进行包被，并将盖玻片在4°C条件下孵育4小时。孵育结束后，去除盖玻片上多余的基质，并向每张盖玻片加入适量体积的细胞悬液。

在37摄氏度下孵育一小时后，小心地用铺板培养基填充每个孔，并将培养板放回培养箱中。为进行电压敏感染料成像，需配备一台倒置落射荧光显微镜，搭配40倍高数值孔径物镜，并将一个快速切换的暖白光LED连接至透射照明端口。在透射光路中插入一个简单的红色660纳米滤光片，并安装一个用于光度记录的快速切换470纳米LED光源头。

在落射荧光端口插入470/40激发滤光片，以净化LED产生的光线，并在显微镜的镜组转盘内插入含有495纳米长通分光镜的显微镜滤光立方体。在C接口端口安装带有可调视场光阑的检测臂，以便选择感兴趣区域，并将PMT探测器和USB相机连接至显微镜。在PMT端口插入包含565纳米长通分光镜和535/50发射滤光片的滤光立方体，以将发射光在两个探测器之间分光。

将光电倍增管（PMT）连接至电源和PMT放大器，并将PMT放大器的输出端连接至数据采集系统的模拟输入端口。为满足奈奎斯特采样定理并防止混叠，应对来自PMT的模拟信号在1千赫兹或更高频率下进行滤波，并以至少为模拟信号中最高频率两倍的频率对信号进行数字化。为使细胞负载电压敏感性染料，取5微升1000倍稀释的FluoVolt与50微升Power Load溶液混合，将所得染色工作液3微升加入盛有3毫升预温Tyrode溶液的培养皿中。

将一个由诱导多能干细胞分化而来的心肌细胞包被的盖玻片加入培养皿中，并将培养皿置于37摄氏度环境中孵育20分钟。将加热的活细胞成像室安装到显微镜载物台上，并向室内加入500微升新鲜的台氏液。随后用37摄氏度的新鲜台氏液洗涤盖玻片，并使用尖头镊子小心地将盖玻片转移至预热的浴槽室中。

为了标准化细胞动力学和实验参数，将两个铂电极插入腔室中，电极间距为五毫米，并将电极连接至外部刺激器。将刺激器设置为5毫秒的双相场脉冲，频率为0.5赫兹，从1伏开始逐渐增加刺激强度，直至细胞开始收缩。随后将电压设定为略高于此阈值约25%的水平。

进行光学动作电位采集时，使用透射光路和USB相机在明场条件下观察心肌细胞。选择一个孤立的细胞，并调节视场光阑以紧密裁剪其光路，确保仅监测来自目标细胞的光信号。启动光电倍增管（PMT）放大器，并将PMT电源电压设置为750伏。

运行刺激程序的同时启动采集软件，并同步激活470纳米激发光。记录10次扫描，确保检测到稳定的动作电位。最后一次扫描结束后，立即在继续记录的同时移动显微镜载物台，短暂采集无细胞区域的背景信号，随后关闭激发光。

为了分析动作电位数据，使用相应的分析软件打开已保存的记录文件，并对单个细胞中包含刺激诱发动作电位的10次扫描信号进行平均。从平均信号中减去代表荧光偏移的基线信号均值，然后使用公式计算荧光变化，其中以舒张期荧光作为F0。确定舒张期和动作电位的关注区域，测量所需的心脏动作电位参数，包括但不限于50%和90%复极化时程。随后将该单个细胞的数据导出至电子表格程序中。

该方法可实现对复极化力学的快速且精确的定量分析，从而为细胞离子异常提供有价值的见解。在小鼠心肌细胞的光学信号中可观察到显著的1相特征，其形态与人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞明显不同。此外，人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞对硝苯地平（一种已知的L型钙通道拮抗剂）的药理学干预具有响应性。

在持续给药过程中，观察到动作电位复极化90%时的时程缩短了41.5%，表明基于荧光电压探针成像的技术可作为前瞻性高通量心脏药物筛选研究的有效平台。需要注意的是，尽管本研究中使用的电压敏感染料相比其他染料细胞毒性较低，但仍应尽量减少激发光的使用，以维持细胞活性。本实验方案所采用的调制光度测量设备具有极高的通用性。

例如，它可用于同时测量其他电生理参数，如细胞内钙离子浓度。