Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

该协议可以以适合快速发展的诱导多能干细胞衍生心肌细胞技术的方式提供细胞电生理学的高通量测量。这种技术的主要优点是它比传统的膜片钳技术更简单、劳动强度更低，但它能够产生相同的结果。因此，该方案可以扩展到使用人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的大规模毒性筛选计划。

例如，全面的体外致心律失常测定。为了制备用于实验的诱导多能干细胞衍生的心肌细胞培养物，首先在 24 孔板的每个孔内用 150 微升 1：60 基底膜基质包被单独的 10 毫米圆形玻璃零号盖玻片，并将盖玻片在 4 摄氏度下孵育 4 小时。孵育结束时，从盖玻片中取出多余的基质，并将适当体积的细胞涂在每个盖玻片上。

在 37 摄氏度下放置 1 小时后，小心地用铺板培养基填充每个孔，然后将板放回培养箱中。为了准备电压敏感染料成像，为倒置落射荧光显微镜配备 40 倍放大倍率高数值孔径镜头，并将快速切换的暖白光 LED 耦合到透射照明端口。将一个简单的红色 660 纳米滤光片插入透射光路，并安装一个快速切换的 470 纳米 LED 灯头，用于亮度测量记录。

在落射荧光端口插入 470/40 激发滤光片以清除 LED 产生的光，并将包含 495 纳米长通分束器的显微镜立方体插入显微镜内的反射镜单元转盘中。将包含可调节视场光阑的检测臂安装到 C 安装端口，以便选择感兴趣区域，并将 PMT 检测器和 USB 相机耦合到显微镜上。将包含 565 纳米长通分束器和 535/50 发射滤光片的滤光片立方体插入 PMT 端口，以在两个探测器之间分配发射光。

将 PMT 耦合到电源和 PMT 放大器，并将 PMT 放大器输出连接到数据采集系统的模拟输入引脚。为了满足奈奎斯特标准并防止混叠，请以 1 kHz 或更高的频率过滤来自 PMT 的模拟数据，并以至少是模拟信号中存在的最高频率的两倍的频率对数据进行数字化。要用电压敏感染料加载细胞，请将 5 微升 1000x FluoVolt 和 50 微升电力负载溶液混合，并将 3 微升所得负载溶液添加到培养皿中 3 毫升加热的 Tyrode 溶液中。

向培养皿中加入单个诱导多能干细胞来源的心肌细胞包被盖玻片，并将培养皿置于 37 摄氏度下 20 分钟。将加热的活细胞成像室安装到显微镜载物台上，并在腔室中加入 500 微升新鲜的 Tyrode 溶液。然后用新鲜的 Tyrode 溶液在 37 摄氏度下清洗盖玻片，并使用细尖镊子小心地将盖玻片转移到预热的浴池中。

为了标准化细胞动力学和实验参数，将两个铂电极插入腔室，间隔 5 毫米，并将电极连接到外部刺激器。将刺激器设置为 0.5 赫兹的 5 毫秒双极场脉冲，并将刺激从 1 伏特增加到 1 伏特，直到细胞开始收缩。然后将电压设置为高于此阈值的大约 25%。

对于光学动作电位采集，使用透射光路和 USB 相机在明场条件下可视化肌细胞。选择一个孤立的比色皿，并使用视场光阑紧密裁剪其光路，确保仅监测来自感兴趣比色皿的光。激活 PMT 放大器，并将 PMT 电源设置为 750 伏。

运行刺激协议和采集软件，同时激活 470 纳米激发光。记录 10 次扫描，确保检测到稳定的动作电位。最后一次扫描后，立即移动显微镜载物台，同时仍然记录，以从没有细胞的区域短暂获取背景信号并关闭激发光。

要分析动作电位数据，请在适当的分析软件中打开保存的记录，并平均 10 次扫描，其中包含来自单个细胞的刺激动作电位。从平均迹线中减去代表荧光偏移的基线信号的平均值，然后使用公式计算荧光的变化，使用舒张荧光作为 F 0 。确定感兴趣的舒张期和动作电位区域，并测量所需的心脏动作电位参数，包括但不限于 50% 和 90% 复极化的持续时间。然后将此单个单元格中的数据导出到电子表格程序。

这种方法允许快速、精确地量化复极化机制，这可以为细胞离子异常提供有价值的见解。在来自小鼠心肌细胞的光学信号中可以观察到明显的第一阶段特征，这些信号在形态上与人类诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞不同。此外，人诱导的多能干细胞来源的心肌细胞对硝苯地平（一种已知的 L 型钙通道拮抗剂）的药理学作有反应。

在连续药物应用过程中，观察到 90% 复极化时动作电位持续时间减少 41.5%，表明基于荧光电压指示剂的成像作为前瞻性高通量心脏药物筛选研究平台的功能。重要的是要记住，尽管本研究中使用的电压敏感染料比其他染料的细胞毒性小，但仍应谨慎使用激发光以保持细胞活力。该协议中使用的调制光度测量设备用途广泛。

例如，它可用于同时测量其他电生理参数，例如细胞内钙。