Name: 通过物候监测、手授粉、荧光显微镜和分子基因分型确定日本李子的授粉要求 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 了解日本李子的授粉要求，结合田间物候监测、手授粉、荧光显微镜观察花粉管生长以及PCR分子基因分型技术。该方法适用于其他自交不亲和果树品种的研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由西班牙国家农业与食品技术研究所（Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria，项目编号：RFP2015-00015-00 和 RTA2017-00003-00）、阿拉贡自治区政府—欧洲社会基金、欧盟（Grupo Consolidado A12-17R）、埃斯特雷马杜拉自治区政府—欧洲区域发展基金（FEDER）、地区研究计划（IB16181）以及研究小组项目（AGA001，GR18196）资助。B.I. Guerrero 获得墨西哥国家科学技术理事会（Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México，CONACYT，编号 471839）奖学金的支持。

1. 田间人工授粉
<ol>
	<li>花粉提取
	<ol>
		<li>为获得花粉，需在D期采集花蕾24，依据BBCH标度的57期25,26. 
		注意：日本李所需的花芽数量比其他植物更多 李属 因为它们的花药产生的花粉较少。</li>
		<li>使用塑料网筛（孔径2 mm × 2 mm）去除花药，并将其置于室温下的纸面上放置24小时，直至花药开裂。</li>
		<li>将花粉粒通过细网筛（孔径0.26 mm × 0.26 mm）筛分，并置于带盖的10 mL玻璃管中，4 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去雄花朵的授粉
	<ol>
		<li>当10%–20%的花朵开放时，选择并标记若干枝条。去除已开放的花朵和幼小花蕾，仅保留D期的花蕾24，依据BBCH标度的第57阶段25,26.</li>
		<li>用指甲或镊子去除每个处理组800至1,000个花蕾的花瓣、花萼和雄蕊。</li>
		<li>去雄后24小时，使用细小的画笔对雌蕊进行人工授粉。部分枝条上的一半雌蕊用同一品种的花粉授粉，另一半则用来自其他品种的相容性花粉作为对照。注意避免手指或画笔被其他品种的花粉污染。</li>
		<li>记录每周的开花数量和发育中果实的数量，以表征不同授粉处理下的落果模式，并量化最终的坐果率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>田间补充授粉
	<ol>
		<li>在第一朵花开放前数天，将选定的树木用孔径0.8 mm的网罩封闭，以防止传粉昆虫进入。</li>
		<li>当10%–20%的花朵开放时，为每种授粉处理选择并标记若干枝条，每种处理保留1,000–1,500朵花。</li>
		<li>第二天，当花朵开放时，借助画笔将相应的花粉授到每朵花上（自花授粉使用同一品种的花粉，异花授粉对照则使用其他相容品种的花粉）。</li>
		<li>每隔一天授粉一次，直至所有花朵开放。</li>
		<li>记录从开花到收获期间每周的花朵和发育中果实的数量，以表征不同授粉处理下的落果模式，并量化最终的坐果率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验室中的人工授粉
<ol>
	<li>根据BBCH标度的第57阶段24，采集50–100朵处于D阶段的花25,26。</li>
	<li>在实验室中，对每种处理（自花授粉和异花授粉）去雄30朵花。 
	注意：去雄操作应小心进行，避免对雌蕊造成任何损伤。</li>
	<li>在将每朵花的花梗基部放入湿的花艺泡沫前，需在水下对其做新鲜切口（每种授粉处理使用一块独立的泡沫）。</li>
	<li>24小时后，使用之前收集的花粉（见第1.1节），用细小的画笔对每个雌蕊进行人工授粉。一组雌蕊用同一品种的花粉授粉，另一组则用兼容品种的花粉作为对照。</li>
	<li>授粉后将授粉的雌蕊在室温下放置72小时。花艺泡沫应持续保持湿润。</li>
	<li>在4 °C条件下，用乙醇/乙酸（3:1）固定液固定雌蕊至少24小时。随后将固定液更换为75%乙醇。样品可在此溶液中于4 °C保存至使用前27。 
	注意：确保样品完全浸没在溶液中。</li>
</ol>
3. 显微观察
<ol>
	<li>体外花粉萌发评价
	<ol>
		<li>配制花粉萌发培养基：将25 g蔗糖溶解于250 mL蒸馏水中，然后加入0.075 g硝酸钙[Ca(NO3)2]和0.075 g硼酸（H3BO3）。</li>
		<li>向溶液中加入2 g琼脂，搅拌至完全溶解28。</li>
		<li>将培养基在120 °C下高压灭菌20 min。冷却培养基，在凝固前于无菌超净工作台中将每份3 mL分装至无菌培养皿（55 mm × 12 mm）中。培养基凝固后，用铝箔包裹培养皿，于4 °C保存备用。</li>
		<li>将先前在人工控制授粉中作为花粉供体的各品种花粉分别接种于两个培养皿中，于25 °C培养24 h。 
		注意：接种后的培养基可立即进行显微观察，或保存于-20 °C备用。若需冷冻保存，应在显微观察前24 h将培养皿从冷冻箱转移至冰箱中解冻。</li>
		<li>为观察花粉粒，配制1%（v/v）的苯胺蓝溶液用于胼胝质染色。首先，将7.97 g三碱基磷酸钾（K3PO4）溶于1,000 mL蒸馏水中，配制0.1 N的K3PO4溶液。再将1 mL苯胺蓝溶于100 mL 0.1 N K3PO4溶液中，配制成1%（v/v）苯胺蓝溶液。</li>
		<li>向每个培养皿中加入2–3滴苯胺蓝溶液，染色5 min后，在紫外落射荧光显微镜下使用激发滤光片BP340-390和阻断滤光片LP425进行观察。对每个品种的两个培养皿，每皿选取三个视野，每个视野计数100–200个花粉粒，统计可育与不可育花粉粒数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>花粉管生长观察
	<ol>
		<li>用蒸馏水冲洗固定后的雌蕊三次，每次1 h，共3 h，然后转移至4 °C、5%（w/v）的亚硫酸钠（Na2SO3）溶液中浸泡24 h。该溶液的配制方法为：将5 g亚硫酸钠溶于100 mL蒸馏水中。</li>
		<li>在5%（w/v）亚硫酸钠溶液中，将雌蕊于120 °C高压灭菌8 min，以软化组织。</li>
		<li>将软化后的雌蕊置于载玻片上的一滴1%（v/v）苯胺蓝溶液中，加盖盖玻片并轻压，使组织展开，以染色胼胝质。</li>
		<li>在显微镜下使用紫外落射荧光，配合激发滤光片BP340-390和阻断滤光片LP425，观察花粉管在花柱中的生长情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 确定不相容关系
<ol>
	<li>从叶片中提取 DNA
	<ol>
		<li>为提取 DNA，建议在春季于田间采集每种栽培品种的 3–4 片幼嫩叶片。 
		注意：也可从成熟叶片中提取 DNA，但幼嫩叶片中的 DNA 含有的酚类化合物较少。</li>
		<li>使用商业试剂盒提取 DNA，并按照试剂盒提供的操作说明进行（参见材料表）。</li>
		<li>使用紫外-可见微量分光光度计在 260 nm 处测定各样本 DNA 的浓度并评估其质量。将 DNA 浓度调整至 10 ng/μL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增片段的 PCR 条件
	<ol>
		<li>标记 0.2 mL 的 PCR 管及管盖。</li>
		<li>根据表 1准备 PCR 试剂，并将其置于冰上融化。</li>
		<li>根据反应数再额外增加 10% 的量，在 1.5 mL 微量离心管中配制每对引物的主混合液（master mix），每反应体积为 16 μL。按照表 1中的顺序加入试剂，并充分混匀。</li>
		<li>将 16 μL 主混合液分装至各 0.2 mL PCR 管中，每管中已含有 4 μL DNA 模板或 4 μL 灭菌去离子水作为阴性对照（C-）。使用已知基因型的栽培品种 DNA 作为阳性对照。轻轻混匀后盖紧管盖，于 2,000 x g 离心 30 秒，使全部液体沉降至反应管底部。</li>
		<li>将反应管放入热循环仪中，设置以下温度程序进行 PCR 扩增：94 °C 预变性 3 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 1 分钟、56 °C 退火 1 分钟、72 °C 延伸 3 分钟；最后 72 °C 延伸 7 分钟20。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电泳及片段大小估算
	<ol>
		<li>制备 1.7%（w/v）琼脂糖微型凝胶：将 0.68 g 琼脂糖和 40 mL 1x TBE 缓冲液加入 100 mL 锥形瓶中，使用微波炉以 600 W 功率、每 30 秒间隔加热，直至完全溶解，避免剧烈沸腾。</li>
		<li>将溶液置于实验台上冷却，随后加入 3.5 μL 核酸染色液。</li>
		<li>将凝胶托盘放入制胶架中，并插入选定的梳子。确保有足够的加样孔用于加载所有 PCR 产物和 DNA 标准分子量标记。</li>
		<li>将琼脂糖溶液倒入制胶模具中，静置冷却至完全凝固。移除梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，并加入足量 1x TBE 缓冲液，使液面刚好覆盖凝胶表面。</li>
		<li>在第一孔和最后一孔中各加入 2 μL DNA 分子量标准（1 kb DNA Ladder），其余孔中每孔加入 3 μL PCR 扩增产物。关闭电泳装置，接通电源，以 100 V 恒压电泳 30 分钟。</li>
		<li>使用凝胶成像系统在紫外光下观察凝胶结果。利用 DNA 分子量标准判断扩增片段的大小，并与阳性对照比较，以确定对应的等位基因。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 监测开花日期
<ol>
	<li>在不同年份监测各品种不同植株在开花期间的物候特征。根据最初（约5%）到最晚（约95%）开放的花朵确定开花期的持续时间。根据BBCH标度第65阶段25,26，当至少50%的花朵处于F阶段24时，视为盛花期。</li>
	<li>为比较可相互授粉品种的开花日期并确定每年开花时间重叠的品种，利用多年数据编制开花时间日历。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的日本李栽培品种授粉需求研究方法，需通过田间或实验室控制授粉来确定各栽培品种的自交（不）亲和性，并利用荧光显微镜观察花粉管的生长情况。通过分子基因分型对S-等位基因进行表征，从而建立不亲和性关系。最后，通过监测物候期，筛选每年开花期相吻合的栽培品种，以完成授粉品种的选择。
由于新培育的日本李类型品种数量众多，且大多数品种的授粉需求未知并表现为自交不亲和性，因此明确这些新品种的授粉需求正变得愈发重要3。本文所述的方法结合了物候期监测、人工控制授粉、荧光显微镜观察以及分子基因分型技术，已被证实可用于有效确定品种的授粉需求14。
日本李的杂交种具有一些特殊性，这使得无法像其他Prunus物种那样采用单一方法来确定其授粉需求。首先，其花朵较小且更为脆弱3。花粉的提取与处理方法与其他Prunus spp.<sup class="xre...

日本李（Prunus salicina 林德（Lindl.）原产于中国1. 在19th 20世纪，该作物从日本引入美国，在美国与其它北美二倍体李子进行了杂交2. 在20th 世纪，其中一些杂交种被传播到世界各地的温带地区。如今，“日本李”这一术语指的是由原始种间杂交产生的一系列种间杂交种 P. salicina 包含另外多达15个二倍体 李属 种（spp.）3,4,5.
梅（日本李）与其他蔷薇科（Rosaceae）物种一样，表现出配子体型自交不亲和性（GSI），该特性由一个单一位点、高度多态的 S-位点控制，该位点包含多个等位基因6。该 S-位点包含两个基因，分别编码在雌蕊中表达的核糖核酸酶（S-RNase）和在花粉粒中表达的F-box蛋白（SFB）7。在自交不亲和反应中，当花粉粒（单倍体）所表达的 S-等位基因与雌蕊（二倍体）所表达的两个等位基因之一相同时，花粉管在花柱中的生长会受到抑制，原因是 S-RNase 作用导致花粉管RNA降解8。由于这一过程阻止了胚珠中雌配子体的受精，GSI促进了不同品种间的异花授粉。
尽管一些日本李子品种是自交亲和的，但目前种植的大多数品种为自交不亲和，需要来自相互亲和的授粉品种的花粉来完成授粉受精3在核果类植物的李属中 李属 例如杏仁9，杏10,11,12 和甜樱桃13，可通过不同方法确定品种的授粉需求。自交（不）亲和性可通过田间花朵的自花授粉并随后监测坐果情况来确定，或在实验室受控条件下进行半体外自花授粉，并在显微镜下观察花粉管生长情况14,15,16,17,18通过在田间或实验室中利用潜在授粉品种的花粉进行异花授粉，并结合对不亲和性关系的鉴定，可确定品种间的不亲和性关系。 S通过PCR分析鉴定各栽培品种的等位基因14,15,16,19,20,21,22在甜樱桃或杏等物种中，也可通过鉴定特定的 S 与自交亲和性相关的等位基因，如 S4’ 在甜樱桃中13 或 Sf 在杏仁中23.
主要生产国的多个李子育种项目已推出大量新品种2,14，其中许多品种的授粉需求尚不明确。本研究描述了一种用于确定日本李类型杂交种授粉需求的方法。通过在田间和实验室条件下进行自花授粉，并结合荧光显微镜下对花粉管生长的观察，来判定其自交（不）亲和性。授粉品种的选择则结合了通过PCR分析鉴定S-基因型与田间开花期监测的结果。

<table><tbody><tr><td>冰乙酸</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>苯胺蓝</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>硼酸 (H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>四水合硝酸钙 (Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>数码相机软件套件</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA 寡核苷酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合液，每种 10 mM</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA 聚合酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>96&amp;deg;乙醇</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>1Kb DNA 标准分子量标记（美国专利号 4.403.036）(500bp-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>大小：250&amp;micro;g；浓度：1.0 &amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>手动计数器</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab 软件</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>凝胶成像系统的图像分析系统</td></tr><tr><td>MetaPhor 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>5415 R 微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>带紫外落射荧光的显微镜</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>激发滤光片 BP340-390，阻断滤光片 LP425</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>小型电泳系统</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>磷酸三钾 (K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;1.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>正向引物 'Pru C2'</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正向引物 Pru T2'</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反向引物 'PCER'</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe 核酸染色液</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>无水亚硫酸钠 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Speedtools 植物DNA提取试剂盒</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE 缓冲液 (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler T100</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>垂直高压灭菌器 Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

通过物候监测、人工授粉、荧光显微镜观察及分子基因分型建立日本李的授粉需求

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

常见的日本李栽培品种是由原产的Prunus salicina与其他Prunus物种杂交获得的种间杂种。大多数杂种表现出配子体型自交不亲和性，该特性由一个单一位点、高度多态性的S-位点控制，该位点包含多个等位基因。大多数栽培杂种具有自交不亲和性，需要来自亲和授粉品种的花粉来完成其花朵的受精。由于大量新品种的授粉需求尚未明确，确定日本李的授粉要求正变得日益重要。本文描述了一种用于确定日本李类型杂种授粉需求的方法体系。通过在田间和实验室条件下进行人工授粉，随后利用荧光显微镜观察花粉管伸长情况，并结合田间果实成熟情况的监测，来判定其自交（不）亲和性。通过结合PCR分析鉴定S-基因型以及田间开花期的观测，评估授粉品种的选择。了解品种的授粉需求有助于在新建果园时合理选配品种，并可在已有果园中及早发现因授粉不足导致的产量问题。

每个日本李子花芽包含一个由1–3朵花组成的花序。与其他核果类植物一样，每朵花由四个花部轮生结构组成：雌蕊、雄蕊、花瓣和萼片，这些结构在基部融合形成杯状结构。花的结构比其他核果类植物更小，具有短而脆弱的雌蕊，周围环绕着含有少量花粉粒的雄蕊。在开花前，每朵花序的花在短花梗上彼此分离，白色花瓣展开呈气球状，外围被绿色萼片包围（花期D阶段，57 BBCH）（图1A）。开花时花朵完全开放，露出花药和雌蕊（花期F阶段，65 BBCH）（图2A）。与其他温带Prunus spp.类似，花芽先开放，叶芽则在数天后萌发。这使得开花的树木显得极为壮观，满树繁花而无叶片。
日本李的人工授粉需要在花开放前的气球期采集花朵（图1A），此时雌蕊和雄蕊几乎发育成熟，但花药尚未开裂。此阶段可防止携带外来花粉的昆虫进入，因为花瓣仍处于闭合状态。尽管其花朵数量远高于其他Prunus物种，但其中大多数（85...

本文描述了一种用于确定日本李型杂交种授粉需求的方法，该方法结合了田间和实验室授粉，通过荧光显微镜观察花粉管，并利用PCR鉴定S-基因型，同时监测开花情况以筛选授粉品种。

常见的日本李子品种是由原产的李（Prunus salicina）与其他李属（Prunus）物种杂交获得的种间杂交种。

由于大量新的自交不亲和日本李子品种的授粉需求尚未明确，该实验方案正变得日益重要。该技术的主要优势在于，可通过结合田间与实验室条件下的两种互补方法，确定品种的授粉需求。该方法还可应用于其他自交不亲和的果树物种，如杏或甜樱桃，以确定其授粉需求。进行花粉提取时，根据BBCH标度第57阶段采集处于气球期的花蕾。使用塑料筛网去除花药，并将其置于室温下的纸张上24小时，直至花药开裂。通过细筛网过滤花粉粒，并将花粉收集于带盖的10毫米玻璃管中，在4°C条件下保存直至使用。当有10%至20%的花朵开放时，选择并标记若干花枝，每种授粉处理保留1,000至1,500朵花。次日，当更多花朵开放时，使用毛笔对每朵花进行授粉：自花授粉组使用同一品种的花粉，异花授粉对照组则使用其他品种的花粉。此后每天持续授粉，直至所有花朵全部开放。 从开花期到收获期每周记录花朵和发育中果实的数量，以表征不同授粉处理下的落果模式，并量化最终的坐果率。根据BBCH标准的第57阶段，在气球期采集50至100朵花。在实验室中对每种处理的30朵花去雄，用于自花授粉和异花授粉。在水中对每根花梗基部进行新鲜切割，并将其放置于湿润的插花泡沫块上。每种授粉处理使用一块独立的泡沫块。24小时后，用之前收集的花粉和精细的画笔对每个雌蕊进行人工授粉。用同一品种的花粉为一组雌蕊授粉，用另一个可亲和品种的花粉为另一组雌蕊授粉作为对照。将授粉后的雌蕊置于由乙醇和乙酸组成的固定液中，在4°C下固定至少24小时。将此前授粉实验中用作花粉供体的各品种花粉分别撒在两个培养皿中，于25°C下孵育24小时。为观察花粉粒，向每个培养皿中加入两到三滴苯胺蓝溶液，五分钟后在紫外落射荧光显微镜下观察。每个培养皿选取三个视野，每个视野包含约100至200个花粉粒，对两个培养皿中的可育和不可育花粉粒进行计数，每种栽培品种均按此操作。为观察花粉管，将软化的雌蕊置于载玻片上的一滴1%苯胺蓝溶液中，盖上盖玻片并轻轻压片。在显微镜下使用UV落射荧光观察花粉管沿花柱的生长情况，激发滤光片为BP340-390，阻断滤光片为LP425。从田间每种栽培品种采集三到四片幼嫩叶片，并从叶片中提取DNA。在1.5毫升微量离心管中为每对引物配制主混合液。加入所有试剂并充分混匀。取16微升该混合液，分装至每个含有4微升DNA模板或对照的200微升PCR管中。轻轻混匀，盖紧管盖，并在2,000 × g离心30秒。将试管放入PCR仪中，并按照文稿中所述运行PCR程序。为通过凝胶电泳估算片段大小，将DNA Marker加入第一孔和最后一孔，每孔2微升，其余各孔加入3微升PCR产物。关闭电泳槽，以100伏电压电泳30分钟。使用凝胶成像系统在紫外光下观察凝胶。利用DNA Marker估计扩增片段的大小，并与阳性对照和阴性对照进行比较。监测不同年份各品种不同植株的开花物候。从第一朵花开放到最后一朵花开放，确定开花期的持续时间。根据BBCH 65阶段标准，当至少50%的花朵处于F阶段时，视为盛花期。去雄或补充授粉后人工授粉花朵的落果模式显示，大多数花朵在授粉后两周至三周内脱落，但仍有4%的自花授粉花朵保留在树上，表明该品种具有自交亲和性。有活力的花粉粒在培养基中培养24小时后，花粉管长度超过花粉粒本身；而无活力的花粉粒则不萌发。在授粉过程中，花粉粒被转移到柱头上。每个萌发的花粉粒产生一条花粉管，花粉管穿过雌蕊结构生长。在自交不亲和的品种中，花粉管在花柱上三分之一处停止生长。然而，在自交亲和的品种中，花粉管能够穿过花柱，到达子房并使胚珠受精。利用甜樱桃和日本李小RNA（sRNA）保守区域的引物进行PCR分析，可确定每个品种S等位基因的大小。计算了连续四年的开花期长度。通过果园条件下的开花观察，可以确定每年开花时间重叠的品种。在进行本实验方案时，务必使用较多数量的日本李花进行人工授粉，因为其坐果率与其他李属物种相比极低。无法通过分子方法确定自交不亲和性。需要进一步开展S等位基因测序工作，以评估某些S等位基因是否与自交亲和性相关。田间与实验室方法的结合已为新建商业果园的设计提供了有价值的信息，并可应用于其他果树物种。

establishing-pollination-requirements-japanese-plum-phenological

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

通过物候监测、手授粉、荧光显微镜和分子基因分型确定日本李子的授粉要求

我们建立了一种在Setaria viridis（S.

用于禾本科植物新模式系统——Setaria viridis 的杂交实验方法

为了揭示某种植物物种的传粉者有效性，已开发出多种野外实验方法。本研究以红花石蒜（Lycoris sanguinea var. sanguinea）为例，展示了传粉生态学野外实验的基本方法，并介绍了一种新的传粉机制——花蕾破裂传粉（breaking-bud...

传粉生态学的野外实验：以血红石蒜（Lycoris sanguinea var. sanguinea）为例

本文介绍了一种在植物生长室条件下诱导柑橘树开花的实验方案。通过水分胁迫、高光照强度以及模拟春季光周期，可在较短时间内获得具有活性的花朵。该方法使研究人员能够在一年内实现多次开花周期。...

植物工厂条件下柑橘树的诱导开花

我们展示了一种基于精子细胞核形态来判断受精成功或失败的方法 拟南芥...

通过追踪精子核形态评估受精状态 拟南芥 双受精

我们提出一种结合荧光显微镜检测自交（不）亲和性与PCR分析鉴定S基因型的方法，用于确定杏（Prunus armeniaca...

结合人工授粉、显微观察与遗传分析的杏自交与杂交亲和性关系测定

本方案提供了一种快速测定柑橘品种花粉亲和性与不亲和性的方法。...

利用人工授粉、显微观察和S-基因型分析确定柑橘类植物的自交（不）亲和性及种间（不）亲和性关系

在此，我们描述了一种对半体外 (SIV) 法用于观察花粉管导向与接收过程 拟南芥, 这会提高胚珠的接受性。高通量SIV 与隔膜...

活体成像 拟南芥 花粉管接收与半体外双受精实验方法体外室间隔 方法

本文介绍了一种改进的拟南芥（Arabidopsis...

高分辨率单颗粒 体内 花粉水合生物测定法 拟南芥

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

为了研究鸟类胚胎发育后期卵黄囊膜中脂质利用的机制，我们建立了一种日本鹌鹑胚胎内胚层上皮细胞的原代培养体系。...

日本鹌鹑胚胎卵黄囊膜原代内胚层上皮细胞培养

了解日本李子的授粉要求，结合田间物候监测、手授粉、荧光显微镜观察花粉管生长以及PCR分子基因分型技术。该方法适用于其他自交不亲和果树品种的研究。

通过物候监测、人工授粉、荧光显微镜观察及分子基因分型建立日本李的授粉需求

探索更多视频