三维球体模型中癌细胞侵袭的实时荧光成像与分析

本方案可用于实时研究癌细胞侵袭细胞外基质的机制。该技术的主要优势在于使用了一种简单的类球体成像装置，使得类球体侵袭实验更易于建立，并提高了其实验效率和成本效益。尽管我们以乳腺癌的类球体侵袭实验为例进行演示，但该实验模型同样适用于任何实体瘤向周围健康组织侵袭过程的研究。

在打印好间隔层后，将基础聚合物与交联剂按10:1的质量比称取至塑料杯中，使用一次性移液管在杯内充分混合，得到PDMS溶液。将杯子放入真空腔室中，迅速释放真空以去除混合物表面夹带的空气，并消除残留的气泡。将3D打印的间隔层在100摄氏度下孵育5分钟以增加其柔韧性，并用100%异丙醇清洁两块玻璃片。

将垫片放置在两块已清洁的玻璃板之间，使其与板边缘平齐，并在底部边缘放置两个大号长尾夹，顶部角落放置一个，以将模具密封固定在玻璃板的外侧边缘。检查模具顶部，确保垫片与玻璃板表面齐平，使用剪去约两厘米尖端的一次性移液管，缓慢而持续地将PDMS混合物加入模具的左上角。当整个模具完全填充后，将模具放入真空室中，以去除形成的任何气泡，随后在100°C下固化PDMS一小时。

孵育结束后，将模具置于室温下。待其冷却至可触碰时，从含有固化PDMS的垫片上取下夹子和玻璃板，并用刀片沿垫片与玻璃板之间模具四边形成的密封处切割。将模具分开，露出垫片中的PDMS片，并用镊子小心地将PDMS片从垫片上剥离下来。

将膜片置于切割垫上，使用活检打孔器切出一个直径为17.5毫米的PDMS圆片，然后在圆片上均匀分布地打三个直径为5.5毫米的孔。使用胶带去除每个插入片上的灰尘颗粒，并将清洁后的插入片粘附到一段双面胶带上。将胶带缠绕在直径10厘米的培养皿盖上，并将皿盖连同敞口的直径35毫米玻璃底培养皿一起放入等离子处理仪中。

使用等离子体处理仪在 300 毫托下对插入件和玻璃底培养皿进行一分钟活化处理，并用镊子迅速将每个插入件的处理面贴附到经处理的玻璃底培养皿的玻璃部分，每个插入件对应一个培养皿。当所有插入件均贴附完毕后，用拇指和食指在旋转培养皿的同时对每个插入件施加均匀压力，以确保插入件牢固地固定在培养皿上。所有插入件固定完成后，将所得的球状体成像装置在 60 摄氏度下孵育 20 分钟，随后按照演示方法进行第二轮等离子体处理。

第二次处理后，向每个插入孔中加入35 µL新配制的包被溶液。室温孵育1小时后，移除包被溶液，并用蒸馏水将装置清洗三次。最后一次洗涤后，向每个孔中加入35 µL交联溶液，室温孵育30分钟。

孵育结束后，按所示方法用蒸馏水将装置冲洗三次，然后向每个装置中加入70%乙醇，在紫外光下孵育30分钟。灭菌结束后，用蒸馏水将装置冲洗三次，并向每个装置中加入2.5毫升保存液。为将类球体包埋于胶原中，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤装置三次，每次洗涤使用3毫升PBS。

最后一次洗涤后，让装置完全干燥，然后在插入物的一个孔中加入30微升新配制的college one溶液，并放入一个类球体，同时启动计时器。确认类球体位于孔内后，按照示范操作，将类球体加入另外两个孔中。若类球体靠近PDMS边缘，使用10微升移液枪头将其重新居中；如果分配了多个类球体，则将其分开，并停止计时。

接种后，为使类球体在胶原层中垂直居中，需将装置倒置，并在37摄氏度下孵育，直至胶原聚合，在此期间每两分钟将装置方向反转一次，共持续30分钟；随后每装置加入2.5毫升培养基，并在零小时时间点获取类球体的图像。使用类球体成像装置可高效地实现类球体包埋，并对癌细胞在胶原中的侵袭过程进行延时记录，或通过纵向成像进行观察。虽然本实验中该类球体的纵向成像持续六天，需稳定表达细胞质和/或细胞核荧光蛋白，但类似纵向成像也可通过染料标记在较短时间内完成。

类球体也可进行固定和免疫标记。例如，这些类球体经过上皮型钙黏蛋白、cortactin 和 F-actin 的免疫标记。在这些图像中，可观察到使用 Fiji 宏逐步处理图像以随时间测量类球体面积的操作流程图示。

务必确保将单个类球体分配至类球体成像装置的每个孔中，并在 XY 和 Z 方向上均将类球体置于孔的中心位置。通过调整孔的尺寸、插入物以及玻璃底培养皿的排列方式，可轻松修改该装置的设计，以适应更高通量的类球体实验需求。