Name: 3D球形模型中癌细胞入侵的时限解荧光成像和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 了解利用3D打印和PDMS制备的球形成像装置对乳腺肿瘤细胞球体进行纵向荧光成像的方法。该技术可实时监测癌细胞侵袭机制，提高实验效率并降低成本，适用于研究实体瘤侵袭动态。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Temple大学生物工程系成员提供的宝贵讨论。感谢David Ambrose在流式细胞术核心实验室（Lewis Katz医学院）在细胞分选方面的协助，以及Tony Boehm来自IDEAS Hub（Temple大学工程学院）在3D打印方面的帮助。我们还感谢以下资助来源：美国癌症协会研究学者基金134415-RSG-20-034-01-CSM、战胜癌症基金会/青年研究者奖、美国国立卫生研究院R00 CA172360和R01 CA230777项目，以上经费均授予BG。

1. 制备用于优化类球体包埋的类球体成像装置（SID）（耗时1天）
<ol>
	<li>使用3D打印机创建间隔器（图1A、B&#160;以及补充文件1）。</li>
	<li>在塑料杯中称取10:1（质量比）的基础聚合物与交联剂的混合物［例如，20 g的乙基苯基础聚合物和2 g的硅树脂交联剂，用于制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）］。</li>
	<li>使用一次性移液管在塑料杯中充分混合PDMS溶液。</li>
	<li>将塑料杯放入真空室中，以去除混合物中的气泡。迅速释放真空压力，以去除混合物表面残留的少量空气，并消散剩余的气泡。</li>
	<li>将3D打印的间隔器在100 °C下孵育5分钟，以提高其柔韧性。</li>
	<li>用100%异丙醇擦拭两块将用于构建PDMS模具的玻璃板，彻底清洁。如果玻璃板之前曾用于浇铸PDMS，请务必用刀片轻轻刮除残留的旧PDMS，并用100%异丙醇擦拭干净。</li>
	<li>通过将3D打印的间隔器平整地置于两块洁净的玻璃板之间来构建模具。</li>
	<li>使用大型文件夹夹子在玻璃板的外边缘密封模具。在底边放置两个夹子，在顶部角落放置一个夹子。</li>
	<li>检查模具的顶部，确保间隔器与玻璃板齐平。这可保证不会出现变形，并形成厚度均匀的PDMS片。 
	注意：如果最终得到的PDMS片厚度不均，需略微调整夹子的位置。</li>
	<li>剪去一次性移液管的尖端（约距尖端2 cm），然后以缓慢且恒定的速度将PDMS混合物加入模具的左上角。缓慢倾倒混合物，以防止形成大的气穴。</li>
	<li>将模具放入真空室中，以去除倾倒过程中形成的气泡。</li>
	<li>将模具在100 °C下孵育1小时，使PDMS固化。</li>
	<li>从孵育器中取出模具，并让其冷却至可触碰的温度。</li>
	<li>从含有固化PDMS的间隔器上取下夹子和玻璃板。</li>
	<li>使用刀片沿模具四边在间隔器与玻璃板之间形成的密封处切割。四边全部切开后，开始将模具分开，以露出间隔器中的PDMS片。</li>
	<li>使用镊子小心地将新的PDMS片从间隔器上剥离下来。</li>
	<li>在切割垫上，使用不同尺寸的活检打孔器从PDMS片上打出直径为17.5 mm的PDMS圆片，然后在每个圆片上均匀分布地打出三个直径为5.5 mm的孔。此处将这些三孔PDMS圆片称为“插入件”（图1C）。 
	注意：若对PDMS的切割不均匀，或等离子体处理粘合不良，可能导致后续出现泄漏。</li>
	<li>使用胶带轻轻去除每个插入件上的灰尘颗粒，进行清洁。</li>
	<li>将插入件粘贴到一段双面胶带上，并将胶带缠绕在10 cm培养皿的盖子上。</li>
	<li>将培养皿的盖子连同敞口的35 mm玻璃底培养皿一起放入等离子体处理仪中。</li>
	<li>通过等离子体处理1分钟（压力为300 mTorr）激活插入件和玻璃的表面。可使用手持式等离子体探头。</li>
	<li>使用镊子，迅速将一个插入件的上表面（即处理过的面）（图1D）贴附到玻璃底培养皿的玻璃部分（图1E）。对所有培养皿重复此操作。</li>
	<li>用食指和拇指在旋转玻璃底培养皿的同时施加均匀压力。这将确保插入件牢固地固定在玻璃底培养皿上。</li>
	<li>将SIDs（图1F）在60 °C下孵育20分钟，以增强玻璃与PDMS之间的粘附力。</li>
	<li>对SIDs进行第二轮等离子体处理，使用与步骤1.21相同的参数或手持式探头。这将使PDMS的自由表面能够与包被溶液中的聚-L-赖氨酸结合（见1.26）。</li>
	<li>新鲜配制以下溶液：
	<ol>
		<li>包被溶液：含0.01%（体积比）聚-L-赖氨酸的1x PBS溶液［例如，将10 µL的0.1%（体积比）聚-L-赖氨酸加入90 µL的1x PBS中］。</li>
		<li>交联溶液：含1x（体积比）戊二醛的蒸馏水［例如，将10 µL的10x戊二醛加入90 µL蒸馏水中］。</li>
		<li>储存溶液：含10x（体积比）青霉素-链霉素的1x PBS溶液［例如，将1 mL的100x青霉素-链霉素加入9 mL的1x PBS中］。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每个孔中加入35 µL包被溶液，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>吸除聚-L-赖氨酸，并用蒸馏水将整个SID清洗3次。</li>
	<li>每个孔中加入35 µL交联溶液，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>吸除交联溶液，并用蒸馏水将整个SID清洗3次。</li>
	<li>向每个SID中加入70%乙醇，并置于紫外光（UV）下照射30分钟。</li>
	<li>在通风橱中吸除乙醇，并用蒸馏水将SID清洗3次。</li>
	<li>每个SID中加入2.5 mL储存溶液。 
	注意：此时，SIDs可在4 °C下保存一周。观察发现，PDMS与玻璃之间的结合强度会随时间下降。超过一周后，建议在使用前测试SIDs是否存在潜在泄漏。测试方法为：吸除储存溶液，向每个孔中加入35 µL的1x PBS。使用后，可将PDMS插入件从玻璃底培养皿上剥离。为实现玻璃底培养皿的最佳清洁，应使用异丙醇和盐酸进行多次清洗，以去除PDMS残留物。</li>
</ol>
2. 类球体形成及包埋入胶原蛋白（持续时间4天）
注意：若需对类球体进行活体成像（纵向观察或延时视频），请使用表达细胞质和/或细胞核荧光蛋白的细胞系。如有此类细胞系，可按照本节所述步骤操作。或者，也可参考第3节中提出的使用细胞质染料标记类球体中癌细胞的实验方案。
<ol>
	<li>使用悬滴法形成4T1和/或67NR细胞的球状体，具体方法如前所述4,5,6,7，每滴40 µL含3,000个细胞，孵育3天。最后加入牛端胶原蛋白I溶液，并始终将所有溶液置于冰上保存。</li>
	<li>使用明场显微镜鉴定形态正确的球状体。</li>
	<li>在15 mL锥形管中加入8 mL预热的完全培养基。</li>
	<li>用P1000移液器收集球状体并转移至15 mL锥形管中。通过反复吸取完全培养基润洗移液器吸头，以防止球状体黏附在吸头内壁，减少球状体损失。</li>
	<li>让球状体沉降至管底，通过更换培养基小心清洗球状体，重复两次。</li>
	<li>根据制造商推荐的方法配制5 mg/mL I型胶原蛋白溶液（采用替代凝胶化程序，参见下方示例计算）。用完全培养基替代蒸馏水。在计算所需培养基体积时，需考虑后续将加入含20 µL完全培养基的球状体[例如，对于一个SID，所需5 mg/mL I型胶原蛋白溶液为：3 × 30 + (3 × 30) × 20% = 108 µL（额外准备20%以补偿黏稠液体移液过程中的损耗）；即22 µL完全培养基 + 10.8 µL 10x PBS + 1.2 µL 1 M NaOH + 54 µL 10 mg/mL I型胶原蛋白储备液]。</li>
	<li>使用P200移液器将所有球状体收集于20 µL培养基中，并加入第2.6步配制的I型胶原蛋白溶液中。</li>
	<li>通过上下吹打缓慢混匀溶液，避免I型胶原蛋白浓度不均，并尽量减少气泡产生。保持溶液置于冰上。</li>
	<li>从SID中移除保存液，并用3 mL 1x PBS洗涤3次。最后一次洗涤后，让SID保持干燥，以免稀释I型胶原蛋白溶液。</li>
	<li>启动计时器，将含有一个球状体的30 µL I型胶原蛋白溶液分配至SID的三个孔之一。通过肉眼确认30 µL溶液中仅含一个球状体。</li>
	<li>重复第2.10步两次，以填满一个SID的全部三个孔。</li>
	<li>若球状体靠近PDMS边缘，可用10 µL移液器吸头将其重新居中。若某一孔中意外分配了两个或三个球状体，可使用同一吸头将球状体彼此分离。停止计时。 
	注意：在整个I型胶原蛋白聚合与固化过程中，频繁将SID上下翻转，可确保球状体位于细胞外基质（ECM）层的垂直中心位置，并防止细胞进行二维迁移。翻转频率应尽可能高。由于翻转频率由第2.10–2.12步测得的“球状体分配时间”决定，因此应尽量缩短分配时间。在本实验室中，平均分配时间为2分钟。</li>
	<li>为使球状体在胶原层中垂直居中，将SID翻转至倒置状态，并在37 °C孵育分配时间长度。</li>
	<li>将SID翻转回正置状态，并在37 °C孵育相同分配时间长度。 
	注意：球状体处于倒置状态的时间应与处于正置状态的时间相等。</li>
	<li>重复步骤2.13和2.14，持续30分钟，直至I型胶原蛋白完成聚合。</li>
	<li>每SID加入2.5 mL完全培养基，如需可采集球状体初始时间点的图像。</li>
	<li>若使用多个SID，重复步骤2.10–2.16。</li>
</ol>
3. 类球体的荧光标记
<ol>
	<li>活体成像（持续时间 6-7 天） 
	注意：如果可获得表达细胞质和/或核荧光蛋白的细胞系，请遵循第 2 节中描述的步骤。或者，对于细胞质标记，建议采用以下方案。
	<ol>
		<li>按照第 2 节所述方案中的步骤 2.1–2.5 操作。</li>
		<li>将细胞质染料用无血清培养基稀释至 25 µM，总体积为 200 µL。 
		注意：本实验使用红色细胞质染料，但其他可用颜色的染料也应适用。使用核染料对类球体内的癌细胞进行标记时，将核染料用 200 µL 无血清培养基稀释至 20 µM（参见材料表）。</li>
		<li>最后一次洗涤后，将类球体重悬于细胞质或核染料溶液中，在室温下避光孵育 20 分钟。 
		注意：采用此方法，类球体中心区域的细胞标记效率较低。为实现所有细胞的有效标记，可将孵育时间延长至过夜，并将培养皿置于摇床上。其他替代方法见讨论部分。</li>
		<li>用完全培养基洗涤类球体 3 次。</li>
		<li>继续执行第 2 节所述方案中的步骤 2.6–2.17。</li>
		<li>通过每 10 分钟一次的时间序列成像对类球体进行 24–72 小时的动态观察（图 2），或通过纵向成像每日观察一次，持续最长 7 天（图 3）。使用激光扫描共聚焦显微镜，配备 10x 空气物镜（数值孔径 0.4，工作距离 3.1 mm），图像分辨率为 1024 × 1024 像素，曝光时间 8 µs/像素，针孔直径 90 µm，z 轴步进 6 × 15 µm，共采集 3 个视野，每个视野包含一个类球体。 
		注意：进行时间序列成像时，应使用最低激光功率，并确保显微镜配备具有温度、湿度和气体控制功能的环境培养舱。成像前，将包埋的类球体在 37 °C 条件下培养超过 &#62; 8 小时或过夜，以尽量减少在显微镜上的停留时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体的免疫荧光染色（持续时间 2 天） 
	注意：此处描述的实验流程改编并优化自先前发表的方案8,9。该方法可在完成第 2 节及第 3.1 节所述流程后使用。
	<ol>
		<li>新鲜配制以下溶液。
		<ol>
			<li>固定液：含 4% 多聚甲醛（体积比）的 1× PBS 溶液［例如，将 5 mL 的 16%（体积比）多聚甲醛加入 15 mL 的 1× PBS 中］。</li>
			<li>固定与透化液：含 4% 多聚甲醛（体积比）和 0.5% Triton X-100（体积比）的 1× PBS 溶液［例如，向 10 mL 固定液中加入 50 µL Triton X-100］。</li>
			<li>封闭液：含 1% 胎牛血清（FBS，体积比）和 1% 牛血清白蛋白（BSA，质量/体积比）的 1× PBS 溶液［例如，将 100 mg BSA 溶解于 10 mL 1× PBS 中，再加入 100 µL FBS］。</li>
			<li>洗涤液：含 0.05% Tween 20（体积比）的 1× PBS 溶液［例如，向 50 mL 1× PBS 中加入 25 µL Tween 20］。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移除 SID（spheroid-insert device）中的培养基，并用预热的 1× PBS 洗涤一次。</li>
		<li>每个 SID 中加入 2 mL 固定与透化液，在室温下孵育 5 分钟。</li>
		<li>移除固定与透化液，每个 SID 中加入 2 mL 固定液，在室温下孵育 20 分钟。</li>
		<li>用洗涤液洗涤 3 次。</li>
		<li>每个 SID 中加入 2 mL 封闭液，在 4 °C 下轻度振荡孵育 24 小时。 
		注意：此步骤中样品可在 4 °C 下孵育过周末。请注意，过长的封闭时间可能干扰后续免疫荧光标记过程。</li>
		<li>用封闭液稀释一抗。</li>
		<li>在 48 孔板中，每孔加入含一抗的封闭液 150 µL。</li>
		<li>使用精细镊子小心剥离含有类球体的 I 型胶原凝胶块，并转移至孔中。若需标记多个类球体，请重复此操作。在使用不同抗体操作时，应擦拭镊子上残留的液体，以防交叉污染。</li>
		<li>在 4 °C 下轻度振荡孵育过夜。</li>
		<li>向空孔和含样品的孔中各加入 300 µL 洗涤液。</li>
		<li>小心地将含有类球体的 I 型胶原凝胶块转移至“洗涤”孔中。</li>
		<li>在室温下轻度振荡，用洗涤液洗涤 3 次，每次 2 小时。 
		注意：通过转移胶原凝胶块而非抽吸液体的方式进行洗涤，有助于减少样品损失和损伤。</li>
		<li>用封闭液稀释二抗、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和/或鬼笔环肽（phalloidin）。</li>
		<li>每孔加入含二抗、DAPI 和/或鬼笔环肽的封闭液 150 µL。</li>
		<li>使用镊子小心地将含有类球体的胶原凝胶块转移至新孔中。若需标记多个类球体，请重复此操作。</li>
		<li>在室温下轻度振荡孵育 1 小时。</li>
		<li>重复步骤 3.2.11 和 3.2.12。</li>
		<li>在室温下轻度振荡，用洗涤液洗涤 3 次，每次 30 分钟。</li>
		<li>使用刀片将一个带有三个孔的 PDMS 插件切割成三部分，使每部分包含一个孔。</li>
		<li>将两块 PDMS 放置在载玻片上。</li>
		<li>使用剪去尖端的 P200 枪头加入一滴封片剂，避免产生气泡。</li>
		<li>小心地将 I 型胶原凝胶块逐一转移至各孔中。 
		注意：如果类球体位于胶原凝胶块的顶部，应将凝胶块翻转，使类球体更靠近盖玻片。</li>
		<li>盖上盖玻片，并用胶带密封。</li>
		<li>在室温下避光干燥 10 分钟。</li>
		<li>将样品在 4 °C 避光保存，直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像处理以分析随时间推移的癌症侵袭情况
注意：此宏所需的格式为单通道 x,y,t 图像，需保存为 .tiff 文件。
<ol>
	<li>若采集了多个 z 层图像（即 x,y,z,t 图像），在 Fiji 中打开图像并选择 图像 | 堆栈 | Z 投影。建议使用 最大强度 选项。或者，也可使用单个 z 层运行宏。将图像保存为 .tiff 文件。</li>
	<li>在桌面上创建一个独立的“Processing”文件夹。</li>
	<li>选择 文件 | 另存为 | 图像序列。使用 TIFF 格式，根据帧数调整位数，勾选“使用切片标签作为文件名”选项，然后点击 确定。选择第 2 步中创建的“Processing”文件夹。</li>
	<li>从“Processing”文件夹中打开一张图像。该图像应为对应单个时间点的 x,y 图像。</li>
	<li>选择 图像 | 调整 | 自动阈值。 在下拉菜单中选择 全部尝试 方法，并勾选“黑背景上的白色对象”选项。</li>
	<li>将显示一个拼合图像，展示每种自动阈值化方法的结果。</li>
	<li>确定最佳的自动阈值化方法，例如 RenyIEntropy。</li>
	<li>为确认所选的自动阈值化方法，从“Processing”文件夹中打开另一张图像，并使用 图像 | 调整 | 自动阈值 测试选定的阈值化方法。</li>
	<li>关闭所有图像。</li>
	<li>下载 SpheroidAreaTime 宏（补充文件 2）。</li>
	<li>通过拖放方式打开 Fiji 宏。</li>
	<li>在第 58 行，根据需要更新自动阈值化方法。</li>
	<li>在第 62 行，根据细胞尺寸更新大小范围。</li>
	<li>选择 运行。</li>
	<li>选择“Processing”文件夹，并在父文件夹中输入“Processing”，然后选择 确定。</li>
	<li>运行完成后，保存“Summary”表格。第一列为图像名称；第三列为类球体面积；第六、七、八列为拟合到类球体的椭圆参数。</li>
	<li>“Processing”文件夹现在包含每个时间点的处理后图像，扩展名为 _SpheroidArea。 
	注意：如果类球体中心较暗，请使用选择工具在所有时间点将其中心填充为白色，然后继续执行第 3 步。类似地，类球体周围的区域可用黑色填充以“清理”图像。如果图像已足够干净，请注释掉第 61 行以加快运行速度。</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNoone%2C+A+%22SEER+Cancer+statistics+review+1975-2015%2C+based+on+November+2017+SEER+data+submission%22">SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission</a>. , (2019).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720(2011).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li>
<li>Tönisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li>
<li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116(2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135(2018).</li>
<li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li>
<li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarcello%2C+M+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and%22">Advances in Experimental Medicine and</a>. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

设计3D打印间隔器用于制备厚度为1 mm的PDMS片材，随后可根据实验应用需求方便地加工成各种形状的PDMS结构。由于其制备过程简单且设计可灵活调整，该PDMS浇铸方法被选用于SID的初始设计。若需大量生产SID，可通过制作包含已带有三个等距孔的PDMS圆片的3D打印模具，将制备过程简化为一步操作，从而提高生产效率。这种方法可省去逐个打孔及后续制作三个孔的步骤，显著缩短整体准备时间。
尽管3孔打孔器是为与35 mm玻璃底培养皿配合使用而设计的，但也可提供其他尺寸，可打更多孔，从而实现平行成像更多的类球体。此外，市面上还可购得定制尺寸的盖玻片，结合3D打印的支架，可实现高通量类球体检测。采用这种方法时，限制因素是数据采集速度——例如，在我们的多色延时共聚焦成像中，获取单个类球体的三维图像堆栈约需2.5分钟。因此，对SID中的3个类球体获取三维堆栈图像大约需要8分钟。因此，为了维持我们偏好的每10分钟成像一次堆栈的频率，我们无法增加SID中的孔数。
为了记录和量化活体癌细胞在三维球状模型中的侵袭行为，可以使用明场成像<sup cl...

在癌症进展过程中，癌细胞可以获得运动性和侵袭性表型，从而脱离肿瘤组织并侵入周围组织1。最终，这些侵袭性癌细胞可到达继发器官并在其中生长，这一过程称为癌症转移1。转移导致超过90%的癌症相关死亡2。其原因之一在于，尽管局部肿瘤在临床上可控，但一旦发生转移性扩散，目前尚无有效方法可清除侵袭性癌细胞。因此，侵袭性癌细胞的出现以及从局部性疾病向侵袭性疾病的转变构成了重大的临床挑战。明确癌细胞如何启动并维持侵袭行为，可能有助于开发新型高效疗法。
三维球状模型是研究癌细胞在受控但具有生理相关性条件下运动行为的理想平台3。在此实验中，癌细胞形成的球状体被包埋于细胞外基质（ECM）中，例如Ⅰ型胶原蛋白，以模拟简化的肿瘤环境。随后通过成像技术观察癌细胞从球状体向胶原基质中侵袭的过程。然而，该方法仍面临多种挑战。
第一个挑战出现在包埋步骤中，液态胶原基质可能在培养皿表面扩散，导致类球体接触到培养皿底部。结果，类球体中的细胞在二维（2D）表面上铺展，破坏了三维（3D）类球体的形态。增加胶原蛋白用量是一种有效的解决方案，但成本较高。为了防止细胞在二维表面上铺展，同时保持胶原蛋白用量最小化，我们通过将一个厚度为1 mm、带有三个孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）插件固定在玻璃底培养皿上，开发了一种类球体成像装置（SID）。
类球体实验的第二个挑战是类球体中癌细胞的标记，这受到抗体和荧光染料渗透性差的限制，且该效应随类球体尺寸增大而加剧。尽管标记细胞的理想方法是建立稳定表达荧光蛋白的细胞系，但该方法主要局限于永生化细胞系，并受限于荧光蛋白融合体的可获得性。本文中，我们描述了一种针对固定类球体的免疫荧光染色优化方案，以及在包埋类球体前高效使用细胞质染料对细胞进行标记的方法。
类球体实验的第三个挑战在于缺乏用于随时间半自动量化细胞侵袭的简单 Fiji 宏。为解决这一挑战，我们描述了一种随时间分析类球体面积的简单方法。我们以 4T1 和 67NR 细胞系为例，说明了该方案的优势。

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Honeywell Fluka</td><td>60-014-44</td><td></td></tr><tr><td>10X Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>SH30028.LS</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368-9M</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Falcon</td><td>T1048</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 鬼笔环肽</td><td>Life Technologies</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>抗 cortactin 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab33333</td><td>1 至 200 稀释</td></tr><tr><td>抗 E-钙黏蛋白抗体</td><td>Invitrogen</td><td>13-1900</td><td>1 至 100 稀释</td></tr><tr><td>牛端胶原蛋白 I 溶液（Nutragen）</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>501050ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX 染料</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>锥形管</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>FisherBrand</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>一次性容器</td><td>Staples</td><td></td><td>塑料杯</td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>eBioscience</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 核染色剂</td><td>Thermo Fischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Thermo Fischer</td><td>S25371A</td><td></td></tr><tr><td>MatTek 培养皿（玻璃底培养皿）</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6385-100G</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>一抗，用户自定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原蛋白 I</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td>二抗，用户自定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅胶</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10789704001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>655204-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

三维球体模型中癌细胞侵袭的实时荧光成像与分析

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

癌细胞从原发肿瘤侵入邻近健康组织是转移的早期步骤。侵袭性癌细胞构成了重大的临床挑战，因为一旦其扩散开始，目前尚无有效方法可将其清除。深入理解调控癌细胞侵袭的机制，可能有助于开发新型高效疗法。由于类球体（spheroids）在生理上与肿瘤相似，研究人员已广泛利用嵌入Ⅰ型胶原中的类球体来研究癌细胞侵入细胞外基质（ECM）的机制。然而，该实验方法存在以下局限性：（1）无法精确控制类球体在ECM中的嵌入过程；（2）Ⅰ型胶原和玻底培养皿成本较高；（3）免疫荧光标记不可靠，原因是抗体和荧光染料渗透效率低；（4）图像处理和数据量化耗时较长。为解决这些问题，我们优化了三维（3D）类球体实验方案，可用于对嵌入Ⅰ型胶原中的荧光标记癌细胞进行延时录像或纵向成像，并分析癌细胞的侵袭行为。首先，我们描述了类球体成像装置（SID）的制备方法，以实现类球体在最小体积Ⅰ型胶原中的可靠嵌入，从而降低实验成本。接着，我们详细说明了对活体和固定类球体进行稳定荧光标记的操作步骤。最后，我们提供了一个易于使用的Fiji宏程序，用于图像处理和数据量化。总体而言，这一简便方法为在Ⅰ型胶原中监测癌细胞侵袭提供了可靠且经济的平台。此外，该方案可轻松修改以满足不同用户的需求。

由于其良好的生物相容性，聚二甲基硅氧烷（PDMS）被广泛用于微结构限制孔、印模和模具的微加工，推动了微图形化技术和微流控装置的发展。本文所述方法利用PDMS制备SIDs（可定制的微孔结构），以优化类球体的包埋和成像过程。图1展示了SIDs制备过程中使用的主要组件。为浇铸PDMS模具，首先通过3D打印制备一个1 mm厚的间隔层（图1A、B），将其置于两块玻璃板之间，并用大夹子密封。将PDMS注入玻璃板之间的空隙并进行烘烤，形成厚度为1 mm的PDMS薄片。SID结构示意图（图1C）标明了最优装置的尺寸参数，但由于使用活检打孔器手动打孔，孔间距可能存在轻微偏差（图1D）。图1D和F显示PDMS插件中的孔洞呈清晰的圆形，且孔间距均匀。
<p class="jove_cont...

本文介绍了一种球形体成像装置的制备方案。该装置可实现对癌细胞球形体的动态或长期荧光成像。本方案还提供了一种简单的图像处理流程，用于分析癌细胞的侵袭行为。

癌细胞从原发肿瘤侵入邻近健康组织是转移的早期步骤。侵袭性癌细胞构成主要……

本方案可用于实时研究癌细胞侵袭细胞外基质的机制。该技术的主要优势在于使用了一种简单的类球体成像装置，使得类球体侵袭实验更易于建立，并提高了其实验效率和成本效益。尽管我们以乳腺癌的类球体侵袭实验为例进行演示，但该实验模型同样适用于任何实体瘤向周围健康组织侵袭过程的研究。在打印好间隔层后，将基础聚合物与交联剂按10:1的质量比称取至塑料杯中，使用一次性移液管在杯内充分混合，得到PDMS溶液。将杯子放入真空腔室中，迅速释放真空以去除混合物表面夹带的空气，并消除残留的气泡。将3D打印的间隔层在100摄氏度下孵育5分钟以增加其柔韧性，并用100%异丙醇清洁两块玻璃片。将垫片放置在两块已清洁的玻璃板之间，使其与板边缘平齐，并在底部边缘放置两个大号长尾夹，顶部角落放置一个，以将模具密封固定在玻璃板的外侧边缘。检查模具顶部，确保垫片与玻璃板表面齐平，使用剪去约两厘米尖端的一次性移液管，缓慢而持续地将PDMS混合物加入模具的左上角。当整个模具完全填充后，将模具放入真空室中，以去除形成的任何气泡，随后在100°C下固化PDMS一小时。孵育结束后，将模具置于室温下。待其冷却至可触碰时，从含有固化PDMS的垫片上取下夹子和玻璃板，并用刀片沿垫片与玻璃板之间模具四边形成的密封处切割。将模具分开，露出垫片中的PDMS片，并用镊子小心地将PDMS片从垫片上剥离下来。将膜片置于切割垫上，使用活检打孔器切出一个直径为17.5毫米的PDMS圆片，然后在圆片上均匀分布地打三个直径为5.5毫米的孔。使用胶带去除每个插入片上的灰尘颗粒，并将清洁后的插入片粘附到一段双面胶带上。将胶带缠绕在直径10厘米的培养皿盖上，并将皿盖连同敞口的直径35毫米玻璃底培养皿一起放入等离子处理仪中。使用等离子体处理仪在 300 毫托下对插入件和玻璃底培养皿进行一分钟活化处理，并用镊子迅速将每个插入件的处理面贴附到经处理的玻璃底培养皿的玻璃部分，每个插入件对应一个培养皿。当所有插入件均贴附完毕后，用拇指和食指在旋转培养皿的同时对每个插入件施加均匀压力，以确保插入件牢固地固定在培养皿上。所有插入件固定完成后，将所得的球状体成像装置在 60 摄氏度下孵育 20 分钟，随后按照演示方法进行第二轮等离子体处理。第二次处理后，向每个插入孔中加入35 µL新配制的包被溶液。室温孵育1小时后，移除包被溶液，并用蒸馏水将装置清洗三次。最后一次洗涤后，向每个孔中加入35 µL交联溶液，室温孵育30分钟。孵育结束后，按所示方法用蒸馏水将装置冲洗三次，然后向每个装置中加入70%乙醇，在紫外光下孵育30分钟。灭菌结束后，用蒸馏水将装置冲洗三次，并向每个装置中加入2.5毫升保存液。为将类球体包埋于胶原中，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤装置三次，每次洗涤使用3毫升PBS。最后一次洗涤后，让装置完全干燥，然后在插入物的一个孔中加入30微升新配制的college one溶液，并放入一个类球体，同时启动计时器。确认类球体位于孔内后，按照示范操作，将类球体加入另外两个孔中。若类球体靠近PDMS边缘，使用10微升移液枪头将其重新居中；如果分配了多个类球体，则将其分开，并停止计时。接种后，为使类球体在胶原层中垂直居中，需将装置倒置，并在37摄氏度下孵育，直至胶原聚合，在此期间每两分钟将装置方向反转一次，共持续30分钟；随后每装置加入2.5毫升培养基，并在零小时时间点获取类球体的图像。使用类球体成像装置可高效地实现类球体包埋，并对癌细胞在胶原中的侵袭过程进行延时记录，或通过纵向成像进行观察。虽然本实验中该类球体的纵向成像持续六天，需稳定表达细胞质和/或细胞核荧光蛋白，但类似纵向成像也可通过染料标记在较短时间内完成。类球体也可进行固定和免疫标记。例如，这些类球体经过上皮型钙黏蛋白、cortactin 和 F-actin 的免疫标记。在这些图像中，可观察到使用 Fiji 宏逐步处理图像以随时间测量类球体面积的操作流程图示。务必确保将单个类球体分配至类球体成像装置的每个孔中，并在 XY 和 Z 方向上均将类球体置于孔的中心位置。通过调整孔的尺寸、插入物以及玻璃底培养皿的排列方式，可轻松修改该装置的设计，以适应更高通量的类球体实验需求。

time-resolved-fluorescence-imaging-analysis-cancer-cell-invasion-3d

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

3D球形模型中癌细胞入侵的时限解荧光成像和分析

本文描述了一种在三维胶原凝胶中定量检测转化生长因子（TGF）-β诱导侵袭的实验方法。该方法利用代表乳腺癌不同发展阶段的MCF10A系列细胞系，也可适用于其他细胞系，并可用于研究其他潜在的侵袭激活剂或抑制剂。...

用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

肿瘤细胞侵袭三维细胞外基质的模型更能反映真实情况 体内...

三维集体细胞侵袭的建模与成像

来源：Guyon, J.，等．用于胶质母细胞瘤的三维球体模型．J. Vis. Exp.

肿瘤细胞侵袭的三维球体模型构建

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

该方法用于评估癌细胞从类球体向周围三维基质的侵袭。类球体通过悬滴培养法生成，随后包埋于含有基底膜成分和I型胶原的基质中，继而监测类球体外的侵袭情况。...

一种用于在三维环境中评估癌细胞球体侵袭能力的实验方法

调控膀胱癌侵袭的过程为生物标志物和治疗策略的开发提供了机遇。本文介绍一种膀胱癌侵袭模型，该模型结合了肿瘤类球体的三维培养、延时成像和共聚焦显微镜技术。该技术可用于定义侵袭过程的特征，并用于治疗药物的筛选。...

用于研究膀胱癌侵袭及评估治疗药物的三维细胞培养系统

肿瘤微环境是癌症生长和侵袭的重要组成部分。为了模拟癌变的进展过程，需要一种具有生物学相关性的人源基质。本方案通过应用基于人源平滑肌瘤的基质，对体外三维球体侵袭实验进行了改进。此外，本方案还引入了一种基于计算机的细胞侵袭分析方法。...

基于完全人源肿瘤基质的三维球体侵袭实验

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。...

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

通过高分辨率共聚焦显微镜，表征组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在三维（3D）侵袭实验中对胶质瘤癌细胞迁移的抗迁移作用。...

通过高分辨率共聚焦显微镜表征抗转移抑制剂对三维肿瘤球体侵袭的影响

该方法可同时评估三维球状体实验中的癌细胞侵袭和T细胞介导的细胞毒性。球状体在无支架的琼脂糖多微孔模具中生成。共培养及包埋于I型胶原基质均在同一装置内完成，从而可实时监测癌细胞的侵袭行为以及T细胞介导的细胞毒性效应。...

在三维培养中监测癌细胞侵袭和T细胞毒性

侵袭是癌症发生与进展过程中的一个重要生物学现象。该过程受到肿瘤微环境中非肿瘤性细胞及各种组分的影响。本研究旨在描述一种用于分析肿瘤细胞侵袭的替代方法 体外...

分析三维培养物体外细胞侵袭的替代策略

了解利用3D打印和PDMS制备的球形成像装置对乳腺肿瘤细胞球体进行纵向荧光成像的方法。该技术可实时监测癌细胞侵袭机制，提高实验效率并降低成本，适用于研究实体瘤侵袭动态。

三维球体模型中癌细胞侵袭的实时荧光成像与分析

探索更多视频