Name: 测量 果蝇 拉瓦的机械结节的改进的检测和工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习使用Nitinol丝制作定制机械探针，精确测量果蝇幼虫的机械性伤害感受反应。该方法可量化基线伤害感受和损伤后的机械性痛觉过敏，为研究疼痛的分子与遗传机制提供可靠框架。

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我们感谢 Thomas Wang 开发了 von Frey 纤维的原型，Patrick J. Huang 改进了机械探针检测方法，Bloomington 果蝇品系中心提供了对照品系（w1118）和 ppk-Gal4&#62;UAS-mCD8-GFP 果蝇品系，以及 Galko 实验室成员对稿件的审阅。本研究工作得到了资助项目 R21NS087360 和 R35GM126929（授予 MJG）的支持。

1. 机械探针的构建
<ol>
	<li>切割每根镍钛诺丝（nitinol filament）图1B），垂直于其长轴，切割至指定长度（图1M–N）使用小型金属剪线钳（图1C）。这些纤维有三种不同的预设直径（图1B). 
	注意：此处指定的长度是基于类似的固定装置构建方案，用于实现所示近似压力的参考值。最终，无论灯丝切割的长度和固定装置中孔的深度如何，都必须在天平上对灯丝进行测量/校准，以获得精确的力/压力值。</li>
	<li>在体视显微镜下检查纤维尖端，确保无锋利或不规则边缘残留，以免损伤幼虫皮肤组织并干扰校准。</li>
	<li>使用磨刀石手动打磨机械探针的锋利边缘，直至无锋利的不规则突起残留（图1D).</li>
	<li>在一根木制冰棒棍的末端打一个孔图1E）使用皮下注射针头（参见 材料表）。将针头插入冰棒棍高度至少一半以上的位置（图1E这形成了用于插入镍钛诺丝的腔室。</li>
	<li>将木工胶涂抹于单根镍钛诺丝上图1F）并将涂有胶水的细丝插入木制冰棒棍的针槽中（图1G）。室温静置干燥约5小时。</li>
	<li>通过将每个机械探针按压在刻度尺上直至其发生弯曲来校准（图1H–L）。这是以克为单位可记录的最大作用力。根据丝状物的直径（预设）和长度（用户确定），可产生一系列不同的力和压力。</li>
	<li>将步骤 1.6 中记录的质量通过公式 f = ma（力等于质量乘以重力加速度）转换为毫牛顿（mN）为单位的力。f：力；m：质量；a：重力加速度（9.8 m/s²）2) (图1M).</li>
	<li>最后，通过将测得的力除以丝状物尖端的表面积，将计算得到的力转换为千帕（kPa）单位的压强（力/面积）图1M）。为计算面积，需将不同镍钛合金丝的直径（0.04英寸、0.06英寸和0.08英寸）从英寸换算为厘米，然后代入公式 πr²2 （其中，r = 镍钛合金丝半径）决定面积（见 图1M）。使用不同直径和长度的丝材制备多个探针，将生成覆盖响应范围的完整系列 黑腹果蝇 幼虫（所示样本集在 图1N). 
	注意：每3至4周至少检查一次每个机械探针。当压力值偏离原始测量值超过±3%时，必须重新制作新的机械探针。</li>
</ol>
2. 幼虫的制备
<ol>
	<li>在25 °C培养箱中的标准培养基上培养对照品系（w1118）的幼虫后代，或培养携带ppk-Gal4&#62;UAS-mCD8-GFP转基因（用于观察感觉神经元损伤）的幼虫。通常，品系常规保存于18 °C，但实验中亲本及幼虫后代均需在25 °C的标准玉米粉培养基上培养。 
	注意：将成虫（5只雄性和10只雌性，比例为1:2）放入果蝇培养管中，使其产卵，时间约为24小时。产卵后时间（AEL）从移除成虫时开始计算。</li>
	<li>在产卵约96小时后，通过轻轻将自来水喷入含有幼虫的软质果蝇培养基中，收集三龄幼虫。已离开培养基或前、后气门外翻的游走期幼虫体型过大/过老，不适合本实验。二龄幼虫（体长约为小于4 mm）则体型过小。</li>
	<li>将软质果蝇培养基中的内容物倒入洁净的标准尺寸培养皿（100 mm × 15 mm）中。</li>
	<li>使用镊子从较小（二龄及三龄早期）或较大（三龄晚期或游走期）的幼虫中挑选出处于三龄中期、中等体型的幼虫（见图2A）。建议使用镊子轻柔操作，避免对幼虫组织造成损伤。 
	注意：使用镊子转移幼虫主要依靠水的表面张力，而非用镊子刃部对幼虫施加压力。替代镊子操作幼虫的工具是柔软的画笔。无论使用哪种工具，操作者均应练习转移技巧，以避免造成非预期的组织损伤，从而影响行为学测量结果。</li>
	<li>使用镊子将三龄中期的幼虫转移至含有少量经室温水湿润的果蝇培养基小团的小型培养皿（30 mm × 15 mm）中。幼虫应保存在此小型培养皿中直至开始实验，但存放时间不应超过20分钟。 
	注意：通常将20–30只幼虫转移至培养基小团上，即可满足20分钟行为学实验所需的数量。</li>
</ol>
3. 机械性伤害感受检测
<ol>
	<li>使用镊子将一只三龄中期幼虫置于明亮体视显微镜下黑色或深色乙烯基垫上。深色背景可提供良好对比度，有助于清晰观察幼虫。建议使用可自由移动的深色乙烯基垫，以便在不接触或损伤幼虫的情况下调整其位置。</li>
	<li>将光纤光源置于显微镜物镜与黑色或深色乙烯基垫之间，以提供足够且高对比度的照明，便于观察幼虫。</li>
	<li>转移至垫片后若幼虫未表现出正常运动行为，则应弃用。此类幼虫可能干扰正常的伤害性行为反应。正常运动行为参见视频 1。</li>
	<li>用纸巾擦去幼虫周围多余的水分，防止幼虫在乙烯基垫上漂浮。</li>
	<li>通过移动深色乙烯基垫来调整幼虫方向。若操作者为右利手，则幼虫头部/口器应朝向左侧；左利手者则相反（图 2A–B）。</li>
	<li>将选定的机械探针施加于幼虫腹部后段背侧约A8体节处（见图 2B），持续约1–2秒，直至探针弯曲并施加出先前测定的压力值（图 2C）。探针必须紧压幼虫背表面，并在接触点处将幼虫压入下方垫片中。 
	注意：在镍钛合金丝尖端与背侧表皮-上皮接触点处，压力低于2,300 kPa的探针主要发生弯曲而不会穿透表皮及下层组织。此类探针极少影响幼虫存活率4。当压力较高（&#62;5,000 kPa）时，探针既会弯曲，偶尔也会穿透表皮及下层组织。若发生幼虫穿刺，将损害其存活能力4，此类幼虫通常应从行为分析中剔除。</li>
	<li>记录每只幼虫的行为反应。若幼虫在3秒内沿身体轴线完成360˚翻滚，则视为阳性伤害性反应（视频 2）。其他反应（如试图转向、快速爬行和扭动）在此实验中视为阴性反应。 
	注意：使用低于阈值的机械刺激（200 kPa）刺激的幼虫不会引发典型的伤害性或翻滚反应（视频 3）。部分幼虫可能表现出快速前移或轻触反应，例如运动方向的改变。</li>
	<li>弃用该幼虫，并准备下一只进行检测，重复步骤3.1至3.7。</li>
	<li>重复步骤3.1–3.7，直至达到所需幼虫数量（本实验中每种探针使用三至六组，每组n = 10只幼虫）。 
	注意：使用较低压力机械探针（174–462 kPa）时，每只幼虫的检测耗时更长。原因是较长丝状探针的尖端振荡更明显，难以准确刺入A8体节中心区域。操作此类探针需经过练习。</li>
</ol>
4. 采用共聚焦显微镜评估神经元形态
<ol>
	<li>将先前用镍钛合金细丝刺激过的幼虫（基因型为 ppk-Gal4&#62;UAS-mCD8-GFP，用于标记感觉神经元）放入一个置于考普林罐（Coplin jar）内的麻醉室中，该罐内放置一个含有约1 mL乙醚的棉球的小烧杯（10 mL）。让幼虫在麻醉室中静置约5分钟。 
	注意：本课题组先前发表的一项研究中提供了乙醚麻醉的详细方案12。</li>
	<li>用缓冲液轻轻冲洗，将幼虫从麻醉室转移至一个小培养皿中。</li>
	<li>准备好一张显微镜载玻片、两张小盖玻片（22 × 22 mm）和一张长盖玻片（22 × 54 mm）（见材料表）。</li>
	<li>在载玻片两端各加少量乙醚：油混合液（乙醚与卤代烃油溶液按1:5比例配制，见材料表），然后将小盖玻片覆盖在液滴上。此设置可在载玻片上形成一个供幼虫容纳的小间隙。 
	注意：将小盖玻片用力压向载玻片，直至难以滑动为止。</li>
	<li>在载玻片中央滴加数滴乙醚：油混合液，然后用镊子将幼虫转移至载玻片中央（位于两个小盖玻片之间）。确保幼虫的前后轴与载玻片的短边平行，且背侧朝上。</li>
	<li>将长盖玻片覆盖在幼虫及两个小盖玻片之上。 
	注意：用力下压长盖玻片，使幼虫几乎变平。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜（见材料表）在488 nm激光波长下对幼虫A8体节进行成像（用于检测GFP信号）。 
	注意：应立即进行成像，因为乙醚麻醉效果消退较快（约5–10分钟），幼虫会苏醒并移动，从而干扰后续成像。</li>
	<li>使用20倍数值孔径（NA）0.7的干物镜，在1倍放大倍数下，以1.5 μm的步长，以1024 × 1024像素的分辨率采集Z轴层扫图像。</li>
</ol>
5. 组织损伤的定量分析
<ol>
	<li>收集并转换第4.8节中的Z系列堆栈图像，将其合并为单个Z投影（即将在不同焦平面上拍摄的多幅图像压平为一幅复合图像）。此操作可使用商业软件（例如 Olympus Fluoview）或任何等效的开源平台（如 Fiji/ImageJ）完成。将生成的单个Z投影以TIFF格式保存。</li>
	<li>打开图像分析软件 Fiji/ImageJ。</li>
	<li>在菜单栏中点击文件，然后从弹出窗口中选择打开。</li>
	<li>选择以TIFF格式保存的单幅图像投影进行分析。</li>
	<li>在菜单栏中点击编辑，然后从弹出窗口中选择反相选项。</li>
	<li>在菜单栏中点击图像，然后从弹出窗口中选择调整，最后选择亮度/对比度选项。</li>
	<li>在工具栏中选择自由手绘形状工具，用于测量间隙区域（如有）的面积。</li>
	<li>在菜单栏中点击分析，然后选择测量选项。系统将显示间隙或伤口的面积。</li>
</ol>

<ol><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
<li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pickpocket+is+a+DEG%2FENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li>
<li>Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+chemical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">An assay for chemical nociception in Drosophila larvae.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282(2019).</li>
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<li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+and+neuromodulatory+feedback+facilitate+Drosophila+mechanonociceptive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).</li>
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<li>Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+insulin+receptor+regulates+the+persistence+of+injury-induced+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+caspase+activity+is+required+independently+of+apoptosis+to+produce+active+TNF%2FEiger+during+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization.</a> Cell Death & Disease. 8 (5), 2786(2017).</li>
<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li>
<li>Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PPK26+in+Drosophila+larval+mechanical+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception.</a> Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).</li>
<li>Takagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+connectivity+of+homologous+command-like+neurons+mediates+segment-specific+touch+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila.</a> Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们改进了一种已建立的机械检测方法1,2,16，使用由镍钛诺丝材定制制成的机械探针。这种金属合金使我们能够采用更小直径的丝材，更适合果蝇（Drosophila）幼虫的体型。迄今为止，在果蝇机械性伤害感受研究领域，基于钓鱼线的单丝材料一直占据主导地位2,5,6,16。我们的镍钛诺丝材在约3至5个月的时间内（根据我们的经验）能够保持其形状和测定的压力值。通过调整镍钛诺丝材的长度和直径，使用者可产生从低于阈值到几乎引发完全翻滚反应的广泛压力范围。特别是，使用更细直径的镍钛诺丝材制备低于阈值的探针更为简便。利用这些探针，我们发现，引发更一致的伤害性防御行为反应的是压强而非力4。在此，我们利用一种已确立的紫外线诱导伤害性敏感化模型7,10,13，证明这些丝材也是研究机械性异常性疼痛（allodynia）和痛觉过敏（hyperalgesia）的有用工具。
先前使用钓鱼线制备的机械探针进行的研究导致行为反应性存在一定的变异性2,6,16,17。这一现象可能由多种因素造成。首先，由于压力是关键变量，对纤维尖端进行抛光使其呈圆润状、无任何锐边至关重要。其次，报告压力值而非仅报告力的大小对于实验的可重复性非常重要，因为不同的机械探针即使产生相似的力，也可能施加截然不同的压力4。第三，使用有害探针对每条幼虫仅施加一次机械刺激至关重要，因为此类探针会在表皮4和感觉神经元水平引起剂量依赖性的组织损伤（图2E）。在组织损伤发生后，再次或重复施加有害机械刺激可能损害受影响的外周感觉神经元功能，从而引发异常的行为反应。另一项研究表明，经有害机械刺激两次的幼虫大多表现出增强的行为反应5，提示出现了急性机械性敏化（痛觉过敏），这可能是由首次有害机械刺激引发的组织损伤所致。相反，其他研究者6报告了混合性（增强或减弱）的行为反应，表明异常行为反应可能源于神经组织的损伤或功能障碍。对每条幼虫仅进行一次刺激可消除因敏化或组织损伤导致的行为反应差异。第四，我们对体节A8进行了机械刺激，该位置比以往研究更靠后（以往偏好区域为A3–A4）2,5,16。施加于体节A2或A8、压力介于约3,900 kPa至5,300 kPa之间的探针并未显示出任何行为差异4。此外，与A2–A4相比，A8区域更容易用产生较低压力（&#60;300 kPa）的机械探针进行刺激，因为该区域幼虫身体更细，因而更容易被压缩。其他研究显示，对幼虫后端施加有害机械刺激（通过镊子夹持的刚性昆虫针）主要引发向前运动，而非厌恶反应或翻滚反应18。这种不同的行为反应可能是由于所用材料性质不同（可弯曲的镍钛合金纤维与不可压缩的昆虫针）或施加于幼虫的压力不同所致（昆虫针所施加的压力值未被报道）。
机械性伤害感受检测方法的开发 黑腹果蝇 幼虫研究使该领域发现，不同的机械性感觉离子通道和神经回路介导机械性伤害感受5,6,16,17然而，与其他感觉模式（如热觉）的敏感化研究相比，对机械性异常性疼痛（痛觉过敏和触诱发痛）的研究进展较为滞后。7,8,10,13,14，低温9和化学3这种滞后可能部分归因于缺乏合适的机械探针，无法产生覆盖从阈下到超阈值压力的完整反应范围。尤其重要的是，在评估机械性异常性疼痛时，需要使用不会引发未受伤幼虫产生厌恶翻滚反应的阈下探针。我们改进后的机械探针的意义在于，可将其制备为覆盖无害刺激范围（阈下，约174 kPa–200 kPa）或从低到高有害刺激范围（超阈值，约225 kPa至约5,116 kPa）。在此，我们展示了使用镍钛诺类冯·弗雷纤维的方法 果蝇 幼虫在紫外线照射后会出现机械性异常性疼痛和机械性痛觉过敏。与热敏感相比，机械敏感的表现存在一些差异：机械敏感的起始时间和峰值均早于热（高温）敏感（机械性痛觉过敏和异常性疼痛的峰值分别约为4小时，而热敏感的痛觉过敏约为8小时，异常性疼痛约为24小时）。7此外，机械性异常性疼痛和痛觉过敏同时出现（均在约4小时达到峰值）。进一步地，尽管热敏化（异常性疼痛和痛觉过敏）在后期时间点完全消退7，机械性痛觉过敏表现出一个持续较长的尾相，仍略高于基线水平。冷觉过敏在 果蝇 涉及冷刺激诱发行为的转变9 以及新出现的冷刺激诱发行为——这一现象在机械刺激下并未观察到。这些在起始时间、持续时长和行为表现上的差异表明，每种感觉模式可能由不同的信号通路所调控。将此处描述的致敏化检测方法与果蝇中强大的遗传学工具相结合，可进一步探究不同感觉模态的分子与神经机制。 果蝇 应能实现对所观察到的机械性异常性疼痛（痛觉过敏和触诱发痛）进行精确的遗传学解析。

当暴露于不同的有害刺激（如热刺激1、机械刺激2和化学刺激3）时，Drosophila 幼虫会表现出特征性的逃避性翻滚行为。该行为明显区别于正常的运动行为。本文介绍了一种改进的机械检测方法，可用于评估机械性伤害感受和机械性敏感化。
在最近的一项研究中，我们使用镍钛合金丝制备了类似 von Frey 的探针4。通过改变构成每个探针的镍钛合金丝的长度和直径，可制成施加不同力和压力的探针。对这些机械探针进行校准后，根据每个探针尖端的面积，将测得的力值（单位为毫牛顿，mN）转换为压力（单位为千帕，kPa）4。自行制备机械探针使我们能够产生从低于阈值（≤200 kPa）到高于阈值（225 kPa 至 5318 kPa）的压力范围，这在理论上可能有助于研究机械性痛觉过敏。利用这些改进后的类似 von Frey 的机械探针，我们发现，在 Drosophila 幼虫中，压力4 比此前研究的力2,5,6 与厌恶性行为反应的相关性更为一致。本文所述的改进型机械检测方法还有助于鉴定出一种保守的血管内皮生长因子（VEGF）相关受体酪氨酸激酶信号通路，该通路调控果蝇和大鼠的机械性伤害感受4。
机械性异常性疼痛和痛觉过敏是两种疼痛过敏类型，在研究中相对较少被关注 果蝇 幼虫与热（冷、热）和化学感觉方式的比较3,7,8,9,10这可能是由于缺乏能够覆盖从无害刺激到高强度有害刺激范围的特异性机械探针所致2,5,6一种通常无害的刺激，在诱发典型的厌恶性翻滚行为后 果蝇 幼虫经历组织损伤3,7 称为痛觉超敏。对通常具有伤害性的刺激出现加剧的翻滚反应被称为痛觉过敏。7有害刺激是指能够引起组织损伤并激活伤害性感受器的刺激。11有害刺激递送至 果蝇 幼虫会损伤屏障表皮或外周伤害性感觉神经元3,4,7，或两者兼有。
本文中，我们演示如何定制制备和校准适用于 von Frey 类机械探针的装置 果蝇 幼虫。此外，我们展示了如何利用这些探针检测机械性伤害感受反应 果蝇 幼虫。最后，我们进一步通过这些探针展示了在组织损伤后机械性痛觉过敏（包括异常性疼痛和痛觉超敏）的存在，从而证明了这些探针的应用价值。 果蝇 幼虫（参见 代表性结果).

<table><tbody><tr><td>烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540C</td><td>容量为10 ml的烧杯。任何类似的容器均可使用。</td></tr><tr><td>黑色（阿肯色州）油石</td><td>Dan&amp;rsquo;s 磨刀石</td><td>SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td><td>用于打磨镍钛合金丝尖端的不规则处。https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>任何等效的共聚焦显微镜均可使用</td></tr><tr><td>考普林罐</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-500</td><td>用于麻醉幼虫。</td></tr><tr><td>乙醚麻醉室</td><td></td><td></td><td>这是一个自制的定制化装置。其具体构造细节请参见我们此前发表的论文12。乙醚麻醉装置的用途是允许二乙醚蒸气进入，同时防止幼虫逃逸。</td></tr><tr><td>光纤导光管</td><td>Schott AG</td><td>A08575</td><td>肖特双蛇形臂23英寸</td></tr><tr><td>镊子</td><td>精细科学工具</td><td>FS-1670</td><td>用于转移幼虫</td></tr><tr><td>胶水</td><td>Aleene's</td><td>N/A</td><td>Aleene's&amp;reg; 木工胶，曾用名（Aleene's All-Purpose Wood Glue）&lt;机械性伤害感受的已发表检测方法在果蝇中导致了行为评估的不一致性。本文中，我们制备了适用于果蝇幼虫的定制金属镍钛合金（nitinol）丝。这些机械探针类似于用于脊椎动物测量机械性伤害感受的von Frey探针。本文展示了如何制备和校准这些机械探针，以及如何生成从亚阈值（无害或非致痛范围）到超阈值（低至高致痛范围）刺激的完整行为剂量-反应曲线。为验证探针的实用性，我们研究了果蝇幼虫在组织损伤后诱发的痛觉过敏现象。目前尚未在果蝇幼虫中建立机械性异常性疼痛（对通常无害的机械刺激产生过敏）和痛觉过敏（对致痛性机械刺激反应增强）的模型。利用通常无害或通常引发厌恶行为的机械探针，我们发现果蝇幼虫在组织损伤后会出现机械性痛觉过敏（包括异常性疼痛和痛觉过敏）。因此，本文所展示的机械探针及检测方法可能成为解析机械性痛觉过敏基本分子/遗传机制的重要工具。&gt; https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td></tr><tr><td>可抓握式手柄</td><td>洛氏康奈尔</td><td>N/A</td><td>Loew-Cornell Simply Art 木制彩色手工棒，500 根</td></tr><tr><td>Halocarbon 油 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>30G 1/2 皮下针头&quot;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1471286</td><td>BD Precisionglide&amp;reg; 30号，长1/2英寸的注射器针头。用于在木质支架上钻孔，以固定镍钛合金丝</td></tr><tr><td>大号培养皿</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>60 mm × 10 mm 聚苯乙烯培养皿</td></tr><tr><td>显微镜（Zeiss）Stemi 2000</td><td>卡尔蔡司公司</td><td>NT55-605</td><td>任何等效的显微镜均可使用</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 22x22</td><td>Fisher</td><td>12-545-B</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 22x40</td><td>康宁</td><td>2980-224</td><td>厚度 1 1/2</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1358Y</td><td></td></tr><tr><td>迷你斜口钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>S43981</td><td>用于切割镍钛合金丝</td></tr><tr><td>镍钛合金丝，直径：0.004&amp;rdquo;, 0.006&amp;rdquo;, 0.008&amp;rdquo;</td><td>Mailin Co</td><td>N/A</td><td>每种直径的12号镍钛合金丝各取十五段&amp;rdquo; 长度已订购。&lt;br/&gt; https://malinco.com/</td></tr><tr><td>黑色乙烯基片</td><td>Office Depot</td><td>N/A</td><td>我们使用从活页夹上剪下的一小块乙烯基材料。深色可提供对比度，小尺寸便于幼虫的定位</td></tr><tr><td>小型培养皿</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td>35 mm × 10 mm 聚苯乙烯培养皿</td></tr><tr><td>解剖刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td>双端微锥形不锈钢刮刀。用于将食物放入培养皿中</td></tr><tr><td>湿巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Kimpes KMTECH，Science Brand。用于干燥幼虫表面多余的水分。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;W&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>3605</td><td>行为学实验的对照品系</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ppk-Gal4&gt;UAS-mCD8-GFP&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>8749</td><td>用于标记 IV 类 md 神经元荧光的品系</td></tr></tbody></table>

一种改进的机械性伤害感受测量实验方法及相关工具 果蝇 幼虫

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

机械性伤害感受的已发表检测方法 果蝇 导致了行为评估结果的不一致。在此，我们制备了可用于 果蝇 幼虫，定制金属镍钛合金（nitinol）丝。这些机械探针类似于在脊椎动物中用于测量机械性伤害感受的von Frey探针。本文演示了如何制备和校准这些机械探针，以及如何生成从阈下（无害或非伤害性范围）到超阈值（低至高伤害性范围）刺激的完整行为剂量-反应曲线。为展示这些探针的应用价值，我们研究了组织损伤诱导的痛觉过敏现象 果蝇 幼虫。机械性异常性疼痛（对通常无害的机械刺激产生过敏反应）和机械性痛觉超敏（对有害机械刺激反应过度）尚未在 果蝇 幼虫。通过使用通常无害的机械探针或通常引发厌恶行为的探针，我们发现 果蝇 幼虫在组织损伤后会出现机械性异常性疼痛（包括触诱发痛和痛觉过敏）。因此，本文所展示的机械性探针和检测方法可能成为解析机械性痛觉过敏基本分子/遗传机制的重要工具。

我们开发了定制的机械探针，使用镍钛合金丝（图1A,N），以诱发机械刺激引起的行为反应，并使用不同强度的无害和有害机械探针生成完整的行为剂量反应曲线（图2D）表明这些探针可用于研究基础状态（无损伤情况下）的机械性伤害感受。
我们的行为学检测结果确定，施加压力低于 200 kPa（约 1.57 mN）的探针（图1M），应用于 果蝇 幼虫不会引发厌恶性的翻滚反应（图 2D 和 视频 3）。正如预期，这些亚阈值或无伤害性机械探针（175 kPa 或 200 kPa）未引起明显的神经组织损伤（图 2E）。由于这些探针不会引起损伤，因此可用于评估机械性异常性疼痛（对通常无害的机械刺激产生过敏反应）。相反，阈上或有害探针（462 kPa 至 5,116 kPa）则引发增强的行为反应（图 2D）呈剂量依赖性——较高的压力引发更强的行为反应。正如预期，超阈值的机械压力也对周围感觉神经元本身造成剂量依赖性的组织损伤。图2E）。所测得的组织损伤面积（单位为 µm2 ± 标准差）来自每组四个幼虫的数据分别为：2,051.03 ± 703.81（462 kPa）、5,102.29 ± 1,004.67（2,283 kPa）和 12,238.83 ± 3,724.11（5,116 kPa）。因此，大于或等于 462 kPa（约 63 mN）的压力可引发幼虫的厌恶性翻滚反应（在 25% 或更多的幼虫中出现），并导致明显的神经组织损伤图2E），可用于研究机械性痛觉过敏（对通常有害的机械刺激产生过敏反应）。伤害性机械探针（≥462 kPa）总会引起组织损伤（n = 10，定性评估），但并不总是引发厌恶性的翻滚反应。
为了评估机械性异常性疼痛（痛觉超敏和痛觉过敏），我们采用了一种成熟的Drosophila幼虫伤害性感觉致敏模型，该模型通过紫外光（UV）照射诱导组织损伤7,12。该检测方法已帮助解析了热痛觉超敏的遗传和细胞机制8,9,10,13,14,15。为了确定UV处理是否引起机械性异常性疼痛，我们对中期三龄期对照组（w1118）幼虫进行了假照射或UV照射（15–20 mJ/cm2）（图3A）。随后，在处理后2 h、4 h、8 h、16 h和24 h，使用通常为亚阈值的机械探针（200 kPa，1.57 mN）对幼虫进行行为学测试。大约20%的幼虫在UV处理后2 h即出现反应，4 h时反应比例达到50%，而假照射组幼虫在相应时间点的反应比例分别为6.6%和8.3%（图3B）。这表明UV诱导的组织损伤在照射后4 h引起机械性异常性疼痛。在较晚的时间点（8 h、16 h和24 h），经UV处理的幼虫行为反应率维持在16%–20%之间（平均值，n = 3–6组，每组10只幼虫），相较于假照射对照组（反应率在3%–6%之间，平均值，n = 3–6组，每组10只幼虫）略有升高，但无统计学显著性差异（图3B）。
为了研究机械性痛觉超敏，我们使用了一种高于阈值的压力（462 kPa，3.63 mN），该压力通常可诱导约20%的幼虫产生厌恶性翻滚反应（图2D），并导致神经组织损伤（图2E）。我们将462 kPa的探针施加于有或无UV诱导组织损伤的幼虫背侧（图3A）。我们发现，在UV处理后4 h、8 h和16 h时，接受探针刺激的幼虫表现出显著增强的厌恶性翻滚反应，其中4 h时行为超敏达到峰值（约60%的幼虫有反应）；而模拟UV照射的对照组幼虫中仅有约27%表现出厌恶反应（图3C）。与机械性异常性疼痛类似，经UV处理的幼虫在8 h、16 h和24 h时的行为反应率（在36%–42%范围内）与未处理幼虫（在20%–26%范围内）相比，统计学上无显著差异。与三龄中期相比，三龄晚期的幼虫确实表现出基础行为反应的轻微下降。我们推测这可能是由于幼虫体型增大（图2A）或覆盖身体的角质层增厚所致。这一现象可以解释为何在发育后期，UV处理不再引起更强的机械敏感化，而在UV处理后4 h时则可观察到明显的敏感化效应。
综上所述，我们的结果表明 果蝇 幼虫在紫外线诱导的组织损伤后，会同时出现机械性异常性疼痛和机械性痛觉过敏。机械性异常性疼痛与痛觉过敏的峰值时间相同，均为紫外线处理后4小时；然而，机械性痛觉过敏的时程尾相更为显著，其恢复至基线水平的速度较机械性异常性疼痛更慢。
<img alt="使用力学探针、力测量和压力结果进行的镍钛合金丝实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：开发一种类似Von Frey的工具以评估机械性伤害感受 果蝇 幼虫 (A用于研究机械性伤害感受的机械探针示意图 果蝇 幼虫。B) 镍钛合金丝材及其相对直径按相对比例示出。C) 用于切割镍钛合金丝的斜口剪线钳图片。D用磨刀石打磨切割后的镍钛合金丝的锋利边缘。E) 使用皮下注射针头在探针的木质冰棒棍手柄上钻孔。针头尖端需至少达到手柄高度的一半，以确保固定丝能够稳固插入。F–G) 通过将镍钛合金细丝粘接至带插入孔的木质冰棒柄手柄上进行固定。H–L通过将机械探针按压在刻度尺上进行校准。M) 不同机械探针产生的力（单位：mN）和压力（单位：kPa）数值。构建探针（P1–P10；P：探针）所用每根镍钛合金丝的长度以厘米（cm）为单位详细列出。N一套机械探针的图片，其弹性模量范围从 174 kPa 到 5,116 kPa。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="昆虫发育阶段；解剖示意图；机械探针实验；压力与滚动关系图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：机械性伤害感受检测：Von Frey样纤维诱导厌恶性翻滚行为的剂量-反应曲线，并导致感觉神经元的组织损伤。 (A不同发育阶段（二龄和三龄幼虫）的图片 果蝇 幼虫。比例尺：2 mm。（B三龄幼虫背侧视图示意图 果蝇 幼虫。红点指示机械探针作用的腹部节段。T：胸节；A：腹节。其他解剖标志已标注。C) 实验示意图：将一个机械探针施加于幼虫背侧，直至其弯曲并接触下方表面，随后保持2秒。若压力足够高，则在释放时会引发回避性翻滚反应。 (D行为剂量反应；每个蓝色圆点代表一组10只幼虫中对机械刺激产生厌恶性翻滚反应的个体百分比。不同机械探针诱导的厌恶性翻滚行为百分比的小提琴图。kPa：千帕斯卡。箱线图中，方框表示中位数（绿色），须线（红色）表示第10和第90百分位数。E组织损伤：三龄幼虫（基因型为 ppk-Gal4&gt;UAS-mCD8-GFP 用指定压力刺激背侧第A8节段以标记伤害性感觉神经元。随后检测荧光标记的成对ddaC类IV型感觉神经元（跨越背侧中线）（见第4和第5节）。白色区域（红色星号）代表间隙或组织损伤。比例尺： 100 μm在B图中，幼虫呈背侧观，而在C图中为侧观。当机械探针压向幼虫的背侧表皮-表皮层时，在探针尖端与组织接触处及其周围区域形成一个类似凹袋的压陷结构。实心黑色曲线朝向腹侧，表示凹袋的顶部；虚线灰色侧线则代表凹袋的侧面及底部。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="UV照射装置及对机械性异常性疼痛/痛觉过敏的影响；行为反应图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：UV损伤后的机械性痛觉过敏。（A）测试致敏反应的实验设计示意图。将三龄中期幼虫进行模拟处理（非UV组）或UV照射处理，随后在不同时间点（2 h、4 h、8 h、16 h 和 24 h）进行机械性伤害感受检测。（B）机械性异常性疼痛：在模拟处理或UV照射后的指定时间点，使用通常为亚阈值或非伤害性机械刺激（200 kPa，1.57 mN）探触后，表现出厌恶性翻滚反应的幼虫百分比。（C）机械性痛觉过敏：在模拟处理或UV照射后的指定时间点，使用通常为超阈值或伤害性机械刺激（462 kPa，3.63 mN）探触后，表现出厌恶性翻滚反应的幼虫百分比。误差条表示均值 ± 标准误（SEM）。统计分析采用双尾非配对t-检验：*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01；ns：无显著性差异。图B和图C中每个红点代表10只幼虫的平均比例，每时间点/条件n = 3–6组。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
视频 1：Drosophila 幼虫的正常运动。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：对 Drosophila 幼虫施加有害机械刺激。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 3：Drosophila 幼虫的阈下机械刺激。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本实验方案的目的是展示如何在黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中进行改良的机械性伤害感受检测。我们在此利用该检测方法证明，黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中存在机械性痛觉过敏（包括异常性疼痛和痛觉过敏）。

已发表的果蝇机械性伤害感受检测方法导致了行为评估结果的不一致。本文中，我们制备了一种可用于果蝇的装置……

本方案具有重要意义，因为它使研究人员能够构建一种工具，用于精确测量遗传上易于操作的黑腹果蝇幼虫的机械性伤害感受反应。该技术的主要优势在于，它使用简单的材料即可制作定制工具，能够检测从阈下到完全反应范围内的机械性伤害感受。这些工具和方法可用于测量基础状态下的机械性伤害感受，以及损伤或疾病后的伤害感受敏化现象。使用定制细丝探测幼虫需要练习。在开展实验之前，操作者应能够利用对照幼虫生成剂量-反应曲线。构建机械探针时，使用小型剪线钳沿镍钛诺细丝的长轴垂直方向将其剪切成指定长度。尼龙丝分为三种不同的预设直径。在体视显微镜下检查尼龙丝尖端，确保无可能损伤幼虫皮肤或干扰校准的锋利或不规则边缘。然后使用磨刀石手动打磨探针边缘，直至无锋利的不规则处残留。接下来，使用皮下注射针头在木质冰棒棍的一端附近钻一个小孔。将木工胶涂抹在单根镍钛诺丝上，并将涂有胶水的镍钛诺丝插入针孔中。待胶水完全干燥后，将探针压向鳞片直至探针发生弯曲，以确定可记录的最大力（单位为克）。使用公式将记录的质量转换为毫牛顿单位的力。然后将测得的力除以丝状物尖端的表面积，将计算得到的力转换为千帕单位的压力。通过使用不同直径和长度的丝状物制备多个探针，可获得一组完整的探针，覆盖果蝇幼虫的响应范围。为准备果蝇幼虫实验，将幼虫子代置于标准培养基上，在25摄氏度培养箱中培养约96小时。当幼虫发育至三龄幼虫阶段时，在小型培养皿中制备一块果蝇食物，用于后续测试，并用镊子小心地从较小的二龄及早期三龄幼虫以及较大的晚期或游走期三龄幼虫中分选出中等大小的中期三龄幼虫。然后用镊子将20至30只中期三龄幼虫转移至含有少量经室温水润湿的果蝇食物小块的小型培养皿中。进行机械性伤害感受实验时，使用镊子将三龄中期幼虫放置在明场体视显微镜下的深色薄乙烯基垫上，并将光纤灯置于显微镜物镜与垫子之间。用纸巾擦去幼虫周围多余的水分，移动垫子使幼虫头部和口器朝向研究人员的非惯用手。选择一个机械探针，将其施加于幼虫后背部大约腹部第A8节段，持续一到两秒，小心地将幼虫压入垫子，使探针在接触点发生弯曲，并施加先前测定的压力值以引发反应。若幼虫在3秒内沿其身体轴线完成360度的完整螺旋翻滚，则表明出现阳性伤害感受反应。记录每只幼虫的行为反应。随后丢弃已测试的幼虫，并准备下一只幼虫进行检测。这些带有镍钛合金丝的定制机械探针可用于诱发机械性刺激引起的行为反应，并利用不同强度的无害和有害机械探针生成完整的行为剂量-反应曲线。正如这些行为检测结果所示，施加压力在200千帕或以下的探针不会引发黑腹果蝇幼虫的厌恶性翻滚反应。与预期一致，这些低于阈值或无害的机械刺激探针不会引起明显的神经组织损伤。相反，超阈值或有害刺激会以剂量依赖性方式引发增强的行为反应，并对周围感觉神经元本身造成组织损伤。这些刺激还可用于测量损伤后的机械性痛觉过敏。约20%的幼虫在紫外线处理后两小时即出现厌恶性翻滚反应，而四小时后反应比例上升至50%，相比之下，模拟紫外线照射的对照组动物无此反应。由于本分析所用探针的强度为通常处于阈下水平的 200 千帕，因此该反应被视为机械性异常性疼痛。在后续时间点，经紫外线处理的幼虫行为反应略有增加，但与模拟照射的对照组相比无统计学差异。在紫外线处理后 4 小时、8 小时和 16 小时使用 462 千帕探针检测的幼虫表现出显著增强的厌恶性翻滚反应，其中 4 小时达到行为性痛觉过敏的峰值，因为该刺激最初即具有伤害性。该反应被视为机械性痛觉超敏。探针制备、幼虫筛选及压迫操作对实验成功至关重要。使用这些探针可测量损伤后基础痛觉及机械性伤害感受性超敏反应。利用这些工具和检测方法，可以在遗传上易于操作的黑腹果蝇模型中测量机械性伤害感受和伤害感受性过敏的分子与遗传基础。

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