一种改进的机械性伤害感受测量实验方法及相关工具 果蝇 幼虫

本方案具有重要意义，因为它使研究人员能够构建一种工具，用于精确测量遗传上易于操作的黑腹果蝇幼虫的机械性伤害感受反应。该技术的主要优势在于，它使用简单的材料即可制作定制工具，能够检测从阈下到完全响应范围内的机械性伤害感受。这些工具和方法可用于测量基础状态下的机械性伤害感受，以及损伤或疾病后的伤害感受敏化现象。

使用定制细丝探测幼虫需要练习。在开展实验之前，操作者应能够利用对照幼虫生成剂量-反应曲线。构建机械探针时，使用小型剪线钳沿镍钛诺细丝的长轴垂直方向将其剪切成指定长度。

纤维有三种不同的预设直径。在体视显微镜下检查纤维尖端，确保无可能损伤幼虫皮肤或干扰校准的锋利或不规则边缘。然后使用磨刀石手动修整探针边缘，直至无锋利的不规则处残留。

接下来，使用皮下注射针头在一根木质冰棒棍的末端附近钻一个小孔。将木工胶涂抹在单根镍钛诺丝上，并将涂有胶水的镍钛诺丝插入针孔中。待胶水完全干燥后，将探针压向秤盘直至探针发生弯曲，以确定可记录的最大力值（单位为克）。

使用公式将记录的质量转换为毫牛顿单位的力。然后将测得的力除以丝状物尖端的表面积，将计算得到的力转换为千帕单位的压力。通过使用不同直径和长度的丝状物制备多个探针，可获得一组完整的探针，覆盖果蝇幼虫的响应范围。

为准备果蝇幼虫实验，将幼虫子代在25摄氏度培养箱中的标准培养基上培养约96小时。当幼虫发育至三龄幼虫阶段时，在小型培养皿中制备一块果蝇食物，用于后续测试，并用镊子小心地将中等大小的中期三龄幼虫与较小的二龄及早期三龄幼虫以及较大的晚期或游走期三龄幼虫分离开来。然后用镊子将20至30只中期三龄幼虫转移至含有少量经室温水润湿的果蝇食物小块的小型培养皿中。

进行机械性伤害感受实验时，使用镊子将三龄中期幼虫放置在明场体视显微镜下的深色薄乙烯基垫上，并将光纤灯置于显微镜物镜与垫子之间。用纸巾擦去幼虫周围多余的水分，移动垫子使幼虫头部和口器朝向研究人员的非惯用手一侧。选择一个机械探针，将其施加于幼虫后背部大约腹部第A8节段，持续一到两秒钟，小心地将幼虫压向垫子，使探针接触点处的幼虫被压缩，直至探针弯曲并施加出先前测定的压力值。

若幼虫在三秒内沿其身体轴线完成360度的完整螺旋翻滚，则表明出现阳性伤害感受反应。记录每只幼虫的行为反应。随后丢弃已测试的幼虫，并准备下一只幼虫进行检测。

这些带有镍钛合金丝的定制机械探针可用于诱发机械性行为反应，并利用不同强度的无害和有害机械探针生成完整的行为剂量-反应曲线。正如这些行为检测结果所示，施加压力等于或小于200千帕的探针不会引发黑腹果蝇幼虫的厌恶性翻滚反应。与预期一致，这些低于阈值或无害的机械探针对神经组织不会引起可见的损伤。

相反，高于阈值或有害的刺激会以剂量依赖性方式引发增强的行为反应，同时对周围感觉神经元本身造成组织损伤。这些刺激还可用于测量损伤后的机械性痛觉过敏。大约20%的幼虫在紫外线处理后两小时即出现厌恶性翻滚反应，而四小时后则有50%出现反应，相比之下，模拟紫外线照射的对照动物无此反应。

由于本分析所用探针的强度为通常处于阈下水平的 200 千帕，因此该反应被视为机械性异常性疼痛。在后续时间点，经紫外线处理的幼虫行为反应略有增强，但与模拟照射的对照组相比无统计学差异。在紫外线处理后 4 小时、8 小时和 16 小时使用 462 千帕探针检测时，幼虫表现出显著增强的厌恶性翻滚反应，其中 4 小时达到行为性痛觉过敏的峰值，因为该刺激最初即具有伤害性。

该反应被视为机械性痛觉超敏。探针制备以及幼虫的选择和压缩对于该操作的成功至关重要。使用这些探针可测量损伤后基础痛觉及机械性伤害性感受超敏反应。

利用这些工具和检测方法，可以在遗传上易于操作的黑腹果蝇模型中测量机械性伤害感受和伤害感受性过敏的分子与遗传基础。