Name: 用于微藻模型改进的高通量代谢分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 了解表型微阵列技术如何用于高通量代谢分析，以Chlamydomonas reinhardtii为模型生物改进微藻代谢网络模型。该方法可识别新反应和酶谱，为藻类生物学研究提供系统化的模型优化方案。

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本研究的主要支持来自纽约大学阿布扎比分校基因组学与系统生物学中心（CGSB），资助方为塔克欣（Tamkeen），项目资金来自纽约大学阿布扎比分校研究所拨款（73 71210 CGSB9）以及纽约大学阿布扎比分校教师研究基金（AD060）。W.F. 还获得了浙江大学“百人计划”的额外支持。我们感谢 Ashish Jaiswal 在视频录制过程中提供的帮助。我们感谢 Hong Cai 生成了代谢表型数据。

1. 表型微阵列实验
<ol>
	<li>从美国明尼苏达大学的衣藻资源中心（https://www.chlamycollection.org）获取 C. reinhardtii 菌株 CC-503。</li>
	<li>将细胞在新鲜的Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基中培养19&#160;，添加终浓度为400 µg/mL的替门汀、50 µg/mL的氨苄青霉素和100 µg/mL的卡那霉素（以抑制细菌生长），在25 °C、光照强度为400 µmol光子/m2s的条件下培养两天，至对数中期。</li>
	<li>在22 °C下以2,000 × g离心10分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>制备含有0.1%四氮唑紫染料“D”的新鲜TAP培养基。 
	注意：根据每块微孔板所测试的代谢物类别，在此步骤中可对TAP培养基进行修改，去除某些营养成分（例如，在氮源测试板中去除氯化铵）。</li>
	<li>将沉淀重悬于步骤1.2中制备的新鲜TAP培养基中，调整细胞浓度至最终浓度为1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>使用化学化合物阵列检测板（包括碳源、氮源、磷和硫源检测板以及肽类氮源检测板）。</li>
	<li>将含细胞的培养基各100 µL加入检测板的每个孔中。 
	注意：确保每个检测设置重复实验。</li>
	<li>在酵母提取物/蛋白胨平板上划线培养细胞，并在实验前后按照Smith et al.20&#160;的方法进行革兰氏染色，以监测细菌污染情况。</li>
	<li>将化学化合物阵列检测板插入微孔板读数系统中。</li>
	<li>将所有检测板在30 °C下孵育最多7天，并设置微孔板读数系统每15分钟读取一次染料颜色变化。 
	注意：由于大多数微孔板读数仪在孵育过程中无法提供持续光照，因此藻类应能够进行异养呼吸。</li>
</ol>
2. 数据分析
<ol>
	<li>将微孔板读数仪的原始动力学数据导出为 CSV 文件，随后用作 R 中 Omnilog 表型微阵列（OPM）软件包的输入数据。将生物学信息作为元数据添加（例如菌株编号、培养基、温度等）。
	<ol>
		<li>使用 PM 动力学数据转换软件；加载 D5E 数据文件，并在 PM 动力学分析软件中通过以下命令行将其转换为 OKA 文件： 
		Load | Import（定位 OKA 文件所在文件夹）| Populate Filters | Import | Add All Plates | Close。 
		&#8203;Export | 选择读数数据 （Kinetic），选择格式 （CSV）（Tabulate Header），选择微孔板 （每块板（单独文件））| Export data | Save。</li>
		<li>为进行表型微阵列（PM）数据分析，使用在 R 软件环境中运行的 OPM 软件包21,22&#160;。该软件包、教程及参考文档&#160;可在以下网址获取：&#160;http://www.goeker.org/opm/。在 R 的图形用户界面 RStudio 中，使用以下命令安装 opm 软件包及其依赖项： 
		source (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) 
		library (opm)</li>
		<li>进入包含动力学数据 CSV 文件的目录，并使用 read_opm 函数导入数据： 
		&#8203;x &#60;- read_opm(&#34;.&#34;, convert=&#34;grp&#34;, include=list (&#34;csv:&#34;))</li>
		<li>通过曲线参数估计对动力学数据进行聚合与离散化处理。 
		For (i in 1 :length(x)) { 
		x[[i]] &#60;- do_aggre(x[[i]], boot = 0 L, cores = 1 L, method =&#34;splines&#34;, options = set_spline_options(&#34;smooth.spline&#34;)) 
		x[[i]] &#60;- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE) 
		} 
		#元数据的收集 
		metadata &#60;- collect_template(&#34;.&#34;) 
		metadata$Strain &#60;- c(&#34;BLANK&#34;,&#34;CC- 503&#34;) 
		for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] &#60;- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}</li>
		<li>使用 xy_plot 函数将呼吸（或生长）测量值（y 轴）随时间（x 轴）的变化关系绘制成图，适用于所检测的 96 孔板。 
		print (xy_plot(x[[ 1 ]], include =&#34;Strain&#34;, theor.max = FALSE))</li>
		<li>使用 level_plot 函数将数据可视化为热图，以便快速比较动力学数据。 
		level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt(&#34;color.borders&#34;), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =&#34; &#34;, space =&#34;Lab&#34;, bias = 0.7 , num.colors = 200 L)</li>
		<li>从原始动力学曲线中提取重要的生物学信息——曲线参数，包括延滞期（λ）、生长速率（μ）、最大细胞呼吸（A）以及曲线下面积（AUC）21。为鉴定阳性代谢物，需使用阴性对照的 A 值（代表染料与培养基之间的非生物反应性）以及每块微孔板的空白孔作为背景扣除值。extract 函数用于获取 A 参数。 
		opm_opt(&#34;curve.param&#34;) 
		param &#60;- extract (x, as.labels = list(&#34;Strain&#34;)))</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 与新代谢物相关的反应和基因的鉴定
<ol>
	<li>通过检索 KEGG（京都基因与基因组百科全书）(http://www.genome.jp/kegg/) &#160;和 MetaCyc (http://metacyc.org/)，确定由化学化合物阵列实验发现的代谢物所参与反应的酶学委员会编号（EC 编号）23,24。</li>
	<li>以所确定的 EC 编号为基础，在多个可获取的藻类注释资源中进行搜索，包括联合基因组研究所（JGI）、Phytozome（http://www.phytozome.net）以及同行评审的科学文献23,25,26,27。</li>
	<li>若某 EC 编号未检索到相应的遗传学证据，则需在其他生物中鉴定与该酶相关的蛋白质，优先从与C. reinhardtii亲缘关系最近的物种开始；随后在 NCBI PSI-BLAST 服务器上使用默认参数进行基于序列谱的搜索，并利用C. reinhardtii（taxid:3055）的非冗余蛋白数据库（nr）识别与该反应相关的候选基因12。</li>
	<li>对 E 值 < 0.05 的 PSI-BLAST 检出结果进行人工审编，通过 EMBL-EBI Pfam（http://pfam.xfam.org/search）或 InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）蛋白结构域预测服务器进一步验证其是否与目标 EC 编号对应的酶功能相关。需注意，后两种分析是确保正确鉴定蛋白酶活性的关键步骤。</li>
</ol>
4. 模型优化与评估
<ol>
	<li>使用最新的 COBRA Toolbox v.3.028&#160;在 MATLAB 中29,30&#160;用于模型优化的平台，以执行以下步骤。COBRA Toolbox 的安装可按照以下链接中的步骤进行：https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html 。此外，需注意 COBRA Toolbox 也可在其他开源编程语言中实现，例如 Python（COBRApy）31）并可在以下网址获取：https://opencobra.github.io/cobrapy/。
	<ol>
		<li>安装 COBRA Toolbox v.3.0 后，打开 MATLAB 并执行以下命令以初始化工具箱： 
		&#8203;initCobraToolbox;</li>
		<li>将已鉴定的反应及其相关基因添加至代谢模型中，例如 iiRC1080，使用 COBRA Toolbox 函数 addReaction 以及 changeGeneAssociation. 导航至包含该文件的目录 iiRC1080 模型，从 http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 下载后，执行以下命令以加载模型、重命名模型，并添加一条新反应及其相关基因。 
		加载('iRC 1080 .mat') 
		modelNew = iRC 1080 
		modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , &#8230; 
		{'d-ala[c]' , 'atp[c]' , &#8230; 
		D-丙氨酸[c] , adp[c] , pi[c] &#8230; 
		'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); 
		modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, &#8230; 
		D-ALA 2'，'au.g 14655 _t 1</li>
		<li>在某些情况下，当代谢物并非在细胞内产生，而是从培养基中摄取时，需向模型中添加新代谢物的转运反应。这些转运反应代表代谢物从胞外环境被动扩散至胞质溶胶的过程。此外，使用相应的虚拟交换反应进行补充 addExchangeRxn 将代谢物输入或输出至胞外培养基的功能。 
		modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , &#8230; 
		{'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true) 
		modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]', -1000, 1000);</li>
		<li>测试新生成模型的行为，例如， iBD1106，通过使用该函数进行通量平衡分析（FBA） 优化Cb模型 在光照和黑暗条件下，以生物量最大化作为目标函数。对于光照生长，将PRISM太阳能自养光反应的下限和上限设为646.07（最大速率）。对于黑暗生长，将所有PRISM光反应的上下限设为零。使用先前定义的生物量函数。10&#160;在黑暗和光照条件下生长。FBA 解决方案将输出两个分别对应反应通量（solution.v）和缩减成本（solution.w）的向量，以及一个对应代谢物影子价格（solution.y）的向量。 
		%模拟光照条件下的生长： 
		modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ &#8230; 
		% 'PRISM_solar_litho' , &#8230; 
		PRISM_solar_exo &#8230; 
		PRISM_incandescent_ 60 W &#8230; 
		PRISM_fluorescent_cool_ 215 W &#8230; 
		PRISM_metal_halide &#8230; 
		PRISM_high_pressure_sodium &#8230; 
		PRISM生长室 &#8230; 
		PRISM_white_LED &#8230; 
		PRISM_red_LED_array_ 653 nm &#8230; 
		PRISM_red_LED_ 674 nm &#8230; 
		PRISM_fluorescent_warm_ 18 W &#8230; 
		PRISM_design_growth &#8230; 
		}, 0, 'b' ); 
		modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); 
		FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');</li>
		<li>重复步骤 4.1.4 iiRC1080，以比较获得的FBA解 iBD1106 与获得的那些进行比较 iiRC1080</li>
		<li>可用的 COBRA 方法有多种，可用于比较模型（例如，通量变异性分析、基因敲除研究、鲁棒性分析、通量分支预测、FBA、采样等）。详细教程可参见&#160;https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html。此处提供了一个示例，其中&#160;iiRC1080 模型与其优化版本进行比较， iBD1106，通过获取各模型中所包含代谢物的影子价格（生物量目标函数对系统变量变化的敏感性）。 
		获取代谢物的影子价格： 
		shadowPrices = 表（modelNew.mets, &#8230; 
		modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文利用高通量PM测定板和未经修饰的PMI，描述了绿色微藻C. reinhardtii的代谢表型分析。该检测方法共用于190种碳源（PM01和PM02）、95种氮源（PM03）、59种磷源和35种硫源（PM04），以及肽类氮源（PM06-08）。在这些检测中，共观察到148种营养物质产生阳性呼吸反应（其中碳源利用有1项阳性检测，硫源和磷源利用各有4项阳性检测，氮源利用有139项阳性检测）。当将培养基应用于针对各类营养源（碳、氮、磷或硫）进行检测的相关PM微孔板时，培养基中不应添加对应的底物或营养成分。
此处展示的方法可有效用于表征微藻的代谢表型，进而扩展现有的代谢网络模型或指导新模型的构建。此外，随着&#160;大多数微藻的营养需求尚不明确，该平台可用于快速确定这些需求。Nelson 等43&#160;已成功应用这些方法鉴定出可促进微藻生长的新化合物 Chloroidium sp. UTEX 3007，并利用所获得的信息定义该物种的入口代谢物，这些代谢物与衣藻不同，包括&#160;40 种不同的碳源。
使用PM对微藻进行表型分析的一个主要局限在于，PMI的培养室中没有光照，因此微藻必须能够进行异养代谢。缺乏光照可能会影响那些依赖光信号来计算代谢通量的模型的解释。具有协同功能的基因对在进化过程中共同形成了代谢网络的枢纽，而光合与非光合代谢网络枢纽之间的区别是可以界定的44。通常情况下，光合代谢网络枢纽（即模型中连接度较高的节点）将不会包含在异养模型中。从实际应用角度出发，在对混合营养型物种建模时，应排除已知由光照驱动的反应，并考虑不同条件下能量平衡的差异。因此，在衣藻代谢建模中，分别对光依赖性和光非依赖性代谢进行建模是标准做法6,45。
一些绿色微藻，例如共球藻纲（Trebouxiophytes），能够同化多种碳分子以支持生长，这被认为源于它们作为地衣共生成员的长期进化历史。46。虽然像绿藻类这样的 衣藻 可利用乙酸盐进行生长的褐色海洋微藻 微绿球藻（Tisochrysis lutea） 以其商业化生产超长链多不饱和脂肪酸（VLC-PUFAs）的潜力而闻名，不能利用乙酸盐，但可利用甘油进行生长47生物量浓度超过 100 g/L−1 干重细胞量已通过以下方式实现 小球藻 通过在补料分批模式下优化添加有机碳源48此外，向其中添加糖可 小球藻 vulgaris 可提高其对 CO 的封存能力2, 从而在光合生长过程中提供加性效应49大多数异养型微藻也可进行混合营养生长，但绿藻门 Chromochloris zofingiensis 已证明在添加糖后可关闭光合作用50.
硅藻属于硅藻门（Bacillariophyta），是一类重要的浮游植物。尽管大多数硅藻只能进行光能自养生长，但其中一些种类可进行混合营养或异养培养51。例如，已发现甘油可在无CO2&#160;的光照条件下支持某些硅藻（包括模式物种Phaeodactylum tricornutum）的生长52。此外，某些底栖硅藻（如Nitzschia linearis）可在黑暗中利用碳水化合物生长53。通过添加合适的有机碳源，使细胞实现异养生长，有望将PM测定法扩展应用于硅藻及其他藻类类群；而对于专性自养微藻，也可结合最低限度的光照，采用混合营养策略进行培养。
为评估数据的可重复性，强烈建议对所有板进行重复检测。只有在减去阴性对照和相应空白孔的值后，吸光度（PMI值）为正值时，才可将该检测结果视为阳性。此现象在存在待测化合物的情况下，反映了染料与培养基之间的非生物反应。

为了增强并稳定地生产目标代谢物，优化藻类代谢需要通过代谢网络的系统水平分析，开发复杂的代谢工程策略。代谢网络模型可为优化策略的快速设计提供理性指导1,2,3,4。尽管已有约160种微藻物种完成测序5，但据我们所知，目前仅建立了44个藻类代谢模型4,6,7。由于难以获得高通量的代谢表型数据以对基因组信息进行实验验证，高质量网络模型的构建滞后于藻类基因组测序的快速发展。
C. reinhardtii 是藻类相关研究的理想模式体系。该物种可进行光能自养或异养生长，已被广泛用作基础与应用研究中的模式生物。其基因组序列于2007年发表8，随后研究人员基于该物种的基因组信息构建了基因组尺度的代谢模型9,10,11。Chang et al.10&#160;基于基因组数据及文献证据（共涉及约250个来源）构建了C. reinhardtii 的基因组尺度代谢模型（iRC1080）。该模型包含1,706种代谢物和2,190个反应10；然而，该模型的完整性在当时无法超出已有发表的实验数据进行验证。
表型微阵列（PMs）技术是一种高通量平台，可为异养型微生物以及组织培养细胞提供代谢谱信息。特别是可用于解决微藻中表型与基因型之间的知识鸿沟，此应用首次报道于 莱茵衣藻12&#160;随后针对一种绿胞藻属（Chloroidium）物种13&#160;和小球藻14通过研究细胞对数千种代谢物、信号分子、渗透调节剂和效应分子的响应，PM检测可提供功能性代谢谱分析，并揭示细胞的功能、代谢特征及对环境的敏感性15,16,17具体而言，PM检测通过在96孔微孔板的各个孔中分别含有不同营养物质、代谢物或渗透调节物质，来检测细胞对代谢物的利用情况。此外，还可用于检测生物活性分子，如抗生素和激素。该方法通过检测NADH还原四唑类氧化还原染料所产生的颜色强度，评估细胞呼吸过程中对底物的代谢利用情况。15,16,1796孔微孔板中的实验可通过表型微阵列仪器（PMI）平台随时间自动监测和测定。设计有二十块96孔微孔板，涵盖常见的代谢物集合，用于研究细胞在利用碳源、氮源、硫源和磷源时的表型，以及不同渗透压/离子浓度和pH条件的影响。表型微阵列（PM）技术已成功应用于更新和完善多种现有微生物基因组尺度代谢模型。15,16,17,18.
此处所示方案与数据基于 Chaiboonchoe 之前发表的研究工作 等12&#160;本文介绍了利用PM测定方法来表征微藻的代谢表型，并扩展现有微藻代谢模型的研究工作 C. reinhardtii 以及指导新代谢模型的构建。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素</td><td>VWR</td><td>97062-796</td><td></td></tr><tr><td>Biolog 生理生化鉴定板 [PM01-08]</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolog Omnilog 检测系统</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>莱茵衣藻 CC-503 菌株</td><td>美国明尼苏达大学莱茵衣藻资源中心</td><td></td><td>明尼苏达大学董事会</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>VWR</td><td>0408-EU-10G</td><td></td></tr><tr><td>四氮唑紫染料 &amp;ldquo;D&amp;rdquo;</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>替门汀</td><td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td><td>42010012-2</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量代谢谱分析用于微藻模型的优化

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

代谢模型基于生物体的基因组注释信息构建，可作为在系统水平上研究代谢过程的预测工具。基因组尺度的代谢模型可能包含空缺以及尚未通过实验验证的反应。对于新分离的微藻物种，由于此类分离株的代谢生化证据通常较为匮乏，所构建的模型会因这些空缺而存在缺陷。表型微阵列（phenotype microarray, PM）技术是一种高效、高通量的方法，可功能性地测定细胞在多种进入性代谢物刺激下的代谢活性&#160;。将高通量表型检测与代谢建模相结合，可通过提供生化证据来支持和扩展基因组证据，从而快速重建或优化现有的代谢网络模型。本研究将以绿色微藻模式物种Chlamydomonas reinhardtii为例，展示PM检测在微藻研究中的应用。本研究利用PM实验获得的254个以上反应的实验证据，将基因组尺度的C. reinhardtii代谢网络模型iRC1080扩展并优化了约25%。本文建立的实验方案可作为其他微藻（包括已知的微藻突变体和新分离株）代谢功能特征分析的基础。

本实验方案展示了如何利用表型微阵列（phenotype microarray, PM）技术平台，确定绿色微藻Chlamydomonas reinhardtii的代谢需求，并优化现有的代谢网络模型。

代谢模型基于生物体的基因组注释信息构建，可作为预测性工具用于研究代谢过程……

表型微阵列技术是一种高效的高通量方法，可功能性地测定细胞在多种进入代谢物作用下的代谢活性。该技术通过基于四氮唑的氧化还原染料经NADH还原后产生的显色程度来反映细胞呼吸强度，从而衡量代谢物的利用情况。在本研究中，我们将以模式物种莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为例，介绍表型微阵列分析在微藻研究中的应用。本研究的目的是建立一种可靠的方法，用于表征微藻的代谢表型，该方法可用于扩展现有的微藻代谢网络模型，或指导新模型的构建。莱茵衣藻CC-503菌株可从美国明尼苏达大学的莱茵衣藻资源中心获得。将细胞接种于新鲜的Tris-乙酸盐-磷酸盐-脂肪培养基中，培养至对数中期。在显微镜下检查细胞，确保细胞状态良好且无任何污染。以2000 ×g 离心10分钟收集培养物。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。制备含有0.1%四氮唑紫染料的新鲜自来水培养基。加入不同抗生素（包括替门汀、氨苄青霉素和卡那霉素）以抑制细菌生长。根据每种平板类型的不同，可省略脂肪培养基及此步骤中的营养成分。将菌体沉淀重悬于新鲜自来水培养基中，调整终浓度为每毫升100万个细胞。使用化学化合物阵列检测板，例如碳源、氮源、磷源和硫源检测板，以及肽类氮源检测板。将100 µL适量的自含培养基接种到检测板的每个孔中。确保对检测进行重复。需要注意的是，在此阶段，应在实验前后对细胞进行革兰氏阴性染色检测，以监测细菌污染情况。将化学化合物区域实验板插入微孔板读数仪系统中。将所有板在30°C下孵育最多七天，并设置微孔板读数仪系统每15分钟读取一次染料颜色的变化。由于大多数微孔板读数仪在孵育过程中无法提供持续光照，因此藻类应能够在无光条件下进行异养呼吸。将微孔板读数仪的原始动力学数据导出为 CSV 文件，这些文件将作为表型微阵列软件包及我们所用软件的输入数据。为进行表型微阵列数据分析，使用在 R 软件环境中运行的 OmniLog 表型微阵列分析软件包（Erik OPM）。在 R 的图形用户界面 R studio 中，使用文中所述命令安装 OPM 软件包及其依赖项。导航至包含动力学数据 CSV 文件的目录，并使用 read OPM 函数导入数据。可使用 pref 参数估计对动力学数据进行聚合和离散化处理。使用函数 XY 图可将呼吸作用或生长测量结果作为时间的函数，用于检测 96 孔板中的反应。可通过函数水平图将数据以热图形式可视化，从而快速比较动力学数据。下一步是鉴定与新代谢物相关的反应和基因。如果已有藻类模型，可利用表型微阵列系统的数据分析来优化该模型。本文介绍了我们用于基于表型微阵列数据优化衣藻基因组尺度代谢网络模型的流程。当某种新化合物被检测为可利用时，将基于已知的代谢知识确定该化合物相关的反应谱，并提供相应的酶学委员会编号。第一步是搜索 Kegg 和 MetaCyc，以确定利用化学化合物阵列中发现的代谢物所参与反应的酶分类号（EC 号）。接下来，我们以鉴定出的 EC 号为基础，在多种现有的藻类注释资源中进行搜索，例如联合基因组研究所（JGI）、Phytozome 以及同行评审的出版物。随后，将这些反应和代谢物添加到基于 COBRA 的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）代谢网络模型 iRC1080 中，以扩展和优化该模型。如果未发现支持该EC编号的遗传学证据，可进行基于序列谱的搜索，例如美国国家生物技术信息中心（NCBI）的位点特异性迭代搜索（Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST），以鉴定与该反应相关的候选基因。随后对结果进行人工评估。通过此质量控制步骤、且与目标EC编号相关的E值小于0.05的基因，将被添加至度量模型中。本方案的最后一步是模型优化、评估与比较。使用最新版 COBRA 工具箱 3.0 及 MATLAB 平台执行模型优化步骤。安装 COBRA 工具箱后，即可下载 iRC1080 模型。然后在 MATLAB 中，首先需要导航到包含参考模型 iRC1080 的文件夹。使用 Cobra 工具箱函数，将已鉴定的反应及其相关基因添加至代谢模型（如 iRC1080）中。添加反应并修改基因关联关系。导航至包含 iRC1080 模型的目录，并执行命令以加载该模型。重命名模型，添加新的反应及其相关基因。在某些情况下，当代谢物不在细胞内生成，而是从培养基中摄取时，需要使用添加/交换反应功能，将新代谢物的转运反应加入模型中，以实现代谢物向胞外环境的输入或输出。通过使用“在光照和黑暗条件下以生物量最大化为目标函数”的优化CB模型功能，进行通量平衡分析（FBA），测试新结果和模型（例如iBD1106）的行为表现。FBA求解结果输出三个向量：反应通量、代谢物影子价格以及反应的归约成本。此处提供一个示例，通过获取影子价格来比较iRC1080模型与其优化版本iBD1106，影子价格表示各模型中生物量目标函数对代谢物变化的敏感性。此处展示了空白对照和CC-503菌株在碳源和氮源检测平板上的呼吸XY图和水平图，分别以青绿色和紫色表示。每个孔中的呼吸曲线反映了染料通过还原反应随时间变化的转化情况。A图中高亮的峰值代表该平板中乙酸盐作为唯一碳源被检出，这与衣藻（Chlamydomonas）相关文献报道一致。通过比较使用三种不同方法鉴定出的代谢物数量——即经过精细整理的衣藻代谢模型 iRC1080、飞行时间气相色谱质谱法（GC-TOF）以及表型微阵列实验，结果显示，三组数据之间仅有六种代谢物重叠，而 iRC1080 与表型微阵列实验组之间则有 149 种代谢物共同存在。这表明，尽管每种技术在代谢谱分析研究中均具有各自的优势，但表型微阵列实验组可成为获取新代谢信息的重要来源。所获得的信息已被用于扩展和完善代谢网络模型 iRC1080。在此，我们比较了iRC1080模型与扩展模型iBD1106的内容，包括反应数量、代谢物数量和基因数量。结果显示，我们的模型优化过程向新构建的网络中新增了254个以上的反应。这些反应被分类为氨基酸、二肽、三肽以及转运反应。新鉴定的代谢物被用于扩展代谢网络，并优化现有的莱茵衣藻代谢模型。表型微阵列实验可用于表征现有菌株及新分离菌株的代谢表型。此外，我们在微藻研究中所采用的实验方案可为其他物种代谢模型的优化提供指导。

high-throughput-metabolic-profiling-for-model-refinements

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于微藻模型改进的高通量代谢分析

本文描述了一种基于机械细胞破碎、溶剂法脂质提取、转酯化反应以及气相色谱对脂肪酸进行定性和定量分析的方法，用于测定微藻中的脂肪酸含量及组成。采用三棕榈酸甘油酯作为内标物，以校正提取过程中可能发生的损失以及转酯化反应不完全所造成的影响。...

微藻中脂肪酸含量与组成的分析

将微藻培养与工业烟气相结合，最终会将重金属和其他无机化合物引入培养基中。本研究介绍了一种用于确定重金属及无机污染物对在光生物反应器中培养的Nannochloropsis...

微藻生产力中重金属及其他无机污染物的定量分析

植物细胞壁的结构和化学特性被用于评估生物燃料和生物材料的理想原料。传统方法在处理大规模数据集时存在局限性。这些高通量的预处理、酶解糖化以及热解-分子束质谱分析方法，能够在减少实验时间和成本的同时，对大量生物质样品进行比较分析。...

木质纤维素生物质抗降解性变异的高通量筛选：总木质素、木质素单体及酶解糖释放

本文描述了一种采用二维气相色谱-飞行时间质谱法对藻类水热液化所生成生物原油中水相组分进行表征的方法。该方案也可用于分析快速热解、催化快速热解、催化脱氧及加氢处理所得液态产物中水相组分的化学组成。...

利用飞行时间质谱联用二维气相色谱对藻类水热液化水相组分进行定性表征

本文介绍了可用于估算相关动力学生长参数的台式光合生物反应器的组装过程和操作方法。该系统利用传感器、数据采集与控制单元以及开源数据采集软件，对pH值、光照和温度进行连续监测。...

用于动力学生长测试的台式藻类光合生物反应器的构建与设置：具备温度、光照和pH监测功能

本文介绍了一种构建实验室规模气泡柱式光生物反应器的方案，并利用该反应器培养微藻的方法。同时提供了测定微藻培养物生长速率和中性脂质含量的实验方法。...

气泡柱光生物反应器中绿藻的培养及中性脂质检测方法

对多种生物分子进行全系统分析，对于深入了解生物过程的功能与作用机制至关重要。本文详细描述了一种高通量提取方法，可从同步培养的衣藻（Chlamydomonas）单一样本中同时提取脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。...

一种用于深入分析绿色藻类Chlamydomonas reinhardtii同步培养物的多组学提取方法

在小试规模下进行无菌培养，有助于在后续工艺放大之前对微藻进行表征并优化其生产效率。光生物反应器可提供必要的控制条件，以确保微藻实验的可靠性与可重复性，并可改造用于安全培养利用城市或工业燃烧排放的腐蚀性气体（CO2、SO2、NO2）作为营养源的微藻。...

微型藻类在小型光生物反应器中利用腐蚀性烟道气的培养及生物量定量

本文描述了一种利用天然气发电厂烟气中的二氧化碳在开放式跑道池中培养微藻的方案。通过pH传感器控制烟气注入，利用光密度的实时测量监测微藻生长。...

将发电厂碳捕集与半自动化开放式跑道池耦合用于微藻培养

本文介绍了具有可定制光照条件的实验室光生物反应器（PBRs）的设计。通过连续测量体积氧产量，可对以碳酸氢盐为碳源的蓝细菌或微藻的生长进行实时监测。这些光生物反应器能够在实验过程中减少人为干预，实现快速、重复的实验室生长比较。...

在线生长监测与可定制光照条件的实验室光生物反应器操作

了解表型微阵列技术如何用于高通量代谢分析，以Chlamydomonas reinhardtii为模型生物改进微藻代谢网络模型。该方法可识别新反应和酶谱，为藻类生物学研究提供系统化的模型优化方案。

高通量代谢谱分析用于微藻模型的优化

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