为光遗传学实验构建简单通用的照明系统
2021年1月12日
该协议描述了如何使用PhyB和PIF3进行光遗传学实验以控制红光和远红光的基因表达。其中包括构建简单灵活的照明系统的分步说明，该系统可以使用计算机控制基因表达或其他光遗传学。
该系统允许研究人员轻松构建用于光遗传学实验的廉价且多功能的照明系统。该技术的优点包括能够使用跨越可见光近红外光谱的可用波长对LED照明时序进行编程，并且LED可用于各种环境 要构建电路，请将印刷电路板夹在辅助手上并插入跳线，将它们连接以形成A1和A3针孔到地面， D2 跳线插入 D6 针孔，电源加上 7 号跳线插入 A7 针孔。将端子弯曲 45 度并添加助焊剂。
焊接后，修剪电线的背面。将焊接的母线对线连接器的一端插入 A5 孔。然后将电阻的一端连接到 A5 孔。
将连接器的另一端接地。然后将电阻的另一端接地并焊接连接。对于 Arduino 连接器，将电线的末端压接到电线连接器，然后将压接的末端推过矩形连接器。
要设置 LED，请从下方加热，同时从顶部添加焊料，从而为电线镀锡。在大焊头上放置大量焊料，然后用焊头在含有助焊剂的触点处加热 LED 基座。几秒钟后，将焊料分别拖过每个触点，并使用发夹将黑线固定在阴极上。
将大量焊料放在大烙铁头上，然后将烙铁头压在导线上，直到 LED 底座上的焊料熔化。按住电线并取出烙铁，同时将电线固定到位。将少量焊膏放在焊盘上以进行 LED 连接，然后使用镊子将 LED 放在焊盘上。
将预镀锡的红线放在阳极上，然后用发夹夹住电线。如图所示，将焊料添加到大尖端，然后将尖端压在连接上，直到 LED 底座上的焊料熔化并且焊膏熔化并变成银。要制作 LED 导线，请在切割成一定长度的导线上放置一个 4.76 毫米的收缩管，在导线到线连接器上放置一个 3.18 毫米的收缩管。
剥离并在电线末端添加助焊剂。使用帮助手夹住电线到电线连接器，并用一端扭转连接器端。将材料焊接在一起，并以相同的方式将另一根电线连接到设置并焊接。
然后用胶带将 LED 线夹在 LED 底座下方的帮助手上。接下来，根据制造商的说明混合环氧树脂，并将环氧树脂铺在焊接的LED顶部。使用铲形钻头，在放置 LED 的盒子顶部钻一个 1.5 厘米的孔，并使用高速旋转工具在孔的一侧开一个缺口，为 LED 线腾出空间。
将 25 到 30 毫米的隐私膜粘贴到覆盖 LED 将照亮的孔的黑匣子上，并将 LED 从黑匣子外面粘在孔的顶部。对于四 LED 控制系统，在盒子盖上钻四个相距 3.81 厘米的 0.83 厘米孔，并使用高速旋转工具在左上角切一个 1.19 x 1.90 厘米的矩形孔。使用铲形钻头，在盒子背面钻一个 1.5 厘米的孔，然后将索环插入孔中。
对于计算机控制的LED，请用砂纸将微控制器粘在盒子中的区域以及微控制器支架的底部。将微控制器卡入支架上，然后将支架和盒子环氧树脂在一起，然后将支架固定在黑匣子中。然后将双面胶带放在夹子上并将夹子固定在盒子内。
在转染表达光敏色素B但不表达藻蓝蛋白胆蛋白的样品中，渗漏随着报告基因DNA数量的增加而增加。此外，当包括藻蓝蛋白胆蛋白染色质粒在内的整个光敏色素B基因开关被远红光照射时，荧光素酶表达也随着转染混合物中报告构建体数量的增加而增加。同样，当光敏细胞被红光照射时，荧光素酶表达也随着报告物量的增加而增加。
当比较红光处理细胞与远红光处理细胞的诱导水平时，发现随着报告物数量的增加，折叠激活略有降低。在构建电路时，必须仔细遵循每个步骤，并在焊接每个组件之前逐行仔细检查针孔编号。该协议可用于使用各种波长对许多类型的样品或光遗传学工具进行光学刺激，并允许对照明时间表进行编程。
概述
本协议描述了适用于光遗传学实验的多功能照明系统的构建，实现了对红光和远红光下基因表达的控制。提供了系统构建和LED照明编程的逐步说明。
关键研究组成部分
科学领域
- 光遗传学
- 基因表达控制
- 照明系统
背景
- 光遗传学允许使用光精确控制细胞功能。
- PhyB和PIF3是光反应基因调控的关键组件。
- LED可以为各种照明计划进行编程。
- 该系统旨在具有成本效益并可适应不同的实验设置。
研究目的
- 提供构建光遗传学照明系统的详细协议。
- 使研究人员能够使用特定波长的光控制基因表达。
- 促进光遗传学工具在不同实验环境中的使用。
使用的方法
- 构建LED控制的电路。
- 编程LED照明时间和波长。
- 组装用于自动控制的微控制器。
- 使用各种报告基因构建测试系统。
主要结果
- 成功构建了灵活的照明系统。
- 观察到较高的报告基因DNA量时萤光素酶表达增加。
- 展示了使用红光和远红光对基因表达的控制。
- 系统允许对不同样本类型进行光学刺激。
结论
- 该协议提供了一种可靠的光遗传学实验方法。
- 研究人员可以利用该系统进行基因调控的各种应用。
- 严格遵守协议确保了成功的结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
