微流控装置中电场诱导的神经前体细胞分化

本研究提出了一种在微流控系统中仅通过直流脉冲刺激诱导神经前体细胞分化的实验方案。该技术有助于缩短实验准备时间，并减少样品和试剂的使用量。此外，MOE芯片适用于共聚焦显微镜观察。

简单的直流脉冲处理可以控制小鼠神经前体细胞的命运，并可用于开发针对神经系统疾病的治疗策略。首先，使用适当的软件绘制各个PMMA层和双面胶带的图案。打开二氧化碳激光刻划仪，并将其连接到个人计算机。

使用软件打开设计好的图案文件。将PMMA片材或双面胶带放置在激光划片机的平台上，然后使用自动对焦工具将激光聚焦到PMMA片材或双面胶带的表面。选择激光划片机作为打印机，随后启动激光划片机，开始对PMMA片材或双面胶带进行直接烧蚀。

移除PMMA板材上的保护膜，并使用氮气清洁表面。若需将多层PMMA板材键合，可将三片厚度为1毫米的PMMA板材堆叠，在热键合仪中于110摄氏度下以每平方厘米5千克的压力键合30分钟，形成流体通道或电刺激通道组件。使用快速固化的氰基丙烯酸酯胶水，将12个接头分别粘接到MOE芯片组件第一层的各个开口处。

在组装芯片前，使用紫外线照射对1 mm的PMMA基底、双面胶带以及3 mm光学级PMMA进行30分钟的消毒。使用双面胶带将1 mm的PMMA基底粘附在3 mm光学级PMMA上，完成PMMA组件的组装。再用双面胶带将已清洁的盖玻片粘附到PMMA组件上。

用白色手指拧紧的塞子密封琼脂桥适配器的开口。通过中等大小的进液口和出液口适配器，将平底连接器连接到MOE芯片组件上，然后将锥形鲁尔适配器连接至三通旋塞阀。使用一个3毫升注射器，将其连接至培养基入口的三通旋塞阀，加入2毫升0.01% PLL溶液，并将一个空的3毫升注射器连接至培养基出口的三通旋塞阀。

用PLL溶液填充细胞培养区域，并缓慢地前后泵入包被溶液。关闭两个三通旋塞，将溶液密封在培养区域内。将MOE芯片置于充满5%二氧化碳气氛的培养箱中，在37摄氏度下孵育过夜。

打开两个三通旋塞，使用两个注射器手动来回推动包被液，以冲洗通道中的气泡。将三毫升完全培养基吸入一个连接至培养基入口三通旋塞的三毫升注射器中，并注入以替换细胞培养区域中的包被液。将白色手拧堵头更换为鲁尔接头，并注入3%热琼脂糖以充满该接头。

将鲁尔锁紧式注射器连接至鲁尔接头，并通过黑色橡胶烟斗注入3%热琼脂糖，以填满鲁尔锁紧式注射器。静置10至20分钟，使琼脂糖冷却并凝固。将接种细胞的MOE芯片安装到固定在程序化XYZ电动载物台上的透明ITO加热器上，该载物台维持在37摄氏度。

通过培养基出口手动泵入将mNPCs注入MOE芯片，然后将接种细胞的MOE芯片置于ITO加热器上孵育四小时。使用电线将电场多路复用器（EF multiplexer）连接到芯片上的电极，进而连接至MOE芯片。将电场多路复用器和函数发生器连接至放大器，以输出方波直流脉冲。

移除MOE芯片上所有平底连接器和接头，并用PBS填充接头，然后用帕拉膜密封接头开口。免疫染色后，使用共聚焦荧光显微镜观察细胞。直流脉冲刺激导致mNPCs在干细胞维持培养基中同时分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

此处展示了对照组和刺激组中神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的百分比。经过直流电脉冲处理后，在DIV 7时，刺激组中mNPCs表达的神经元数量显著升高；在DIV 3时，星形胶质细胞数量升高；在DIV 7和DIV 14时，少突胶质细胞水平也相对高于对照组。由30至40个细胞组成的神经球更适用于启动mNPC的分化。

mNPCs 的过度生长会损害细胞在分化过程中的存活。