小脑区域解剖用于分子分析

传统的分子学研究通常基于整个小脑组织提取物进行，这可能会掩盖小脑不同区域之间的特异性差异。本方案可实现对小脑各个区域的分别评估，有助于探索可能介导这些区域在多种行为及疾病进展中独特作用的分子机制。该技术的主要优势在于，能够快速、可重复地分离出四个小脑区域：小脑深部核团、小脑蚓部的前部和后部皮层，以及小脑半球皮层。

处死小鼠并断头后，从鼻部开始沿头部正中矢状线用刀片做一纵向切口，一直向后延伸。分离皮肤，并用刀片将两侧肌肉剪除，向下切割至耳道以下。使用解剖剪修剪多段脊髓组织，直至脑干与小脑相接处，注意不要损伤小脑。

将血管剪的一侧刀片插入脑干与脊柱之间的间隙，朝耳道方向剪开，同时在剪切时轻轻上抬，以尽量减少对组织的损伤。继续沿颅骨边缘向嗅球方向剪开。用钝头镊子轻轻剥离颅骨后部，以暴露脑的后部区域和小脑。

将钝头镊子沿颅骨切缘放置，将颅骨向上掀起并翻离脑组织。使用血管剪和钝头镊子修剪剩余的颅骨，清除脑表面大部分颅骨。用显微铲轻轻抬起脑组织，以分离残留颅骨中的嗅球，并切断视束纤维。

此时大脑应可轻松取出。将大脑放入置于冰上的培养皿中，清除任何残留的颅骨或其他碎片。将大脑背侧朝上，轻轻放入脑切片模具中。

确保其在包埋盒中处于水平位置，并且中线位于中央。将一片刀片沿矢状面中线放置，确保刀片一直推到底部。在第一片刀片的一侧1毫米处放置另一片刀片。

在大脑的一侧放置另外两片刀片，共放置三片刀片，每片之间相距一毫米。在另一侧重复此操作。小心抓住刀片的前端和后端，垂直向上将其从基质中提起。

将剃刀刀片外侧的组织弃去。一次小心地将一片剃刀刀片从其他刀片上缓慢分离，注意不要损坏组织切片。用微型刮勺将组织切片从剃刀刀片上轻轻推下，并转移至载玻片上。

应收集六片矢状脑切片。最前部的侧切片应可见小脑深部核团（DCN）。为分离DCN，将200微升移液器吸头垂直置于DCN上方，用力向下压入组织，并向各个方向轻轻摇动。

提起移液器，目视确认组织是否位于吸头内。用一根手指按住吸头顶部并向下推压，使组织突出。将吸头插入正确标记的微量离心管中，并确保组织穿孔位于管底。

对剩余的三个部分重复此操作，将DCN穿孔组织置于同一管中。用液氮速冻该管。在DCN已被提取的小脑切片中，移除周围剩余的脑组织。

使用钝头镊子轻轻夹取这些半球状小脑皮层切片，放入相应的微量离心管中，然后进行速冻。对于最后两个蚓部切片，推开周围的脑组织，仅保留小脑。使用剃刀刀片，将前唇与后唇分离切开。

确保切口位于唇部六区形成之后，且不包含唇部十区。使用钝头镊子，将小脑前部皮层组织和小脑后部皮层组织小心放入相应的微量离心管中，并将管子置于液氮中5分钟，进行速冻。将微量离心管放在冰上，以防止组织过快融化，随后向管中加入150 µL冷的RNA提取液，用灭菌研磨杵进行匀浆处理。

组织匀浆后，用移液器反复吹打溶液，确保无完整组织残留。此外，用胰岛素注射器反复抽吸数次，以进一步破碎任何细小组织碎片。加入另外350 µL裂解试剂，吹打混匀，室温静置5分钟。

向离心管中加入 150 微升氯仿，剧烈振荡，然后静置 2 至 3 分钟。在 15 摄氏度下以 12,000 ×g 离心 10 分钟。小心地从离心机中取出离心管，并将离心机温度设置为 4 摄氏度。

将澄清的水相转移至新离心管中，注意不要搅动不透明的中间相。保存或弃去管中剩余的溶液。按照1:2的比例加入100%异丙醇，通过上下吹打充分混匀。

将样品在室温下静置10分钟，使RNA从溶液中沉淀出来。在12,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，所有离心管应保持相同的方向放置，以便于观察沉淀。离心结束后，小心取出离心管，用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。

沉淀物呈凝胶状且不易观察，因此需根据离心管在离心机中的方向估计其位置。吸除全部上清液后，加入500 µL 75%乙醇，短暂涡旋混匀，然后在4°C条件下以7,500 × g离心5分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀物。

打开管盖，使样品干燥 5 到 10 分钟。干燥后，将沉淀物重新悬浮于无 DNA 酶的水中，DCN 样品加 20 µL，其余样品均加 30 µL。将样品储存于 -80 °C，直至进一步分析。

本方案用于分离小鼠小脑的四个不同区域，并探究基因表达的区域差异。采用实时定量PCR检测了醛缩酶C、小清蛋白和KCNG4的表达水平。醛缩酶C在小脑后叶蚓部的表达水平较高。

但在与全小脑组织切片相比时，DCN和蚓部前区的表达较低。与全小脑提取物相比，小清蛋白在DCN、蚓部前区、蚓部后区以及半球小脑皮层中均存在。KCNG4在DCN和蚓部内部显著富集，但在蚓部后区或半球中未见富集，相较于全小脑提取物而言。

为了直接比较醛缩酶C在小脑皮层中的表达情况，将各区域的表达水平与前叶蚓部进行对比。结果显示，醛缩酶C在后叶蚓部的表达水平显著升高，在小脑半球中也呈升高趋势。从这些区域提取的RNA也可用于RNA测序实验。

对这些小脑区域进行RNA测序，将能够更详细地揭示这些区域分子机制及其特定功能的基础，以及它们在疾病中易损性方面的潜在差异。