Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

该方法适用于利用蛙卵提取物对细胞质动态进行活体成像，能够研究细胞质中的空间模式信息。样品可被塑造成厚度均匀且可调的薄层，并可在二维视野或三维体积范围内进行成像。该方法成本低廉且易于实施。

首先，使用滚筒涂布器将一层FEP胶带粘贴到玻璃载玻片上。用干净的剃刀片将边缘多余的胶带切除。接着，以相同方法制备涂有FEP胶带的盖玻片。

然后将双面粘性成像垫贴在载玻片涂有FEP胶带的一侧，暂不揭去保护衬层。将卵转移至一个400毫升的玻璃烧杯中，并通过倾倒尽可能去除卵孵化缓冲液。随后将卵在100毫升新鲜配制的脱胶液中孵育，并轻轻摇动。

大约三分钟后，倒掉溶液，加入 100 毫升新鲜的脱胶液。继续孵育，直至卵子紧密聚集，但避免卵子在脱胶液中总时间超过五分钟。孵育结束后，尽可能去除脱胶液，并用 0.25x MMR 缓冲液清洗卵子。

轻轻旋转混匀卵子，然后倒掉缓冲液。重复数次，直至洗涤过程中总共使用一升缓冲液。接着，用总共400毫升的卵裂解缓冲液将卵子洗涤数次，在每次洗涤之间去除异常的卵子。

然后使用带有宽口吸头的移液管将卵转移至含有1毫升卵裂解缓冲液的17毫升圆底离心管中。在临床离心机中以400 ×g离心15秒，使卵沉淀。随后用巴斯德吸管尽可能吸除卵裂解缓冲液。

确定卵团的大致体积，然后在卵团上方直接加入抑蛋白酶肽、亮抑蛋白酶肽和细胞松弛素B，每种终浓度为每毫升5微克，同时加入放线菌酮至终浓度为每毫升50微克。将离心管置于水平转子中，在4°C、12,000 g条件下离心15分钟，压碎卵团。

接下来，将一支18号针头连接到注射器上。针尖斜面朝上，从细胞质层底部的侧面刺入离心管，缓慢吸取以回收提取物。将回收的细胞质提取物转移至新的微量离心管中，并置于冰上保存。

准备成像时，在提取物中加入所需的试剂和荧光成像探针。从已准备好的载玻片的成像间隔垫上移除顶部保护层，并在孔中央滴加约七微升提取物。立即盖上带有FEP膜的盖玻片，使FEP面朝向提取物以密封孔，随后迅速进行成像。

将载玻片置于带有电动载物台和数字相机的倒置或正置显微镜上。在明场和荧光通道中，按所需的时间间隔和空间位置对提取物进行成像。此处展示的是利用非洲爪蟾（xenopus laevis）卵提取物研究间期胞质自组织的延时成像实验。

在室温下孵育约20分钟后，明场和线粒体通道中均可观察到细胞质成分（如光散射物质）减少的区域。在室温下孵育约60分钟后，应已形成由类似细胞的区室构成的空间模式，微管形成中空的花环样结构，线粒体则被清晰地分配到各个区室中。此处展示了在玻璃表面有无FEP胶带的成像腔室中提取物性能的对比。

在用FEP胶带固定玻璃制成的腔室中，提取物自组织形成了正常的类细胞结构。而在未用FEP胶带覆盖玻璃表面的腔室中，提取物显示出异常的明场和微管结构，且随时间推移逐渐变得紊乱。在GST-mCherry-NLS蛋白的核输入方面未观察到显著差异。

需要牢记的重要事项是使用FEP胶带对玻璃表面进行钝化处理，并在提取物制备过程中去除所有不良样本。通过该系统，我们可以轻松控制提取物样品的厚度，为利用光片显微镜进行三维细胞质模式成像铺平了道路。