Name: 研究蛋白质和微RNA调制对脂肪细胞功能的影响的脂肪细胞培养模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习使用反向转染技术将siRNA和microRNA模拟物导入小鼠3T3-L1脂肪细胞，以研究蛋白质和microRNA表达对胰岛素信号传导及葡萄糖摄取的影响。该方法转染效率超过70%，适用于代谢疾病研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、蔚蓝海岸大学（Université Côte d'Azur）以及法国国家科研署（ANR）通过“未来投资计划”卓越实验室项目（Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01）和卓越性倡议（Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001）资助。J.J. 获得法国糖尿病学会（Société Francophone du Diabète, SFD）、法国肥胖研究与探索协会（Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité, AFERO）、多机构主题研究所健康技术研究所（Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé, ITMO）以及本杰明·德莱瑟基金会（Fondation Benjamin-Delessert）的资助。J.G. 获得ANR-18-CE14-0035-01项目资助。J-F.T. 获得ANR项目ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01资助以及法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale）团队项目（Equipe FRM, DEQ20180839587）资助。我们还感谢由滨海阿尔卑斯省议会（Conseil Départemental des Alpes-Maritimes）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区（Région PACA）资助的C3M影像核心设施，该设施同时也得到GIS IBiSA显微与影像平台蔚蓝海岸（Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur, MICA）的支持。

注意：所有实验步骤均须在超净细胞培养工作台中采用无菌技术进行。有关所有试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 小鼠3T3-L1成纤维细胞向脂肪细胞的分化
<ol>
	<li>在100 mm培养皿中使用不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10%新生小牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养3T3-L1成纤维细胞（图1A）。将培养皿置于组织培养孵箱中（7% CO2，37 °C）。</li>
	<li>细胞融合后两天，更换培养基，改为含0.25 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、0.25 µM地塞米松、5 µg/mL胰岛素和10 µM罗格列酮的DMEM培养基（不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素）。 
	注意：当每100 mm培养皿接种300,000个细胞时，通常需要5天达到融合状态。</li>
	<li>两天后，更换为含5 µg/mL胰岛素和10 µM罗格列酮的DMEM培养基（不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10% FCS和1%青霉素-链霉素），继续孵育2天。随后每隔两天用不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10% FCS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基更换培养液（图1B）。</li>
	<li>在诱导分化程序开始后7–8天转染3T3-L1脂肪细胞。 
	&#8203;注意：转染前应确保细胞达到较高的分化水平（&#62;80%），以避免残留的成纤维细胞在转染后继续增殖，从而导致细胞群体不均一，可能影响实验结果的准确性。</li>
</ol>
2. 预包被板的制备
<ol>
	<li>转染前一天或转染前数小时，使用浓度为 1 mg/mL 的储备液，将 I 型胶原配制成 100 µg/mL 的 30% 乙醇溶液。每孔 12 孔板加入 250 µL 胶原溶液，每孔 24 孔板加入 125 µL，然后将溶液均匀铺展于孔底表面。</li>
	<li>将培养板置于超净工作台内，敞盖放置直至胶原溶液完全干燥。用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤两次。 
	&#8203;注意：可购买预包被胶原的培养板。</li>
</ol>
3. 转染混合物的制备
注意：siRNA 的终浓度范围为 1 至 100 nM（每孔 12 孔板加入 1 至 100 pmol siRNA）。miR 模拟物的终浓度为 10 nM（每孔 10 pmol）。在正式实验前应确定每种 siRNA、miR 模拟物或其他寡核苷酸的最佳浓度，以避免脱靶效应。转染实验应设置三个重复孔，以便对结果进行统计学分析。所有试剂应准备过量，以弥补移液过程中的正常损耗。
<ol>
	<li>用移液器将siRNA（或其他寡核苷酸）与改良的最低必需培养基混合（体积/体积比）（表1）。室温孵育5分钟。</li>
	<li>将转染试剂和改良的最低必需培养基加入siRNA中，用移液器轻轻混匀（表1）。室温孵育20分钟（在此期间，继续进行第4节操作）。将转染混合物加入胶原包被板的每孔中。</li>
</ol>
4. 3T3-L1 脂肪细胞的制备
<ol>
	<li>用 D-PBS 将 100 mm 培养皿中的细胞洗涤两次。向细胞中加入 5 倍体积的胰蛋白酶（每 100 mm 培养皿加 1 mL），确保胰蛋白酶覆盖整个培养皿表面。等待 30 秒后，小心吸除胰蛋白酶。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C 培养箱中孵育 5–10 分钟。轻敲 100 mm 培养皿以使细胞脱落。</li>
	<li>加入 10 mL 不含丙酮酸、含 25 mM 葡萄糖、10% 胎牛血清（FCS）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基以中和胰蛋白酶。用移液器轻轻吹打培养基，使细胞完全脱落并混匀细胞悬液。</li>
	<li>使用 Malassez 血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞浓度调整为 6.25 × 105 个细胞/mL 培养基。每孔加入 800 µL 细胞悬液至 12 孔板（每孔 5 × 105 个细胞），或每孔加入 400 µL 细胞悬液至 24 孔板（每孔 2.5 × 105 个细胞），孔内需预先加入转染混合物。 
	注：一个 100 mm 培养皿的脂肪细胞可用于制备一块 12 孔板或一块 24 孔板。一个 100 mm 培养皿通常含有 6–7 × 106 个脂肪细胞，相当于 12 孔板每孔 5 × 105 个脂肪细胞。</li>
	<li>将培养板置于细胞培养箱（7% CO2、37 °C）中孵育，24 小时内不要扰动细胞。次日，小心吸除上清液，并更换为新鲜的不含丙酮酸、含 25 mM 葡萄糖、10% FCS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基。 
	&#8203;注：也可将细胞接种至胶原预包被的 48 孔板或 96 孔板，但在更换培养基时需更加小心，以避免脂肪细胞脱落。</li>
</ol>
5. 转染3T3-L1脂肪细胞的功能分析
<ol>
	<li>在转染siRNA或miR模拟物后24-48小时和48-96小时，分别检测mRNA和蛋白质水平的目标基因敲低效果。</li>
	<li>对转染的脂肪细胞进行功能分析，以研究胰岛素信号传导、葡萄糖摄取、脂肪因子分泌、脂解作用和脂质生成。</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种成熟脂肪细胞分化与转染的详细实验方案。这种反向转染方法是一种简单、经济且高效的手段，可用于将寡核苷酸（包括但不限于siRNA、micro-RNA模拟物和抗micro-RNA）转染入3T3-L1脂肪细胞，而3T3-L1是公认最难转染的细胞系之一。该方法存在一些需要考虑的局限性。本方案在质粒DNA转染方面效率较低，因此限制了其在功能获得性研究中的应用。尽管包括3T3-L1细胞系在内的小鼠细胞系通常被用于体外研究脂肪细胞功能，但小鼠组织中micro-RNA的表达模式和活性常与人类存在差异；这一情况在原代细胞和细胞系中均存在。此外，将3T3-L1成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞所使用的培养基需要包含非生理性的激素混合物（胰岛素、地塞米松、IBMX和罗格列酮），且分化后的细胞在形态上与体内成熟的脂肪细胞明显不同：它们呈现多房性脂滴，而非单房性脂滴。这可能解释了体外与体内研究之间在基因表达和细胞反应方面存在的一些差异。
与电穿孔相比，使用这种反向转染方法的一个优势在于成本较低。实际上，该方法所用试剂价格更低，且反向转染的高效率减少了所需寡核苷酸的用量，同时无需电穿孔仪等昂贵设备。此外...

肥胖被认为是多种代谢性疾病的主要风险因素，包括胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（T2D）和心血管疾病1。目前的治疗方法未能遏制这些疾病日益增长的发病率，肥胖和糖尿病患者的胰岛素抵抗管理仍然是重要的临床问题。脂肪组织在能量稳态调控中起关键作用，其在肥胖状态下的病理性扩张会促进胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生2,3。这凸显了深入理解脂肪细胞功能障碍相关分子机制的必要性，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。许多研究已探讨了编码蛋白质的RNA在脂肪细胞生理功能中的作用及其与肥胖的关联。
近年来，非编码RNA（ncRNA），尤其是微小RNA（miR）的发现，推动了基因表达调控机制相关新概念的形成。研究表明，ncRNA是脂肪细胞功能的重要调控因子，其表达失调在代谢性疾病中发挥重要作用4。因此，调控脂肪细胞中蛋白质和ncRNA的表达对于解析其在脂肪细胞功能中的作用及其对2型糖尿病（T2D）等病理过程的影响至关重要。然而，在体内以及原代脂肪细胞中调控蛋白质和ncRNA的表达仍极具挑战性，这促使研究者更倾向于使用体外脂肪细胞模型。
小鼠3T3-L1成纤维细胞可轻松分化为成熟、有功能且对胰岛素敏感的脂肪细胞，这是一种被广泛研究的细胞系，常用于探讨脂肪细胞的功能（如胰岛素信号传导、葡萄糖摄取、脂解作用以及脂肪因子分泌）5,6,7,8,9,10。这些特性使3T3-L1脂肪细胞成为一种理想的模型，可用于调控蛋白编码基因和非编码RNA的表达，以解析其在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。然而，尽管使用市售转染试剂可轻松实现3T3-L1成纤维细胞的转染，但分化后的3T3-L1脂肪细胞却是最难转染的细胞系之一。因此，许多针对3T3-L1细胞进行基因表达调控的研究主要集中于脂肪细胞分化过程，而非脂肪细胞功能本身。
长期以来，转染脂肪细胞唯一有效的方法是电穿孔法5，该方法操作繁琐、成本高昂，且可能造成细胞损伤。本文报道了一种使用常规转染试剂的反向转染技术，该方法可减少转染操作时间，对细胞活力无影响，且成本远低于电穿孔法。本方案特别适用于小干扰RNA（siRNA）及其他寡核苷酸（如micro-RNA模拟物（miR模拟物）和抗miR）的转染。反向转染方案的原理是：先将转染试剂与寡核苷酸在细胞培养板中孵育形成复合物，随后将成熟的脂肪细胞接种至孔中。随后，脂肪细胞在寡核苷酸/转染试剂复合物存在的情况下重新贴附于培养板表面。这种简单、高效且经济的方法可用于研究蛋白编码RNA和miR在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。

<table><tbody><tr><td>12孔组织培养板</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶（10倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>用 D-PBS 稀释至 5 倍体积</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell 非靶向对照组</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>牛皮I型胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科的&amp;nbsp; 改良型伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4.5 g/L D-葡萄糖；L-谷氨酰胺；不含丙酮酸盐</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FAM标记的阴性对照si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>游离甘油检测试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>甘油标准溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HSP90 抗体</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-131119</td><td>稀释倍数：0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>优化型最低基本培养基（Opti-MEM）</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素，人重组</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-RNA 模拟物</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript 引物检测 Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript 引物检测 Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus 小鼠 Plin1 siRNA SMARTpool</td><td>Horizon Discovery</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin-1 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>3470</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr><tr><td>培养皿 100 mm × 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9272</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr><tr><td>PKB 磷酸化 Thr308 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9275</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr><tr><td>罗格列酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂（INTERFERin）</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-tubulin 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6199</td><td>稀释倍数：0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Vamp2 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB5136</td><td>稀释倍数：0.1 &amp;micro;g/mL</td></tr></tbody></table>

一种用于研究蛋白质和微小rna调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

脂肪细胞功能的改变参与了包括2型糖尿病和胰岛素抵抗在内的代谢性疾病的发病机制。这凸显了深入理解脂肪细胞功能障碍相关分子机制的必要性，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。调控蛋白质和微小RNA（micro-RNAs）的表达 在 脂肪细胞的培养与操作仍极具挑战性。本文介绍了一种将小鼠成纤维细胞分化为成熟脂肪细胞的方案，并通过使用小干扰RNA（siRNA）和micro-RNA模拟物（miR mimic）寡核苷酸进行反向转染，以调控成熟脂肪细胞中蛋白质和micro-RNA的表达。该反向转染方案包括：先在细胞培养板中将转染试剂与寡核苷酸孵育形成复合物，随后将成熟脂肪细胞加入其中。脂肪细胞在寡核苷酸/转染试剂复合物存在的情况下重新贴附于培养板表面。转染后的3T3-L1成熟脂肪细胞可用于胰岛素信号通路、葡萄糖摄取、脂质生成及脂解等功能分析，以研究蛋白质或micro-RNA调控对脂肪细胞功能的影响。

采用此处所述的反向转染方法在3T3-L1脂肪细胞中调控蛋白或微小RNA的表达后，已证实脂肪细胞在转染后仍能保持其形态图1B，C）。事实上，转染后2天，脂肪细胞已充分铺展并贴附于培养板上，呈现出多房性脂滴，这是成熟3T3-L1脂肪细胞的典型特征。转染与未转染的脂肪细胞之间的脂质含量无显著差异。图1D，E）。此外，分化标志物的mRNA表达，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（Pparγ2), 脂联素 （Adipoq），葡萄糖转运蛋白4或溶质载体家族2成员4（Slc2a4），胰岛素受体底物1（Irs1），脂滴包被蛋白-1（perilipin-1）Plin1) 与未转染的脂肪细胞相比，在转染细胞中保持不变（图1F。这种反向转染方案效...

本文介绍了一种将寡核苷酸（如小干扰RNA（siRNA）、microRNA模拟物（miRs）或抗microRNA（anti-miR））导入成熟脂肪细胞以调控蛋白质和microRNA表达的实验方案。

一种用于研究蛋白质和微小RNA调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型

脂肪细胞功能的改变参与了包括2型糖尿病和胰岛素抵抗在内的代谢性疾病的发病机制。这凸显了……

本方案可实现对分化成熟的脂肪细胞中的蛋白质或微小RNA（microRNA）表达进行调控，以研究其在脂肪细胞功能中的作用。这种反向转染方法是一种简单、经济且高效的将寡核苷酸转染至小鼠3T3-L1脂肪细胞的技术。该方法也可应用于已分化为脂肪细胞的人源前脂肪细胞。演示该实验步骤的是本实验室的技术员 Melanie Gaudfrin。在100毫米培养皿中培养3T3-L1成纤维细胞，使用不含丙酮酸钠的DMEM培养基，含25毫摩尔葡萄糖、10%新生小牛血清以及1%青霉素和链霉素。将培养皿置于37摄氏度、7%二氧化碳的组织培养孵箱中培养。融合后两天，更换培养基，替换为不含丙酮酸盐、含25毫摩尔葡萄糖、10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素的DMEM，并添加0.25毫摩尔IBMX、0.25微摩尔地塞米松、5微克/毫升胰岛素和10微摩尔罗格列酮。将培养皿孵育两天。两天后，更换培养基为不含丙酮酸盐、含25毫摩尔葡萄糖、10%FCS和1%青霉素-链霉素的DMEM，并添加5微克/毫升胰岛素和10微摩尔罗格列酮，继续孵育两天。每两天用不含丙酮酸、含25毫摩尔葡萄糖、10% FCS以及1%青霉素和链霉素的DMEM培养基喂养细胞，并将细胞置于培养箱中培养。转染前一日或数小时前，从1毫克/毫升的储备液中用30%乙醇配制浓度为100微克/毫升的I型胶原溶液。每孔加入250微升胶原溶液至12孔板，或每孔加入125微升至24孔板，并将溶液均匀铺布于孔表面。将培养板去盖后置于超净台中，直至胶原蛋白完全干燥。随后用D-PBS洗涤两次。用改良的最低必需培养基重悬siRNA，混匀后于室温孵育5分钟。将转染试剂和改良的最低必需培养基加入siRNA中，用移液器混匀。室温孵育20分钟。然后将转染混合物加入到每孔胶原蛋白包被的培养板中。用 D-PBS 将 100 毫米培养皿中的细胞洗涤两次。向细胞中加入 5 倍体积的胰蛋白酶，确保胰蛋白酶完全覆盖整个培养皿表面。等待 30 秒后，小心吸除胰蛋白酶。将培养皿置于37摄氏度培养箱中孵育5至10分钟。然后轻敲培养皿以使细胞脱落，避免损伤细胞。加入10毫升不含丙酮酸盐、含25毫摩尔葡萄糖、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，以中和胰蛋白酶。轻轻吹打培养基，使细胞脱离并混匀细胞悬液。使用马氏计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞浓度调整为每毫升培养基含62.5万个细胞。每孔加入800微升细胞悬液至12孔板中，或每孔加入400微升细胞悬液至含有转染混合物的24孔板中。将培养板放入细胞培养箱中孵育，24小时内不要扰动。次日，小心地将上清液更换为新鲜的DMEM培养基，该培养基不含丙酮酸，含25毫摩尔葡萄糖、10% FCS以及1%青霉素和链霉素，然后将细胞重新放回培养箱中。在转染siRNA或miR后，通常检测靶基因敲低效果的时间点为：mRNA水平在24至48小时，蛋白质水平在48至96小时。可在转染的脂肪细胞上进行多种功能实验，包括胰岛素信号传导、葡萄糖摄取、脂肪因子分泌、脂解作用和脂质生成。研究表明，脂肪细胞在转染后仍能保持其形态学特征。转染两天后，脂肪细胞呈现多房室脂滴结构，且转染组与未转染组之间的脂质含量无显著差异。与未转染的脂肪细胞相比，转染细胞中多种分化标志物的mRNA表达水平未发生变化。反向转染方案效率较高，超过70%的脂肪细胞被成功转染。在使用针对Perilipin-1的siRNA转染后第3天，Perilipin-1的mRNA水平下降了70%，蛋白水平下降了63%。转染后第4天通过荧光显微镜分析Perilipin-1的表达，发现其表达量较对照组脂肪细胞下降了92%。本文展示了利用模拟 microRNA 的寡核苷酸对脂肪细胞进行反向转染，以上调 miR-34a 表达的方法。miR-34a 的过表达导致 VAMP2 蛋白表达水平降低 50%。在 3T3-L1 脂肪细胞中，Perilipin-1 的敲低可增加基础脂解作用，而 miR-34a 的过表达则抑制胰岛素诱导的蛋白激酶 B 磷酸化及葡萄糖摄取。进行转染时，必须确保脂肪细胞达到高水平的分化状态，并对新分化的脂肪细胞进行转染，同时需仔细监控胰蛋白酶对脂肪细胞的处理过程。转染后，可对脂肪细胞进行功能实验，以研究蛋白质或microRNA操作对胰岛素信号传导、葡萄糖摄取、脂质生成和脂解作用的影响。

an-adipocyte-cell-culture-model-to-study-impact-protein-micro-rna

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

研究蛋白质和微RNA调制对脂肪细胞功能的影响的脂肪细胞培养模型

脂肪组织（AT）可影响机体全身的稳态，因此了解脂肪细胞分化与功能的分子机制具有重要意义。本文提供了一种实验方案，通过分析脂肪细胞的稳态、分化过程以及缺氧暴露（作为诱导脂肪细胞凋亡的模型），以深入理解这些生物学过程。...

通过分化与凋亡稳态调节成年生物体脂肪细胞数量的机制

目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。...

一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

膜成熟脂肪细胞聚集体培养（MAAC）是一种培养成熟人脂肪细胞的新方法。本文详细介绍了如何从人脂肪组织中分离脂肪细胞，以及如何建立MAAC培养体系。...

利用膜成熟脂肪细胞聚集体培养法（MAAC）分离与培养人成熟脂肪细胞

我们描述了一种三维人细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，该系统可用于解析基质和脂肪细胞在脂肪组织代谢表型形成中的作用。...

一种用于研究基质-细胞代谢串扰的人源三维细胞外基质-脂肪细胞共培养模型

本方案描述了从小鼠皮下脂肪中分离前脂肪细胞、将其分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗的方法。通过蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路中相关蛋白的磷酸化/活化水平，以评估胰岛素作用。该方法可直接测定原代脂肪细胞中的胰岛素抵抗/敏感性。...

原代培养中分化的鼠脂肪细胞：胰岛素抵抗模型

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

本文介绍了一种从人皮下脂肪组织中分离、培养和表型鉴定微血管内皮细胞（hSATMVECs）的实验方案。此外，还描述了一种hSATMVECs与脂肪细胞相互作用的实验模型。...

研究人类皮下脂肪组织中脂肪内皮细胞与脂肪细胞的相互作用

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。...

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

利用操作性条件反射范式，通过播放随机点运动图和计算机生成的无脊椎动物视频来测试蜥蜴的视觉敏感性。...

测试蜥蜴对运动速度和方向的视觉敏感性

使用杰基龙作为模型生成的计算机模拟刺激。...

计算机生成的动物模型刺激材料

学习使用反向转染技术将siRNA和microRNA模拟物导入小鼠3T3-L1脂肪细胞，以研究蛋白质和microRNA表达对胰岛素信号传导及葡萄糖摄取的影响。该方法转染效率超过70%，适用于代谢疾病研究。

一种用于研究蛋白质和微小RNA调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型

探索更多视频