Name: 在体内评估小鼠的粘液清除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习使用SPECT/CT双模态成像技术在小鼠体内评估气道粘液纤毛清除功能的方法。该方案具有可重复性，适用于多种疾病模型和药物效应研究，为呼吸系统疾病研究提供可靠的实验手段。

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M.Z. 和 K.S.F. 的工作获得了匹兹堡大学临床与转化科学研究所颁发的匹兹堡创新挑战（PInCh）项目资助，以及授予 M.Z. 的美国国立心肺血液研究所 R01 项目基金 HL153407 的支持。

在开展本出版物中所述的任何动物实验之前，匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会已批准所有相关的动物实验方案。
注意：本方案详细介绍了如何利用配备双模态SPECT/CT扫描仪的放射性核素成像技术进行体内黏膜纤毛清除研究。所展示的技术包括系统校准、小鼠麻醉、小鼠气管插管、将同位素注入肺部、双模态成像、图像配准以及数据分析。
1. SPECT/CT 系统设置
<ol>
	<li>设计合适的实验流程，并在使用活体动物进行实验前完成准备工作。
	<ol>
		<li>采用包含60个投影的SPECT采集，投影间步进角度为6o，旋转半径为40 cm。CT采集包含220个投影，投影间角度为1.6o。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保系统已安装适用于小鼠和SPECT成像的正确MWB准直器。若安装了不合适的准直器，请使用准直器向导安装正确的准直器。</li>
	<li>运行必要的系统校准，以准备系统投入使用。 
	注意：扫描仪的SPECT和CT组件均需校准。CT组件需每天进行一次射线源 conditioning 和暗场/亮场（D/L）校准，每两周进行一次中心偏移（COS）校准，并每月评估一次X射线硬件。SPECT组件需每年校准一次。
	<ol>
		<li>在CT校准过程中（补充CT校准菜单），勾选评估X射线硬件选项以评估X射线硬件。</li>
		<li>在CT校准过程中（补充CT校准菜单），勾选执行射线源conditioning选项以进行射线源conditioning。</li>
		<li>在CT校准过程中，勾选实验所用CT采集协议旁边的D/L选项以执行D/L校准，并取消勾选所有其他协议（补充CT校准菜单）。</li>
		<li>在CT校准过程中，将床更换为校准环工具，在运动控制设置中调整床类型设置以匹配当前配置，并勾选实验所用CT采集协议旁边的COS选项，同时取消勾选所有其他协议（补充CT校准菜单，补充校准环）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠插管与灌注
<ol>
	<li>称重待扫描的小鼠。若需扫描多只小鼠，请使用耳缘打孔或尾部标记等方法对小鼠进行标记，以便识别。</li>
	<li>在气体麻醉室中使用1.5%异氟烷（O2气体流速为2 L/min）对小鼠进行麻醉，持续约5分钟，直至麻醉深度足够，呼吸频率减慢至每分钟约55–65次16（图1A）。</li>
	<li>将小鼠从麻醉室中取出，并以其门齿悬挂在呈45o倾斜角的插管架上。在插管架上配备鼻罩，以确保插管过程中小鼠持续处于麻醉状态（图1B）。</li>
	<li>将一根直径50 µm的光纤一端连接至光源，并将20号套管沿该光纤穿入，利用光纤作为引导（图1C）。</li>
	<li>打开小鼠口腔，用钝头镊子将舌头向前拉出。点亮导丝，并利用其观察声门结构（图1D）。</li>
	<li>将导丝穿过声门，使其刚好通过声门并停留在上段气管内。沿导丝向前推进1英寸长的套管以完成插管，插入深度应使套管接头紧贴小鼠门齿（图1E）。随后撤出导丝，保留套管在原位。</li>
	<li>通过短暂用手指堵住套管并观察呼吸变化来检测插管是否成功。堵管时呼吸停止或呼吸费力，松开后呼吸加快，提示气管插管位置正确。若堵管时呼吸模式无变化，则套管可能误入食管。</li>
	<li>准备0.2 mCi的99m锝-硫胶体（99mTc-Sc），溶于10 µL体积中，用移液器将其注入套管内。让小鼠在1–2分钟内自主将其吸入肺部（图1F）。在将小鼠转移至扫描仪载物台前，移除套管。 
	注：放射性核素由Cardinal Health公司制备并过滤。</li>
</ol>
3. SPECT/CT 成像
<ol>
	<li>将小鼠转移至带有鼻锥的25 mm托盘中，并用胶带固定，注意不要将胸部和腹部绑得太紧，以免影响呼吸。注意移除小鼠身上附着的任何金属耳标。</li>
	<li>准备一个放射性模体，其中含有0.05 mCi/200 µL，将此液体置于0.2 mL PCR管中。通过胶带将该管固定在托盘上，位于小鼠下腹部下方，避免与肺部重叠。 
	注意：该模体用于CT与SPECT图像的共定位，同时也作为清除率的阴性对照。</li>
	<li>将小鼠插入SPECT/CT系统，选择成像工作流程，并运行Setup。</li>
	<li>设置探测器在小鼠上的定位，并运行成像工作流程。</li>
	<li>为接受放射性物质的小鼠准备一个笼子，确保食物和水自由获取，并使用辐射安全标识进行清晰标记。</li>
	<li>工作流程完成后，将小鼠从成像托盘中取出，放入已准备好的笼子中恢复，两次扫描之间恢复时间为6小时（第一次扫描结束至第二次扫描开始），期间自由摄取食物和水。选择6小时是因为该时间段内依赖纤毛功能的线性清除正在进行，而肺泡清除极少。</li>
	<li>6小时后，重新麻醉小鼠，并使用相同的工作流程对小鼠及模体进行扫描，以测量气道中已清除的同位素量。 
	注意：必须让小鼠充分恢复，因为持续6小时的异氟烷麻醉将显著抑制纤毛功能，导致接近零的黏膜纤毛清除率。</li>
</ol>
4. 分析
<ol>
	<li>成像完成后，进行后处理以重建完整的三维图像堆栈。
	<ol>
		<li>使用99mTc的工厂标准设置对SPECT图像进行直方图处理，然后采用MAP3D算法和点扩散函数（PSF）重建方法进行重建。 
		注：重建过程使用8次迭代和6个子集。有效的重建需要子集与投影数之比为1:10，或能整除投影总数；由于采集时使用了60个投影，因此选用6个子集。</li>
		<li>使用Feldkamp算法和Shepp-Logan滤波器重建CT图像。 
		注：重建过程使用4次迭代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在FIJI ImageJ21中使用重切片（reslice）工具对CT和SPECT图像进行处理，从默认的轴向图像生成冠状面图像。然后对SPECT图像执行z轴堆栈求和投影，将每层的计数数据相加，生成单张图像以便于分析。</li>
	<li>以 phantom Eppendorf 管作为参考，调整CT和SPECT图像的大小并进行配准（图2A,B）。在所有样本中保持一致的缩放测量参数。</li>
	<li>对CT图像使用自动阈值法进行二值化处理，随后翻转图像堆栈，并执行z轴堆栈求和投影，以生成用于分析的肺部轮廓图像（图2C）。</li>
	<li>旋转CT和SPECT图像，并使用通道工具合并图像。围绕右肺绘制感兴趣区域（ROI）并进行测量，以计算黏膜纤毛清除率（MCC）（图2D）。 
	注：该测量将获取0小时和6小时时间点右肺的总放射性计数，其中6小时图像已根据公式 N(t) = N0e−t 进行放射性衰变校正。99mTc-Sc的衰变常数为3.21e−5 每秒，半衰期约为6小时。利用这些数值可进一步计算清除百分比。 
	注：选择右肺进行感兴趣区域绘制和计数测量，是因为黏膜纤毛清除作用会将放射性同位素从肺部运输至咽部，随后被吞咽并进入胃部。在许多情况下，可在胃部观察到放射性信号，可能与左肺区域重叠，从而导致计数误差。通过仅测量右肺计数可避免此类干扰。</li>
</ol>

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</ol>

本工作无相关事项。

运动性呼吸道纤毛在疾病和发育中的作用不断被深入认识并得到进一步重视。气管支气管树内壁细胞的顶端表面存在多个运动性纤毛，其同步性、异时性摆动产生向头侧的液体流动，从而实现黏液纤毛清除（mucociliary clearance, MCC）。在原发性纤毛运动障碍（PCD）等纤毛病中，MCC功能受损。22，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）等获得性疾病18，其在先天性心脏病（CHD）中的重要性正逐渐被认识，而这些疾病传统上并不被视为纤毛病。近期数据显示，在伴有异向性发育的CHD中存在呼吸纤毛功能障碍23 且无异位综合征7此类运动纤毛功能障碍被证实会导致更严重的呼吸系统症状9 以及更高的术后并发症发生率8大多数（即使不是全部）此类疾病均有相应的小鼠模型，而我们用于测量小鼠黏膜纤毛清除功能（MCC）的方案是一种有价值的工具，可用于评估潜在治疗药物的效果。
动物模型有助于理解疾病并开发治疗方法。活体动物成像技术进一步提升了研究价值，因其能够在同一动物个体中多次获取数据，而无需处死动物，使研究人员能够追踪疾病的长期进展以及治疗效果的持续时间。MCC的小鼠模型经过数十年由多位研究者逐步建立，最初在比格犬上使用平面闪烁显像（一种二维核成像技术）进行研究24。十年后，该技术被改良用于小鼠，又过了十年进一步适应于SPECT成像25,26。由于存在多种人类疾病的小鼠模型（例如纤毛功能显著受损的原发性纤毛运动障碍，PCD），该技术在小鼠模型中的发展极大地提升了其应用价值。MCC已在肺去神经支配和免疫抑制的小鼠模型中得到评估，并具有与其他模型联合使用的潜力19,26。在患有气道疾病（如囊性纤维化、哮喘、PCD以及与先天性心脏病相关的纤毛病）的患者中也已开展MCC测量研究，结果表明该技术可辅助肺生理学研究及治疗效果评估13。
本方案的一个重要部分是使用正确的成像参数设置采集条件，以获得可用于定量分析的准确图像。在设计SPECT采集参数时，有几个关键因素需要考虑，包括所使用的准直器类型、每圈采集的投影数量以及旋转步长。准直器的选择对采集的灵敏度和分辨率具有重要影响，因此采集参数可能需要根据所用准直器进行优化27。此外，当使用大鼠等体型较大的动物时，也需要相应调整准直器。例如，多针孔准直器具有更高的灵敏度，但在选择步长时需格外注意，以避免投影重叠导致不必要的复用效应，这种效应虽可进一步提高采集灵敏度，但会引入一定程度的图像模糊，可能导致重建伪影25。重建参数的设置对于生成可定量图像同样至关重要。MAP3D是一种常用的迭代重建算法，PSF是一种常见的重建模型。这两种方法均能可靠地重建图像，但在设置迭代次数和子集数时需谨慎。增加迭代次数会延长重建所需的计算时间，同时提升重建图像质量，但继续增加迭代次数所带来的改善将逐渐减弱。
为了在 ImageJ 中对图像进行定量分析，最佳的测量工具是 RawIntDen，它可输出选定区域中像素值的总和。在对不同大小的肺部感兴趣区域（ROI）的 SPECT 数据进行定量时，使用 RawIntDen 可提供计数的绝对测量值，避免了像平均值测量那样将测量结果按 ROI 面积进行调整21。
研究人员在应用该技术时，应意识到其存在若干相关的误差来源。一个显著的混杂因素是麻醉剂的使用。异氟烷是一种起效迅速的吸入性麻醉剂，小鼠在成像结束后可快速恢复。然而，应注意让小鼠在笼中拥有充足的恢复时间，并且麻醉时间不应超过必要时长。根据我们的个人经验（未发表数据），在0至6小时时间点之间持续使用吸入性异氟烷维持麻醉的小鼠表现出可忽略的清除率。同样，必须控制麻醉剂量以确保小鼠快速恢复。在将动物固定于成像托盘时，用于配准的模体管应置于腹部较低位置，以避免其伪影与肺部重叠。此外，为获得高质量的CT图像，应注意移除小鼠身上的任何金属标签，以防止X射线散射产生伪影。
目前的MCC方案可应用于多种动物模型。该技术对受检动物的健康影响极小，小鼠耐受性良好，因此可用于疾病模型，而不会危及本已脆弱的小鼠的健康。该方法的优势在于其作为一种活体技术，能够在不牺牲动物以摘取气管进行体外显微视频观察（体外模型所需步骤）的情况下，获得一致且可重复的气道功能测量结果26。该技术在对同一批动物进行多次扫描时均能产生可重复的测量结果，因而允许对同一动物先后施用不同试剂或潜在治疗药物，并在同一个体内部进行统计学比较，从而降低任何动物模型中固有的生物学变异性，减少为显示统计学显著差异所需的样本量。
利用MCC技术评估气道功能可适用于多种动物模型，并可用于多种不同气道健康模型的研究，以及新疗法的测试。该技术可用于评估原发性纤毛运动障碍（PCD）小鼠模型的气道功能，也可用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型。我们的方法还可用于研究目前临床常用的各种麻醉剂对MCC的不同影响。此外，也可利用该模型评估治疗药物对气道的作用。如前所述但值得再次强调的是，由于这是一种活体测量方法，因此可以在疾病发展过程中重复进行MCC评估，并随时间推移检测治疗干预的效果。此外，小鼠是模拟和研究人类疾病最常用的实验动物，在某些情况下，可选用多种人类疾病的转基因小鼠模型。

纤毛是基于微管的细胞器，在从藻类到人类的进化历史中高度保守。它们从细胞表面延伸出来，具有多种功能1，从感知局部环境中的感觉信号到介导细胞运动，这些功能可追溯至人类以及早期的单细胞真核生物2,3。纤毛可以是单一的非运动型纤毛，作为细胞的特化天线用于处理环境信号；也可以是多个运动型纤毛，以同步的、异相波动的方式摆动，从而产生液体流动，例如存在于输卵管以及上下呼吸道（终末细支气管通向肺泡的区域除外）内壁的纤毛1,2。
呼吸道广阔的上皮表面持续暴露于各种潜在有害的吸入性污染物和病原体所带来的污染之中，因此需要有效的防御机制。其中一种关键的防御机制是气管支气管树的黏液纤毛系统，该系统通过气管支气管上皮细胞顶面排列的大量运动纤毛的规律性摆动，将分泌的黏液持续不断地以机械方式运送出气道。这些运动纤毛能够捕获吸入的污染物，并通过其持续且同步的摆动，将污染物向头端方向转运4,5。
纤毛已被证实具有多种关键作用，例如在胚胎发育过程中参与左右模式的建立，其中胚胎节点处的运动纤毛可打破对称性6。纤毛相关基因的突变已被证实与先天性心脏病（CHD）等疾病相关，原因在于心脏具有不对称结构6。近期研究表明，CHD患者呼吸道中纤毛功能障碍的发生率较高，且术后呼吸道并发症以及上下呼吸道慢性症状的发生率也有所增加7,8,9,10。已有研究证实，无论是否伴有内脏异位症，患有CHD和纤毛功能障碍的患者在术后出现呼吸道并发症和不良呼吸结局的风险更高5,8,10。除了在信号传导和发育中的作用外，气道纤毛的重要性也通过纤毛病得到了证实，其中典型的例子是原发性纤毛运动障碍（PCD）。PCD是一种先天性疾病，由影响运动性呼吸道纤毛的多种基因突变引起，导致反复肺部感染、支气管扩张，甚至可能需要进行肺移植11。此外，尽管囊性纤维化（CF）患者的纤毛结构正常——CF是白种人群中最常见的先天性遗传病——但由于CFTR基因突变导致黏液变得浓稠黏滞，黏液纤毛清除功能（MCC）仍受到损害12。目前已有多种PCD和CF的小鼠模型，以及越来越多的CHD模型。归根结底，纤毛是具有多种关键功能的多功能结构，因此建立一种可在体内评估运动性呼吸道纤毛功能的方法，对于临床前研究、评估基因突变及药物对黏液纤毛清除（MCC）的影响具有重要价值13。该方法在评估新型药物、基因治疗或干预措施对这些小鼠模型中MCC的影响方面同样具有重要意义。
已有多种不同模型用于评估黏膜纤毛清除功能（MCC）。一种显著的方法是将亚甲蓝染料注入支气管，通过光纤测量染料移动来评估清除情况14。该方法受限于对染料移动的观察能力，在人类中的应用较常规，而在临床前小鼠模型中则较少使用。另一种显著的方法是同步辐射相位对比X射线成像（PCXI），可用于追踪气道内单个颗粒的运动。该方法相对较新，尚未广泛普及15。此外，还有多种离体评估气道的方法，例如切除气管后进行视频显微镜观察，但这些模型在人类患者中的应用价值有限16。诸如光学相干断层扫描等用于纤毛成像的高分辨率技术也存在类似的局限性17。
本文介绍了一种可重复的体内测量黏膜纤毛清除率（MCC）的方法，该方法已被用于多种动物模型的肺清除率研究，以及慢性阻塞性肺疾病中的MCC研究，并用于评估免疫抑制药物的作用18,19。该方法通过将不溶性颗粒状放射性示踪剂99m锝-硫胶体（99mTc-Sc）滴注至肺内，随后追踪其清除过程来实现。放射性核素可通过单光子发射计算机断层扫描（SPECT）进行追踪18,20。我们进一步优化了该MCC测量技术，采用SPECT与计算机断层扫描（CT）双模态成像，将放射性同位素计数共定位至肺部，并测量6小时内这些计数的下降情况。通过CT与SPECT图像的共配准，双模态成像可将辐射计数精确地定位至目标区域——肺部。尽管本文详细描述的是小鼠MCC的测量方法，但该方案也可调整用于大鼠的MCC研究。此时需调整准直器参数及辐射剂量。我们认为，由于小鼠体型较小，其MCC扫描在技术上更具挑战性，但由于存在大量已建立的小鼠人类疾病模型，其应用价值高于大鼠。此外，由于小鼠及其动物饲养成本较低，更易于实现较大样本量的研究。

<table><tbody><tr><td>500 &amp;micro;m 无护套光纤线</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>锝[99mTc]硫胶体</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉蒸发器</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p 软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan 安全型套管针 20G 1英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>小鼠插管支架</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>西门子 Inveon 双模态 SPECT/CT 系统</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道麻醉支架</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠体内黏膜纤毛清除功能的评估

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

呼吸运动纤毛是细胞的一种特化细胞器，排列在呼吸道上皮细胞的顶端表面。这些由肌动蛋白构成的多发性运动细胞器以协调同步的方式进行节律性摆动，从而产生向头侧的液体流动，清除呼吸道内吸入的污染物和病原体。随着环境污染加剧、新型病毒病原体不断出现以及多重耐药细菌的兴起，纤毛驱动的黏液纤毛清除（MCC）对于维持肺部健康至关重要。在多种先天性疾病（如原发性纤毛运动障碍、囊性纤维化）以及获得性疾病（如慢性阻塞性肺疾病）中，MCC功能均受到抑制。上述疾病均已建立相应的动物模型，部分疾病拥有多个小鼠模型。本论文详细介绍了一种利用微量放射性物质结合SPECT/CT双模态成像技术，在活体小鼠中准确且可重复地测量MCC的方法。该方法允许小鼠在成像后恢复，从而实现多次连续测量，并可对潜在治疗手段进行长期纵向评估。野生型小鼠的数据表明，只要严格关注操作细节并遵循实验方案，MCC测量结果具有良好的可重复性。

使用本方案时，我们在异氟烷麻醉舱中对小鼠进行麻醉（图1A）。在达到适当的麻醉水平后，将小鼠置于垂直支撑物上（图1B）并使用带光源的导丝观察声带图1C-1D。将小鼠进行气管插管并灌注0.2 mCi 99mTc-Sc 的体积 10 µL 通过套管使小鼠自发吸入至肺部（图1E-1F）。图像采集与处理后，将CT与SPECT图像进行共定位（图2A) 使用模体管作为解剖标志（图2B）。肺部的掩模由CT图像生成（图2C）并用于在0（图 2D）和6小时（图2E-2F）。为了检验该方案的可重复性，在相同实验条件下，对共计8只小鼠在不同日期进行了两次扫描，采用配对t检验进行分析，结果显示重复扫描之间无显著差异（p值=0.9904）（图3A）。另外2只小鼠在不同日期、相同实验条件下各扫描3次，采用单因素方差分析显示重复扫描结果具有显著一致性（p值为0.0041）（图3B共扫描了8只小鼠，并展示了两张代表性图像（图4).
<img alt="啮齿类动物插管过程；设备包括口具、导管、手术工具；实验室实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠插管与同位素灌注。展示进行气道插管并灌注同位素所需步骤的图像。A) 小鼠在麻醉舱内接受麻醉。B) 将已麻醉的小鼠固定于垂直支架上，以前门齿悬挂固定。C) 将一根照明的0.5 mm光纤作为导丝，穿入20 G套管针中以备使用。D) 使用镊子打开小鼠口腔，并利用带光源的导丝照明以观察声门。E) 将套管针穿过声门，随后撤出导丝。F) 使用移液器将可溶性同位素注入套管针中，使小鼠自主呼吸将同位素吸入肺部。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="核医学成像，肺部扫描，PET-CT叠加，放射性示踪剂分析，肿瘤学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：MCC扫描的SPECT/CT图像。A) 已与CT图像共定位的SPECT图像。B) 包含用于共定位的可见模体管的CT图像。C) 通过对CT图像进行二值化处理并执行z轴堆栈求和投影所获得的气道掩模。D) 与SPECT图像共定位的CT掩模。已在右肺周围绘制用于分析的感兴趣区域（ROI）。E) 6小时时的气道掩模。F) 6小时时气道的CT与SPECT共定位图像，包含用于分析的感兴趣区域（ROI）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="清除率图表；折线图、柱状图、p值；统计分析、医学数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：同一批小鼠在多次扫描中的清除率测量结果。A) 对8只小鼠在无实验条件变化的情况下进行了两次重复清除率测量。配对t检验显示，重复扫描之间无显著差异，p值为0.9904。B) 对2只小鼠在无实验条件变化的情况下进行了三次重复清除率测量。单因素方差分析（one-way ANOVA）显示，重复扫描之间具有显著一致性，p值为0.0041。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤成像热图、发射分析、0小时与6小时对比、标注图示、荧光强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：两只小鼠在0小时和6小时气道的SPECT/CT共定位图像，感兴趣区域（ROI）分别在0小时和6小时标记以勾画右肺。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：通过光纤导管照射声带并可视化呼吸效果的视频。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充文件。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">请点击此处下载这些文件。</a>

本文中，我们描述了利用双模态放射性核素成像技术在活体小鼠中评估气道黏膜纤毛清除功能（MCC）的实验方案。该方案针对配备小鼠全身（MWB）准直器的双模SPECT/CT系统，设计用于单光子发射计算机断层扫描（SPECT）与计算机断层扫描（CT）的联合采集流程。

呼吸运动纤毛是细胞的特化细胞器，排列在呼吸道上皮细胞顶端表面。通过以协调方式摆动……

本方案允许利用放射性核素通过SPECT和CT双模态成像技术，在动物模型中精确测量黏膜纤毛清除功能，从而准确定位并量化气道清除情况。该技术是一种可重复的黏膜纤毛清除（MCC）测量方法，由于采用了SPECT/CT双模态成像，可适用于多种动物模型和疾病模型。在确认小鼠对足底反射无反应后，将固定架配备鼻罩以维持麻醉状态，并将麻醉后的小鼠以上门齿悬挂在插管架上，保持45度角。将一根50微米光纤的一端连接至光源，并将一根20号套管沿光纤穿入。使用钝头镊子拉出舌头，并照亮导丝以观察声带。将导丝穿过声带，使导丝刚好越过声带并停留在上段气管内，然后沿导丝向前推进1英寸套管，直至套管足够深入，其接头紧贴动物的门齿。移除导丝，同时保留套管原位，用手指短暂堵住套管以观察呼吸是否发生变化。随后向套管内加入10 µL新配制的0.2 mCi 99m锝硫胶体，使小鼠在1至2分钟内自主将放射性核素吸入肺部。进行SPECT/CT成像时，在移除套管后，用胶带将小鼠固定在带有鼻罩的25 mm托盘上，并将含有0.05 mCi放射性仿体的200 µL PCR管用胶带固定于小鼠下腹部、肺部下方位置。将小鼠放入SPECT/CT系统中。选择成像工作流程并点击设置。调整探测器在小鼠上的定位，然后运行成像工作流程。完成操作流程后，将小鼠转移至新笼子中，监测其状态，并提供自由获取的食物和水，以及在两次扫描之间贴上辐射安全标签，持续六小时。成像后，使用针对99m锝硫胶体的仪器默认标准设置对SPECT图像进行直方图处理，并采用MAP3D算法及点扩散函数重建方法重建三维图像堆栈。使用Feldkamp算法和Shepp-Logan滤波器重建CT图像，并在FIJI中打开CT和SPECT图像。使用重切片工具从默认的轴向图像生成冠状面图像，并对SPECT图像进行z轴叠加求和投影，以累加每层的计数数据。生成单幅图像以便于分析。同时，以模体Eppendorf管作为参考，对CT和SPECT图像进行缩放和共定位配准。使用自动阈值法对CT图像进行二值化处理，反转图像序列，并进行Z轴投影叠加，以生成用于分析的肺部轮廓。旋转CT和SPECT图像，利用通道工具将它们合并为一幅图像。然后在右肺周围绘制感兴趣区域，以测定黏膜纤毛清除率。图像采集和处理完成后，可利用模体管作为解剖标志，对CT和SPECT图像进行共定位。可通过CT图像生成肺部的掩膜，并用于在不同时间点围绕肺部绘制感兴趣区域以进行分析。在本项分析中，共对8只小鼠在相同实验条件下于不同日期进行了两次扫描，以验证该实验方案的可重复性。配对t检验分析显示，重复扫描之间无显著差异。另外两只小鼠也在相同实验条件下于不同日期各扫描了三次。单因素方差分析（ANOVA）结果显示，重复扫描之间具有显著的一致性。此处可观察到两只扫描小鼠的代表性图像。必须能够清晰看到气道。必要时，为确认插管成功，可拔出套管并重新插管，以避免误入食管。该方案可应用于疾病模型，以评估不同药物对气道清除功能的影响，并有助于新型药物疗法的开发。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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一种可逆、非侵入性的小鼠气道阻力测量与支气管肺泡灌洗液采集方法

来源：Zhang, J., et al. P. 解析病毒逃逸细胞因子产生过程中的先天免疫信号传导。 J. Vis. Exp.

小鼠经鼻感染鼠疱疹病毒以评估宿主免疫应答

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宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。...

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小鼠体内黏膜纤毛清除功能的评估

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