Name: 在体内评估小鼠的粘液清除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习使用SPECT/CT双模态成像技术在小鼠体内评估气道粘液纤毛清除功能的方法。该方案具有可重复性，适用于多种疾病模型和药物效应研究，为呼吸系统疾病研究提供可靠的实验手段。

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M.Z.和 K.S.F. 和这项工作得到了匹兹堡大学临床和转化科学研究所在皮特创新挑战 （PInCh） 下授予的赠款的支持，NHLBI R01 授予 HL153407，授予 M.Z.

匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会在进行这些动物实验之前，批准了本出版物中指定的所有动物协议。
注:此协议详细说明了如何使用双模SPECT/CT扫描仪进行放射性核素成像的体内粘膜清除研究。所展示的技术包括运行系统校准、麻醉小鼠、小鼠气管插管、向肺部灌输同位素、双模成像、这些图像的共同注册以及分析。
1. 光谱/CT 系统设置
<ol><li>设计一个合适的工作流程，并在使用活体动物进行实验之前设置。<ol>
<li>使用由 60 个投影组成的 SPECT 采集，在旋转半径为 40 厘米的投影之间步幅为 6o。CT 采集由 220 个投影组成，投影之间角度为 1.6o。</li>
	</ol>
</li>
	<li>确保系统为小鼠提供正确的 MWB 校准器和 SPECT 成像。如果安装了不适当的校准器，请使用对准器向导安装正确的对准器。</li>
	<li>运行必要的系统校准，为系统准备使用。 注:扫描仪的SPECT和CT组件需要校准。使用源调理和暗/光 （D/L） 校准来校准 CT 组件，每 2 周进行一次中心偏移 （COS） 校准，并每月评估 X 射线硬件。SPECT 组件需要每年校准一次。<ol>
<li>要评估 X 射线硬件，请检查 CT 校准期间 的评估 X 射线硬件 框（补充 CT 校准菜单）。</li>
		<li>要执行源调理，请在 CT 校准期间检查 执行源调理 框（补充 CT 校准菜单）。</li>
		<li>要执行 D/L 校准，请检查 CT 校准期间实验中使用的 CT 采集协议旁边的 D/L 框。取消检查所有其他协议（补充CT校准菜单）。</li>
		<li>要执行 COS 校准，请用校准环工具替换床，调整床型设置以匹配运动控制设置，并在 CT 校准期间的实验中使用的 CT 采集协议旁边检查 COS 框。取消检查所有其他协议（补充CT校准菜单，补充校准环）。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 鼠标灌输和灌输
<ol><li>称重要扫描的鼠标。如果扫描多个鼠标，请注意使用耳击或尾部标记等方法为识别目的标记小鼠。</li>
	<li>使用 1.5% 异氟化物麻醉鼠标，气体流量为 2 L/min O2，在气室中持续约 5 分钟，以产生足够深度的麻醉，直到呼吸速度减慢到每分钟16 次 55-65次呼吸（图 1A）。</li>
	<li>将鼠标从腔室中取出，在 45o斜坡的灌管支架上由前切口悬挂。用鼻锥装备插管支架，以确保小鼠在插管过程中麻醉（图1B）。</li>
	<li>将 50μm 光纤线的一端连接到光源，并用电线将 20 光纤管穿线（图 1C）。</li>
	<li>打开鼠标的嘴，用钝钳把舌头向前拉。照亮导线，并用它来可视化声带（图1D）。</li>
	<li>通过声带的导线，使电线刚刚超越声带，并在上气管休息。沿着钢丝向前滑动1英寸的管子，给老鼠做管子，通过足够深的管子，使其中心与动物的切口（图1E）相抗使。取出留下管子的电线。</li>
	<li>通过用手指短暂地插入手杖并检查呼吸变化来测试插管。停止呼吸或呼吸紧张，同时堵塞和释放后加速呼吸是适当的气管插管的迹象。如果堵塞手杖后呼吸模式没有变化，后者很可能在食道中。</li>
	<li>在10μL的体积中准备 9900万个技术硫胶体（99mTc-Sc）的0.2 mCi，并将移液器放入管子中。让老鼠在1-2分钟（图1F）内自发地吸入肺部。在将鼠标转移到扫描仪托盘之前取出手杖。 注:放射性核素是由红衣主教健康公司制备和过滤的。</li>
</ol>3. 光谱/CT 成像
<ol><li>将鼠标转移到带鼻锥的25毫米托盘中，用胶带固定，注意不要将胸部和腹部粘得太紧，以免损害呼吸。请小心删除连接到鼠标的任何金属耳标。</li>
	<li>在 200 μL 中制备由 0.05 mCi 组成的放射性幻影，并将此量放置在 0.2 mL PCR 管中。通过将管子贴在小鼠下腹部下方的托盘上，避免与肺部重叠，从而放置管子。 注:幻影用于共同注册CT和SPECT图像，以及清除的负控制。</li>
	<li>将鼠标插入SPECT/CT系统，选择成像工作流程并运行 "设置"。</li>
	<li>设置鼠标上探测器的定位，并运行成像工作流程。</li>
	<li>为手术后接受放射性的老鼠准备一个笼子，不受限制地获得食物和水，并使用辐射安全贴纸进行清晰的标签。</li>
	<li>工作流程完成后，将鼠标从成像托盘中取出，并允许鼠标在预制的笼子中恢复，扫描（扫描结束 1 至扫描 2 开始）之间持续 6 小时，并允许广告利比图姆获得食物和水。选择 6 小时，因为它对应于根据 cilia 功能进行线性间隙的时间段，而紫藤间隙很少。</li>
	<li>6小时后，重新麻醉鼠标并扫描，连同幻影，使用相同的工作流程来测量从气道中清除的同位素量。 注:让小鼠恢复至关重要，因为连续6小时用异氟兰麻醉会导致显著的胆汁抑制作用，导致近零粘膜间隙。</li>
</ol>4. 分析
<ol><li>成像后，执行后处理以重建完整的 3D 堆栈图像。<ol>
<li>使用 99mTc 的出厂标准设置对 SPECT 图像进行直方图，然后使用 MAP3D 算法和点点分布功能 （PSF） 重建进行重建。 注:重建使用8次迭代和6个子集进行。有效的重建需要将子集与 1:10 的预测进行比对，或均匀地划分为预测数，因此使用 60 个投影进行收购使用了 6 个子集。</li>
		<li>使用费尔德坎普算法和谢普-洛根过滤器重建CT图像。 注:重建是使用4次迭代进行的。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用残片工具处理 FIJI ImageJ21 中的 CT 和 SPECT 图像，从默认轴向图像生成日冕视图图像。然后在 SPECT 图像上执行 z 堆栈总和投影，以添加每个切片的计数数据，并生成单个图像以便于分析。</li>
	<li>调整大小并共同注册CT和SPECT图像使用幻影埃彭多夫管作为参考（图2A，B）。跟踪并使用所有样品的一致调整尺寸测量。</li>
	<li>使用自动阈值对 CT 图像进行二进制，然后倒置堆栈，并执行 z 堆栈总和投影，生成肺部轮廓以供分析（图 2C）。</li>
	<li>旋转 CT 和 SPECT 图像，并使用通道工具合并图像。通过在右肺周围绘制投资回报率并测量（图 2D）来计算 MCC。 注:此测量将计算右肺 0 和 6 小时时间点的总计数，使用公式更正 6 小时图像以进行放射性衰变:N（t）= N0e+t.99米Tc-Sc 的衰变常数为每秒 3.21e=5，半衰约 6 小时。然后，这些值可用于计算百分之百的间隙。 注:右肺被选为投资回报率图纸和测量计数，因为粘膜间隙将把放射性同位素从肺部输送到咽部，从那里吞咽，最后在胃中。很多时候，计数可以看到在胃，可能与左肺重叠，从而产生错误的计数。这种混淆可以通过测量右肺的计数来避免。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-related+diseases.">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li><li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles.">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li><li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. 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与此工作无关。

湿润的呼吸道在疾病和发展中的作用继续发展，并得到更好的赞赏。气管支气管树内衬细胞的apical表面的多个摩尔西利亚的同步、元时间跳动产生头皮流，产生粘膜间隙或 MCC。MCC在像PCD22这样的心肌病中受到损害，像COPD18这样的疾病，其重要性在CHD中得到了承认，传统上并不被认为是心肌病。最近的数据显示，在患有异位轴23和无异质轴7的CHD中，呼吸系统肝功能障碍。这种移动性胆汁功能障碍被证明转化为更大的呼吸症状9以及更大的术后发病率8。大多数，如果不是全部，这些疾病，有小鼠模型可用，我们的协议，测量MCC在小鼠是一个有价值的工具，可以用来测试潜在的治疗方法。
动物模型为了解疾病和治疗的发展提供了效用。体内动物成像提供了进一步的效用，能够从同一动物获得多个数据点，而无需牺牲动物，使调查人员能够跟踪疾病的纵向过程以及治疗效果的研究持续时间。MCC的老鼠模型是由多个研究者在几十年的时间里开发的，最初是使用平面扫描技术（二维核成像技术24）在小猎犬身上进行的。十年后，这项技术被改用在小鼠身上，随后在25、26年之后的10年适应了SPECT成像。这种技术在小鼠模型中的发展是该技术相关性的一个重大发展，因为有多种人类疾病小鼠模型，如PCD，其中硅功能发生显著变化。MCC已被评估在小鼠模型的肺衰减和免疫抑制，并有可能与其他模型19，26一起使用。在人类气道疾病（如CF、哮喘、PCD和与CHD相关的心肌病）患者中进行了MCC测量研究，并取得了该技术可同时帮助肺生理学和治疗疗效的研究。
此协议的一个重要部分是设置具有正确成像参数的获取，以获取用于量化的准确图像。在设计 SPECT 收购设置时，有许多因素是关键，包括使用哪些校准器、每次革命获得的预测数和旋转步数大小。合金选择是收购的灵敏度和分辨率的一个主要因素，收购设置可能需要根据正在使用的27的对准器进行定制。或者，当使用更大的动物，如老鼠，碰撞器将需要调整。例如，多个针孔校准器更敏感，但在选择步骤大小时应小心，以避免重叠的投影和造成不受欢迎的多路复用，这可以进一步提高收购的灵敏度，牺牲一些图像模糊性，可能会导致重建文物25。重建设置也是生成可量化图像的关键。MAP3D 是常用的迭再重建算法，PSF 是常见的重建模型。两者都可用于重建图像，但在设置迭代和子集数量时应小心谨慎。更多的迭代将增加重建所需的计算时间，并随着回报的进一步增加而提高重建的质量。
为了量化 ImageJ 中的图像，理想的测量工具是 RawIntDen，它在选择中输出像素的总值。当在不同大小的肺 ROI 上量化 SPECT 数据时，RawIntDen 的使用提供了绝对的计数量度，并避免将测量结果调整到 ROI 的区域，就像平均测量结果为 21一样。
此技术具有许多相关的错误来源，调查人员在应用此技术时应了解这些错误源。一个值得注意的混淆是使用麻醉剂。伊索夫卢兰是一种快速作用，吸入麻醉剂，小鼠在完成采集后迅速恢复。然而，应小心为小鼠提供充足的时间在笼子里恢复，并且不要超过必要的时间进行麻醉。根据我们个人的经验（未公布的数据），在0至6小时时间点之间连续使用吸入的异氟兰进行麻醉的小鼠的间隙可以忽略不计。同样，控制剂量的麻醉剂也是必要的，以确保快速恢复。当将动物固定到托盘进行成像时，用于共同登记的幻影管应保持在腹部低位，以避免文物与肺部重叠。同样，为了确保高质量的 CT 图像，请注意从鼠标中删除任何金属标签，以避免从 X 射线散射中分离出工件。
目前的MCC协议可以应用于无数的动物模型。这种技术对被扫描动物的健康影响微乎其微，老鼠可以很好地耐受，因此它可以与疾病模型一起使用，而不会危及已经很脆弱的小鼠的健康。这种方法的强度来自于它是一种体内技术，它允许获得一致和可重复的气道功能测量，而无需牺牲动物来切除气管进行视频显微镜检查，前体内模型需要26。这种技术在对同一动物的多次扫描中产生可重复测量的一致性，允许用不同的剂剂或潜在的治疗方法对同一动物进行治疗，并在同一动物之间进行统计比较，以减少任何动物模型固有的生物变异性，从而减少显示统计显著差异所需的样本量。
使用MCC技术对气道功能的评估可以调整到各种动物模型，并应用于许多不同的气道健康模型，以及测试新的疗法。可使用此技术以及 COPD 模型评估 PCD 小鼠模型的气道。我们的方法也可以用来研究各种麻醉剂对MCC的差异效应，这是常见的临床用途。最后，也可以使用此模型评估治疗剂对气道的影响。如前所述，但值得重复，因为它是一种体内测量，它允许在疾病过程中重复MCC评估，以及随着时间的推移治疗干预的测试益处。此外，小鼠是用于模仿/研究人类疾病的最常见实验室动物，在某些情况下，有多种转基因小鼠模型可供选择。

Cilia 是基于微管的细胞器，保存于从藻类到人类的进化历史中。它们来自细胞表面，具有多种功能1，从识别局部环境感官信号到运动性，其功能可以追溯到人类早期的单细胞真核生物2、3。Cilia 可以是非移动和单体，作为细胞处理环境信号的专用天线:或移动和多，在同步的，元时波跳动，以产生流体流动，如在输卵管的衬里和上下气道，除了终端支气管导致肺泡1，2。
呼吸道广泛的上皮表面不断受到各种潜在危险吸入污染物和病原体形式的污染，因此需要防御。一个关键的防御机制是气管支气管树的粘膜装置，通过敲击气管支气管上皮细胞的apical表面的多块粘液，机械地将连续的分泌粘液流出气道。这些功能诱捕吸入的污染物，并通过其连续，同步殴打，运输他们头孢4，5。
Cilia已被证明在胚胎发育中具有关键作用，如在胚胎发育中左右模式，其中胚胎节点的摩尔西利亚断裂对称性6。由于心脏的不对称结构，与西莉亚相关基因的突变与先天性心脏病（CHD）等疾病有关。最近的研究报告，有染病患者呼吸道功能障碍的高发率，以及术后呼吸道并发症和慢性呼吸道症状在上、下气道7、8、9、10的患病率上升。有或无异质性心肺功能障碍的病人，在术后5、8、10日，已证明有呼吸系统并发症及负面呼吸道结果的风险增加。除了在信号和开发中的作用之外，气道西莉亚的重要性也由心肌病所证明，其中一个典型的例子是主要的胆囊性发育不良（PCD）。PCD是一种先天性疾病，由一些影响湿润的呼吸道的突变引起，导致肺部反复感染，支气管切除术，并有可能需要肺移植11。此外，即使西莉亚在囊性纤维化（CF）中是正常的，这是高加索人群中最常见的先天性疾病，但MCC由于CFTR基因12的突变引起的粘稠粘液而受损。PCD 和 CF 的多个鼠标模型，以及不断增加的 CHD 模型。最终，西莉亚是多功能结构，具有许多关键作用，评估活体中移动呼吸系统西莉亚功能的方法对于临床前研究、评估突变以及药物对粘结清除 （MCC）13的影响是有价值的。这种方法对于评估这些小鼠模型中新药、基因疗法或干预措施对MCC的影响也很有价值。
有许多不同的模型已经用于评估MCC。一种值得注意的方法是使用已灌输到支气管中的甲基蓝色染料，通过纤维光学测量染料运动的间隙14。这种方法受制于观察染料运动的能力，这种染料在人类中比在临床前小鼠模型中更为常规。另一个值得注意的方法是同步加速器相对比X射线成像（PCXI），它可以用来跟踪气道中的单个粒子。这种方法是比较新的，并不广泛访问15。有许多外活体方法来评估气道通过切除气管的视频显微镜，但这些模型提供很少的效用，在人类患者16。Cilia成像的高分辨率技术，如光学相干断层扫描，以同样的方式受到限制。
本文介绍了一种可重复的方法，用于测量无数动物模型中的肺间隙，以及研究慢性阻塞性肺病的MCC，并评估免疫抑制药物18、19的影响。这种方法跟踪放射性制药9900万技术硫胶体（99mTc-Sc），一种不溶性颗粒放射性跟踪器，在注入肺部后清除。然后，放射性核素可以使用单光子发射计算断层扫描（SPECT）18，20进行跟踪。我们进一步完善了这种技术，通过使用双模频谱和计算断层扫描 （CT） 成像与放射性同位素计数的共同本地化到肺部，并测量这些计数在 6 小时内的减少。双模成像，CT 和 SPECT 图像的共同注册，可准确定位辐射计数到我们感兴趣的区域，肺部。虽然我们详细描述了小鼠的MCC测量方法，但可以调整协议以研究大鼠的MCC。校准器需要调整以及辐射剂量。我们认为，由于动物体积小，小鼠MCC扫描在技术上更具挑战性，但由于人类疾病的既定小鼠模型数量众多，因此比大鼠更有用。此外，由于动物群落的成本和维护成本较低，较大的样本量在小鼠中更为可行。

<table><tbody><tr><td>500 微米m 无护套光纤线</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99m锝硫胶体</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉蒸发器</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 镊子</td><td>精细科学工具</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p 软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan 安全导管 20G1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>异氟醚</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>小鼠插管架</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon 双模态 SPECT/CT</td><td>西门子</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单通道麻醉架</td><td>Summit 麻醉解决方案</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

呼吸摩尔胆汁，细胞的专门细胞器，线的上皮细胞的上皮表面衬里呼吸道。通过以元时间、同步的方式跳动，这些多重、多动、基于行为素的细胞器产生一个头孢流体流，清除吸入的污染物和病原体的呼吸道。随着环境污染的加剧、新型病毒病原体和新兴的耐药细菌的出现，胆汁产生的粘液清除（MCC）对于维持肺部健康至关重要。MCC也患有多种先天性疾病，如原发性囊性发育不良、囊性纤维化以及慢性阻塞性肺病等后天性疾病。所有这些疾病已经建立了，在某些情况下，多个鼠标模型。在本出版物中，我们详细介绍了一种使用少量放射性和双模SPECT/CT成像技术来准确和可重复地测量体内小鼠的MCC的方法。该方法允许在成像后恢复小鼠，使连续测量成为可能，并随着时间的推移对潜在的治疗方法进行纵向测试。野生型小鼠的数据表明，只要充分注意细节，并严格遵守协议，MCC测量的可重复性。

使用此协议，我们在异氟室（图1A）中麻醉小鼠。在达到足够的麻醉水平后，小鼠被放置在垂直支架上（图1B），声带使用照明导线（图1C-1D）进行可视化。这些小鼠通过管子和允许自发吸入肺部的小鼠（图1E-1F）被灌输并灌输0.2mCi 99mTc-Sc，体积为10μL。在图像采集和处理后，CT 和 SPECT 图像以幻影管为地标（图 2B）进行本地化 （图 2A）。肺部的口罩来自CT图像（图2C），用于在右肺周围绘制ROI，以0（图2D）和6小时（图2E-2F）进行分析。为了测试协议的可重复性，在实验条件相同的不同天共扫描了 8 只小鼠两次，使用配对的 t 测试进行分析，显示重复扫描（p 值=0.9904）（图 3A）之间没有显著差异。另有2只小鼠在实验条件相同的不同天被扫描了三次，使用单向ANOVA进行分析后显示重复扫描（p值为0.0041）（图3B）之间有显著匹配。共扫描了8只老鼠，并展示了两张有代表性的图像（图4）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> 图1:鼠标灌输和同位素灌输。将同位素灌输到气道所需的步骤的图像。 A） 鼠标在室内麻醉。 B） 麻醉鼠标被放置在垂直支架上，由前切口悬挂。 C） 通过20G的管线运行，准备了照明的0.5毫米光纤线作为导线。 D） 鼠标嘴使用钳子打开，并使用照明导线照明以可视化声带。 E） 管子被推过声带，导线被移除。 F） 可溶性同位素被灌输到管子使用移液器和老鼠允许自发吸入同位素到肺部。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> 图2:MCC扫描的SPECT/CT图像。A） 已与 CT 图像共同本地化的 SPECT 图像。 B） 带有可视幻管的CT图像，用于共同定位。 C） 通过将 CT 图像比纳化并执行 z 堆栈投影而衍生的气道面罩。 D） CT 面膜与 SPECT 图像共同本地化。在右肺周围绘制了用于分析的 ROI。 E） 6 小时后气道的口罩。 F） 在 6 小时内与投资回报率共同定位气道的 CT 和 SPECT 图像，以供分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> 图3:通过多次扫描对同一鼠标进行清除测量。A） 为8只实验条件没有变化的小鼠测量了两个单独的重复间隙。配对 t 测试表明，p 值为 0.9904 的重复扫描之间没有显著差异。 B） 为两只实验条件没有变化的小鼠测量了三个单独的重复间隙。单向 ANOVA 显示重复扫描与 p 值 0.0041 之间有显著匹配。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> 图4:2只小鼠0小时和6小时气道的共同本地化SPECT/CT图像，0和6小时绘制的ROI概述右肺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
补充图1:由光纤线照亮的声带视频，其呼吸效果可视化。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">请点击这里下载此数字。</a>
补充文件。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">请点击这里下载这些文件。</a>

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小鼠粘膜纤毛清除率的体内评价

在本出版物中，我们描述了利用双模放射性核素成像评估小鼠体内气道粘膜间隙 （MCC） 的协议。此协议是专为单光子发射计算断层扫描 （SPECT） 和计算断层扫描 （CT） 采集协议而设计的，使用双 SPECT/CT 系统中的鼠标全身 （MWB） 校准器。

在体内评估小鼠的粘液清除

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

我们的协议允许使用放射性核素在动物模型中准确测量粘膜纤毛清除率，这些放射性核素通过双模态 SPECT 和 CT 成像进行跟踪，以准确定位和测量气道清除率。该技术是一种可重复的 MCC 测量方法，由于利用了双 SPECT/CT，可以应用于不同的动物和疾病模型。确认对踏板反射无反应后，为支架配备鼻锥以保持麻醉，并通过前门牙将麻醉的鼠标以 45 度角悬挂在插管支架上。将 50 微米光纤线的一端连接到光源，并在电线上穿上 20 号套管。使用钝钳拉出舌头并照亮导丝，以观察声带。将导丝穿过声带，使导丝刚好超出位于气管上部的声带，然后沿导丝向前滑动一英寸的套管，直到它足够深，使集线器抵住动物的门牙。在将套管留在原位的同时取下电线，然后用手指短暂插入套管以检查呼吸是否有变化。然后将 10 微升新鲜制备的 0.2 毫居里 99m 锝硫胶体添加到套管中，让小鼠在一到两分钟内自发地将放射性核素吸入肺部。对于 SPECT/CT 成像，取出套管后，使用胶带将鼠标固定在带有鼻锥的 25 毫米调色板上，并在小鼠肺下方的下腹部下方用胶带固定含有 0.05 毫居里放射性模型的 200 微升 PCR 管。将鼠标放入 SPECT/CT 系统。选择映像工作流程，然后单击 Setup。在鼠标上设置检测器的位置并运行成像工作流程。完成工作流程后，将鼠标转移到一个新的笼子中，两次扫描之间可以进行 6 小时，并可以不受限制地接触食物和水以及辐射安全贴纸。成像后，使用 99m 锝硫胶体的出厂标准设置对 SPECT 图像进行直方图，并使用 MAP3D 算法和点扩散函数重建来重建 3D 堆栈图像。使用 Feldkamp 算法和 Shepp-Logan 过滤器重建 CT 图像，并在 FIJI 中打开 CT 和 SPECT 图像。使用重新切片工具从默认轴向图像生成冠状视图图像，并在 SPECT 图像上执行 z 堆栈和投影，以添加每个切片的计数数据。生成单个图像以便于分析。并使用 Phantom Eppendorf 管作为参考，调整 CT 和 SPECT 图像的大小并配准。使用自动阈值对 CT 图像进行二值化，反转堆栈并执行 z 堆栈和投影，以生成肺部轮廓以供分析。旋转 CT 和 SPECT 图像，并使用通道工具将它们合并为一个图像。然后在右肺周围画一个感兴趣的区域，以确定粘膜纤毛的清除率。在图像采集和处理之后，可以使用体模管作为标志对 CT 和 SPECT 图像进行共定位。可以从 CT 图像生成肺部掩码，并用于绘制肺部周围感兴趣的区域，以便在不同时间点进行分析。在该分析中，共有 8 只小鼠在不同的日子在相同的实验条件下扫描了 2 次，以测试该方案的可重复性。配对 T 检验分析显示重复扫描之间无显著差异。另外两只小鼠还在相同的实验条件下在不同日期进行了 3 次扫描。单因素方差分析显示重复扫描之间具有显著匹配性。在这里，可以观察到来自其中两只扫描小鼠的代表性图像。能够可视化气道至关重要。为了验证插管是否成功，如有必要，请取出套管并重新插管，以避免错误的食管插管。该方案可应用于疾病模型，以评估不同药物对气道清除率的影响，并帮助开发新的药物治疗。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

重复测量啮齿类动物呼吸生理参数并采集气道炎症细胞是理想的研究手段，但通常难以实现。本文介绍一种可重复的小鼠经口插管方法，该方法允许对气道高反应性进行多次测量，并可重复采集气道炎症细胞。...

一种可逆、非侵入性的小鼠气道阻力测量与支气管肺泡灌洗液采集方法

来源：Zhang, J., et al. P. 解析病毒逃逸细胞因子产生过程中的先天免疫信号传导。 J. Vis. Exp.

小鼠经鼻感染鼠疱疹病毒以评估宿主免疫应答

本方案详细描述了使用强迫振荡技术（flexiVent；SCIREQ...

使用强制振荡技术评估小鼠呼吸系统力学

内皮糖萼/内皮表面层最适合通过活体显微镜进行研究。在肺等运动器官中，活体显微镜技术上具有挑战性。我们展示了如何结合明场与荧光显微镜技术，在自由运动的组织中估算内皮表面层厚度 体内...

in vivo 条件下小鼠肺血管内皮表面层的测量

本文介绍了一种利用小鼠气管可视化并定量纤毛运动及纤毛驱动流的简便且可靠的技术。该技术可经修改后用于确定多种因素对纤毛运动的影响，包括药理学试剂、遗传因素、环境暴露，以及黏液负荷等机械因素。...

ex vivo 法对啮齿类动物气道上皮纤毛运动进行高分辨率成像

宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。...

利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

尽管 体外 宿主-病原体相互作用的研究有助于表征特定的免疫应答， 体内 需要使用模型来观察复杂反应的影响。 白色念珠菌 暴露后...

研究微生物群落 体内宿主介导的相互作用模型 白色念珠菌 和 铜绿假单胞菌 在气道中

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通过双腔体积描记法评估清醒小鼠的呼吸功能

本文报道了分析小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能及肺部细菌清除能力的常用方法。这些方法用于研究体外荧光素异硫氰酸酯微球的吞噬作用以及体内的吞噬作用 铜绿假单胞菌 绿色荧光蛋白。我们还描述了一种清除方法 P. aeruginosa...

小鼠肺泡巨噬细胞吞噬作用与细菌清除

本文介绍了使用无创实时全身体积描记法（WBP）系统测量咳嗽的方法，以及小鼠组织样本采集的标准操作流程，并概述了一些评估气道炎症的方法。...

检测小鼠咳嗽和气道炎症的方法

学习使用SPECT/CT双模态成像技术在小鼠体内评估气道粘液纤毛清除功能的方法。该方案具有可重复性，适用于多种疾病模型和药物效应研究，为呼吸系统疾病研究提供可靠的实验手段。

在体内评估小鼠的粘液清除

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