Name: 使用基于曲线的转换工具量化纤维胶原蛋白组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解如何使用基于曲线变换的MATLAB工具量化细胞外基质中的纤维胶原蛋白组织。该方法利用CT-FIRE软件提取单根纤维，适用于正常与病变组织，助力疾病机制研究。

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我们感谢多年来为 CT-FIRE 和 CurveAlign 做出贡献的众多贡献者和用户，包括 Rob Nowak 博士、Carolyn Pehlke 博士、Jeremy Bredfeldt 博士、Guneet Mehta、Andrew Leicht、Adib Keikhosravi 博士、Matt Conklin 博士、Jayne Squirrell 博士、Paolo Provenzano 博士、Brenda Ogle 博士、Patricia Keely 博士、Joseph Szulczewski 博士、Suzanne Ponik 博士，以及 Swati Anand 和 Curtis Rueden 提供的额外技术支持。本研究得到了半导体研究公司、Morgridge 研究所，以及美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01CA199996、R01CA181385 和 U54CA210190 对 K.W.E. 的资助支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了使用 CT-FIRE 和 CurveAlign 进行纤维状胶原定量分析的方法，可应用于任何包含胶原纤维或其他适合通过 CT-FIRE 或 CurveAlign 进行分析的线状或纤维状细长结构的图像。例如，弹性蛋白或弹性纤维也可在该平台上以类似方式处理。我们已在计算机生成的合成纤维图像上测试了这两种工具21。用户应根据具体应用选择最适合其数据的分析模式。CT 纤维分析模式可直接利用 CT 中的curvelet来表征纤维的位置和取向，对局部纤维结构的变化具有较高敏感性。该模式适用于在复杂条件下定位纤维及其方向，例如噪声水平较高、纤维呈弯曲形态或纤维厚度变异较大的情况。然而，由于 CT 模式仅能检测图像中最亮的部分，在图像强度差异较大时，可能会遗漏部分强度较低的纤维。
此外，CT 模式无法提供单根纤维的信息。与 CT 模式不同，CT-FIRE 模式可计算单根纤维的特性，并能分析所有强度超过指定阈值的纤维。CT-FIRE 模式面临的挑战包括：1）当纤维沿长度方向的强度或图像中纤维厚度存在较大变化时，完整纤维提取的准确性可能降低或受...

纤维状胶原是突出的细胞外基质（ECM）结构成分。其排列结构的变化会影响组织功能，并可能与多种疾病的进展相关，包括成骨不全症1、心脏功能障碍2、伤口愈合3以及多种癌症，如乳腺癌4,5,6、卵巢癌7,8、肾癌9和胰腺癌10。目前已有多种成熟的成像技术可用于可视化纤维状胶原，例如二次谐波生成显微技术11、结合明场或荧光显微镜、偏振光显微镜使用的染料或染色剂12、基于液晶的偏振显微技术（LC-PolScope）13以及电子显微镜技术14。随着纤维状胶原排列结构重要性的日益明确，以及这些方法的广泛应用，对更优胶原纤维分析方法的需求也不断增长。
人们已做出许多努力，以开发用于纤维状胶原自动测量的计算方法。现有的免费软件工具主要侧重于通过采用像素的一阶导数或结构张量15,16，或基于傅里叶变换的图像块频谱分析17，来计算纤维的排列或取向。然而，这些工具均存在一定的局限性，例如需要人工干预步骤、在噪声背景中对纤维边缘的检测不准确，或缺乏对局部特征的表征能力。
与其他可免费获取的开源软件工具相比，本方案所述方法采用剪切波变换（CT）——一种最优的、多尺度的、具有方向性的图像表征方法——来去除纤维状胶原图像中的噪声，并增强或追踪纤维边缘。纤维的位置和方向信息可直接从纤维本身获取，而无需依赖间接的逐像素或逐窗口信息来推断纤维组织的度量参数。这一基于CT的分析框架18,19,20,21 可在整体、感兴趣区域（ROI）或单根纤维层面上量化纤维组织结构，主要通过两个独立但相互关联的软件包实现，分别为“CT-FIRE”18,21 和“CurveAlign”19,21。在软件实现方面，CT-FIRE利用多个尺度上的CT系数重建图像，以增强边缘并降低噪声；随后，在CT重建图像上应用单根纤维提取算法，用于追踪纤维，确定其代表性中心点，从中心点延伸纤维分支，并连接分支形成纤维网络。在CurveAlign中，用户可指定某一尺度的CT系数用于追踪局部纤维方向，提取并分组curvelet的方向与位置信息，以估计相应位置处的纤维取向。该量化分析框架已发展十余年，在功能、用户界面和模块化等方面均经历了显著改进。例如，该工具可可视化局部纤维取向，并允许用户测量多达三十种纤维特征，包括单根纤维的长度、角度、宽度和直线度等个体属性，以及密度和排列程度等整体参数。此外，用户还可测量纤维角度相对于手动或自动分割边界的相对取向，这在乳腺癌22 和胰腺癌研究10 的基于图像的生物标志物开发中具有重要作用。该平台提供多个功能模块，包括感兴趣区域分析、自动边界生成和后处理模块。ROI模块可用于标注不同形状的感兴趣区域，并进行相应的&#160;ROI分析。作为应用示例，自动边界生成模块可用于将苏木精-伊红（H&amp;#38;E）明场图像与二次谐波生成（SHG）图像配准，并从配准后的H&amp;#38;E图像中生成肿瘤边界的图像掩膜。后处理模块有助于对单个图像输出的数据文件进行处理和整合，以便进行可能的统计分析。
该定量分析平台无需编程或图像处理的前期经验，可处理包含数百甚至数千张图像的大型数据集，从而为生物学或生物医学应用中的胶原组织高效定量提供支持。该平台已被全球众多研究人员广泛应用于不同研究领域，包括我们自己的研究团队。关于CT-FIRE和CurveAlign的主要出版物共有四篇18,19,20,21，其中前三篇截至2020年5月4日已被Google Scholar引用272次。对引用该平台（CT-FIRE或CurveAlign）的文献进行综述表明，约有110篇期刊论文直接使用该平台进行分析，其中约35篇为与我们课题组的合作研究，其余约75篇由其他研究团队独立完成。例如，该平台已被用于以下研究：乳腺癌22,23,24、胰腺癌10,25、肾癌9,26、伤口愈合3,27,28,29,30、卵巢癌8,31,7、子宫骶骨韧带32、低磷性牙本质33、基底细胞癌34、缺氧性肉瘤35、软骨组织36、心脏功能障碍37、神经元38、胶质母细胞瘤39、淋巴管收缩40、纤维支架41、胃癌42、微管43以及膀胱纤维化44。图1展示了CurveAlign在癌症成像中的应用，用于从二次谐波（SHG）图像中识别乳腺癌相关的胶原特征19。图2描述了该平台的典型工作流程示意图。尽管这些工具已在技术层面被综述过18,19,21，并且已有使用CurveAlign进行取向分析的标准操作流程20可供参考，但一份展示所有关键功能的可视化操作指南仍具有重要价值。本文所提供的可视化操作流程将有助于用户更高效地学习使用该平台，并更有效地解答用户可能遇到的问题与疑虑。

<table><tbody><tr><td>CT-FIRE</td><td>威斯康星大学麦迪逊分校</td><td>N/A</td><td>开源软件，可从 https://eliceirilab.org/software/ctfire/ 获取</td></tr><tr><td>CurveAlign</td><td>威斯康星大学麦迪逊分校</td><td>N/A</td><td>开源软件，可从 https://eliceirilab.org/software/curvealign/ 获取</td></tr></tbody></table>

基于曲线波变换工具量化纤维状胶原组织结构

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

纤维状胶原是细胞外基质（ECM）的主要成分，其拓扑结构的变化已被证实与多种疾病的发展相关，包括乳腺癌、卵巢癌、肾癌和胰腺癌。目前公开可用的纤维定量软件工具主要集中在纤维排列或取向的计算上，且存在诸多局限性，例如需要手动操作步骤、在噪声背景中难以准确检测纤维边缘，或缺乏对局部特征的表征能力。本方案所描述的胶原纤维定量工具采用基于曲线波变换（curvelet transform, CT）的最优多尺度图像表征方法。该算法能够去除纤维状胶原图像中的噪声，并增强纤维边缘，从而直接从单根纤维获取其位置和取向信息，而非依赖其他工具所获得的间接的像素级或窗口级信息。该基于CT的分析框架包含两个独立但相互关联的软件包，分别命名为“CT-FIRE”和“CurveAlign”，可在整体、感兴趣区域（ROI）或单根纤维的层面上量化纤维组织结构。该定量框架已发展十余年，现已演变为一个全面且以用户需求为导向的胶原定量平台。利用该平台，用户可测量多达约三十种纤维特征，包括单根纤维的长度、角度、宽度和直度等个体属性，以及密度和排列等整体性测量参数。此外，用户还可测量纤维相对于手动或自动分割边界的取向角度。该平台还提供多个附加模块，包括ROI分析、自动边界生成和后处理功能。使用该平台无需具备编程或图像处理的先验经验，且能够处理包含数百甚至数千张图像的大型数据集，从而为生物学或生物医学应用提供高效的胶原纤维组织结构定量分析能力。

这些方法已在众多研究中成功应用。一些典型的应用包括：1) Conklin 等人22使用 CurveAlign 计算肿瘤相关胶原特征，发现原位导管癌（DCIS）病灶中胶原纤维更倾向于垂直于导管周长方向排列；2) Drifka 等人10在 CurveAlign 中使用 CT-FIRE 模式对胰腺导管腺癌以及正常/慢性胰腺炎组织的间质胶原排列进行定量分析，发现癌组织中的胶原排列程度高于正常/慢性组织；3) Alkmin 等人7使用 CurveAlign 对卵巢间质胶原的二次谐波成像（SHG）图像中的 F-肌动蛋白纤维角度分布和总体胶原排列进行量化，表明基质形态在驱动细胞运动性和 F-肌动蛋白排列中起重要作用；4) LeBert 等人3将 CT-FIRE 应用于斑马鱼伤口修复模型的 SHG 图像，发现急性损伤后胶原纤维厚度增加；5) Devine 等人45在 CurveAlign 中使用 CT-FIRE 模式...

本文介绍了一种利用基于曲线波变换的开源MATLAB软件工具，定量分析正常和病变组织细胞外基质中纤维状胶原排列的方法。该工具可应用于含有胶原纤维或其他类型线状结构的图像。

纤维状胶原是细胞外基质（ECM）的主要成分，其拓扑结构的变化已被证实与疾病进展相关……

该工具可在全球感兴趣区域和单根纤维层面上，对多种疾病相关的细胞外基质中纤维状胶原组织的改变进行定量分析。该工具采用曲线波变换（curvelet transform）——一种最优的多尺度方向性图像表征方法，以去除图像噪声并增强纤维边缘。全面且用户友好的模块设计实现了高效定量分析。进行单根纤维提取时，按照协议打开 CT-FIRE，点击“打开文件”以选择一个或多个感兴趣的图像。在参数面板中，点击“更新”并调整背景阈值和成核搜索半径。当所有参数设置完成后，点击“运行”。分析完成后，单击输出表格中的任意元素以可视化结果，并检查 ctFIREout 子文件夹中的输出文件。如需分析感兴趣区域，请单击“打开文件”以加载一张或多张图像，并选择需要标注的图像。在运行选项面板中，从下拉菜单中选择“感兴趣区域管理器”，然后单击“运行”以启动感兴趣区域管理器模块。接下来，点击“绘制感兴趣区域”菜单 D 下拉菜单，并绘制感兴趣区域。如果已完成全图像 CT-FIRE 分析且结果已保存在默认目录中，请在感兴趣区域列表中点击一个或多个感兴趣区域，然后点击“CT-FIRE 感兴趣区域分析器”以启动感兴趣区域后处理分析模块。如果尚未进行全图像 CT-FIRE 分析，请在感兴趣区域列表中点击一个或多个感兴趣区域，然后点击“对 ROI 应用 CT-FIRE”以直接将 CT-FIRE 分析应用于所选的感兴趣区域。对于高级后处理，勾选“out. adv”复选框，然后点击后处理以启动高级后处理图形界面。在分析模块中，点击选择文件并可视化纤维，以便根据原始纤维标签页中的标签输入纤维数量。单击“确认更新”以进入阈值处理操作，并勾选阈值设置复选框以启用阈值参数。从下拉菜单中选择四种阈值处理方法之一，并在阈值面板中为一个或多个纤维属性输入所需的阈值。然后单击“立即阈值处理”以应用上述阈值条件，并查看文件名以“metrics visualization”结尾的提示图，该图将显示根据自定义颜色映射叠加在原始图像上的已选纤维。设置阈值后，单击“保存纤维”以保存选定的纤维信息，然后单击“生成统计”并单击“确定”以生成汇总统计结果。若要合并多个图像的结果，请勾选批量模式，并在生成汇总统计结果前从弹出窗口中选择多个待分析的图像或图像堆栈。如需提取基于CT的纤维特征，请按照操作流程打开CurveAlign软件，在主图形用户界面中单击“获取图像”，然后从提示窗口中选择一个或多个图像或图像堆栈。输入保留系数的比例值，即在纤维分析中将使用的 CT 最大系数的比例，然后点击运行。重复操作以设定合适的阈值。当处理完成后，每幅图像的一些统计摘要信息将显示在一个输出表格中，所有输出文件将自动保存在原始图像目录下名为 CA_out 的子文件夹中。为了提取基于 CT-FIRE 的纤维特征，请点击纤维分析方法下拉菜单，选择 CT-FIRE 纤维，以利用纤维中心点和纤维角度来表征纤维。对于肿瘤边界的相对取向分析，请选择 TIFF 边界条件。打开 CurveAlign 软件，在主图形用户界面中点击“get images”，然后在弹出窗口中选择一个或多个图像或图像堆栈。在主要参数面板中，输入距最近边界的距离，以仅评估该距离范围内的纤维。在输出选项面板中，勾选边界关联复选框，以可视化与纤维、纤维段或曲线段相关联的边界上的点，然后点击运行，再点击输出表格以查看结果。如果已执行完整的图像 CurveAlign 分析并将结果保存在默认目录中，请在感兴趣区域列表中点击一个或多个感兴趣区域，然后点击 CurveAlign 感兴趣区域分析器，以运行后续的感兴趣区域分析。如果尚未进行完整的图像CurveAlign分析，请在感兴趣区域列表中单击一个或多个感兴趣区域，然后单击“对感兴趣区域应用CurveAlign”，以直接对选定的感兴趣区域执行CurveAlign分析。在该图像中，可观察到组织微阵列核心的叠加图像。在放大图中，可观察到感兴趣区域内平行和垂直于肿瘤边界的纤维结构。CurveAlign 输出的叠加图像显示了肿瘤边界以及具有代表性的纤维位置和取向。该方法不仅可用于定量分析胶原纤维，还可用于分析其他线状结构（如弹性蛋白），并有望促进癌症的早期诊断和预后分析。

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使用基于曲线的转换工具量化纤维胶原蛋白组织

采用延时显微镜和图像处理技术，在环境可控的生物反应器中对成纤维细胞介导的凝胶收缩及纤维蛋白纤维重排进行为期48小时的观察与分析 时期。...

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用于研究跟腱撞击力学生物学的小鼠后肢离体模型

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通过使用原子力显微镜悬臂上的微米级小球进行压痕实验，测量了内皮糖萼的力学特性。内皮细胞在定制腔室中于生理流动条件下培养，以诱导糖萼表达。采用薄膜模型分析数据，以确定糖萼的厚度和模量。...

利用原子力显微镜量化内皮糖萼的机械特性

成像变性胶原链 体内 和 离体 通过光触发笼锁胶原模拟肽的杂交

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