Name: 交替浸入葡萄糖中，在斑马鱼中产生长期血糖超血症 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 了解利用斑马鱼建立长期高血糖模型的非侵入性方法，通过交替浸入葡萄糖溶液模拟二型糖尿病。该技术可研究高血糖对视网膜及生理功能的长期影响，为糖尿病并发症机制探索与药物筛选提供可靠平台。

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我们感谢VPC、CJR和MCP在本实验方案开发过程中的贡献。EMM获得了美国大学文理学院研究生支持基金的资助，以开展本项研究。&#160;本工作还得到了美国大学教师梅隆奖以及美国大学文理学院经费的支持（均授予VPC）。

所有实验程序均经美国大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 准备溶液罐
<ol>
	<li>获取六个水箱，每个实验组（葡萄糖、甘露醇和水）各两个。将其中一箱标记为“饲养箱”（用于饲养鱼类），另一箱标记为“溶液箱”（用于盛放溶液）。 
	注意：甘露醇处理组作为渗透压对照组，水处理组作为操作/应激对照组。每个处理组的水箱、通气管/气石、盖子和清洁用品必须分开使用。</li>
	<li>若使用的鱼总数少于20条，使用2 L的水箱；若使用的鱼总数多于20条，使用4 L的水箱。 
	注意：每个采样时间点每种处理组使用5-10个样本。</li>
	<li>将水箱置于28-29 °C的水浴中以维持水温。</li>
	<li>第1天，将鱼放入各自对应的处理溶液（葡萄糖、甘露醇、水）中处理24小时（“水至处理”）。第2天，将鱼从处理溶液转移至水中24小时（“处理至水”）。第3天，将鱼从水转移至处理溶液中（“水至处理”）。此交替暴露处理持续至实验结束图1). 将经水处理的对照组鱼每天从水中转移至水中。</li>
	<li>确保在整个实验期间，每天在相同的2小时时间段内对鱼类进行喂食和转移。</li>
</ol>
2. 准备鱼类
<ol>
	<li>使用成年斑马鱼（4个月至1年）5。</li>
	<li>鱼类到达实验室后，每天投喂碾碎的Tetramin鱼粮。</li>
	<li>记录所有鱼缸的pH值和温度，并记录鱼类的一般状况。</li>
</ol>
3. 转移鱼类
<ol>
	<li>使用标准的鱼网将每个处理组的鱼从饲养箱转移到相应的溶液箱中。</li>
	<li>将装有鱼的箱子放回水浴中，并重新安装气石和箱盖。此时该箱成为“饲养箱”，而先前盛放鱼的箱子则成为“溶液箱”。</li>
	<li>弃去旧溶液，并清洗箱子以及箱盖、通气管、气石和鱼网，以防止葡萄糖和甘露醇的残留积累。 
	注意：请勿使用肥皂清洗器具。应使用清水，并为每种处理条件配备专用的刷子或海绵，以彻底清洁箱子。</li>
	<li>用纸巾将新清洗完毕的“溶液箱”擦干。使用该箱配制次日所需的溶液。确保其他器具也已擦干，并按相应的处理组分开存放。 
	注意：应记录每天鱼类转移所离开和进入的溶液，以及为次日配制的溶液。例如：鱼类从葡萄糖溶液转移至H2O，为明天配制新的1%葡萄糖溶液。</li>
</ol>
4. 转移后溶液的配制
<ol>
	<li>配制糖溶液
	<ol>
		<li>向每个溶液罐中加入 2 L（或 4 L）系统用水（系统用水定义为已按正确比例添加盐溶液，并且温度与储备罐和处理罐相同的水）。</li>
		<li>使用电子天平和各自的称量舟，分别称取所需量的葡萄糖和甘露醇（参见下文步骤 5）。</li>
		<li>将称量好的葡萄糖或甘露醇等分试样加入相应且已清洁的溶液罐中，罐内仅含系统用水。</li>
		<li>使用不同的玻璃搅拌棒分别搅拌葡萄糖和甘露醇溶液，直至糖完全溶解。</li>
		<li>将溶液罐放回水浴中，并盖上相应的盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制水溶液
	<ol>
		<li>向实验罐（2 L 或 4 L）中加入系统用水。</li>
		<li>将这些“溶液罐”放回水浴中，并盖上相应的盖子。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 百分比的变化
<ol>
	<li>在治疗的前两周内，将鱼维持在1%的溶液中：在4 L水箱中加入40 g葡萄糖或甘露醇。</li>
	<li>在治疗的第3周和第4周，将鱼维持在2%的溶液中：在4 L水箱中加入80 g葡萄糖或甘露醇。</li>
	<li>在治疗的最后4周内，将鱼维持在3%的溶液中：在4 L水箱中加入120 g葡萄糖或甘露醇。</li>
</ol>
6. 测量血糖水平和采集组织
<ol>
	<li>每次使用0.02%的三卡因溶液麻醉两条鱼。</li>
	<li>使用剃刀在鳃后方直接切断鱼头。</li>
	<li>测量血糖值。 
	注意：我们使用血糖仪（例如Freestyle Lite）测量血糖，并将试纸直接接触暴露的心脏（心脏血液样本）。</li>
	<li>从鱼体内解剖所需组织（如脑、肌肉等）。</li>
	<li>将采集的组织置于干冰上速冻后保存于-80 °C冰箱中，或用4%多聚甲醛固定，或放入缓冲液中以备立即使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

糖尿病是一个全国性的问题。研究表明，到2030年，预计有约4亿人将患有某种形式的糖尿病。在啮齿类动物模型中，2型糖尿病（Type 2 DM）通常通过基因操作进行研究。在大鼠中，Zucker糖尿病性肥胖大鼠（ZDF）和Otsuka Long-Evans Tokushima肥胖大鼠（OLETF）为研究2型糖尿病的影响提供了更多信息10。此外，高脂饮食已被用于在啮齿类动物中诱导高血糖。这与本文提出的非侵入性方法类似。通过使用我们的非侵入性方案，我们可以在原本健康的斑马鱼中诱导长达8周的高血糖状态，从而模拟持续性高血糖。
在测量血糖后，可采集组织（视网膜和脑）用于后续分析。生理学差异，例如视网膜电图（ERG）记录，可直接从视网膜眼杯中测量21,30。行为反应（如视动反应）或认知差异（Rowe et al., 2020）可在测量血糖前进行评估。用于通过Western Blot检测蛋白水平时，将组织置于RIPA裂解液中，或进行速冻...

斑马鱼（Danio rerio）正迅速成为研究疾病和认知功能的常用动物模型1。由于其易于进行遗传操作，且在早期发育阶段胚胎具有透明性，因此非常适合用于研究具有明确遗传基础的人类疾病。例如，斑马鱼已被用于研究霍特-奥拉姆综合征、心肌病、肾小球囊性肾病、肌营养不良以及糖尿病（DM）等多种疾病1。此外，由于该物种体型小、易于饲养且繁殖力高，斑马鱼模型尤为理想2,3。
斑马鱼的胰腺在解剖结构和功能上均与哺乳动物胰腺相似4。因此，斑马鱼因其体型小、繁殖力高以及内分泌结构相似等独特特性，成为研究糖尿病（DM）相关并发症的合适候选模型。在斑马鱼中，有两种实验方法可用于诱导糖尿病特征性的长期高血糖状态：葡萄糖负荷（模拟2型糖尿病）和胰岛素分泌终止（模拟1型糖尿病）5,6。实验上，可通过注射链脲佐菌素（STZ）或阿洛酮（Alloxan）化学破坏胰腺β细胞，从而阻断胰岛素分泌。STZ已在啮齿类动物和斑马鱼中成功应用，可导致视网膜病变7,8,9、认知功能障碍10以及肢体再生受损11等并发症。然而，在斑马鱼中，β细胞在处理后会再生，因此需要多次“加强注射”STZ以维持糖尿病状态12。另一种方法是手术切除斑马鱼胰腺6。这两种方法均为高度侵入性操作，需多次注射且恢复时间较长。
相反，可通过接触外源性葡萄糖无创地诱导高血糖。在本方案中，将鱼类浸入高浓度葡萄糖溶液中24小时5,13，或持续2周14,15,16。外源性葡萄糖通过皮肤、摄食和/或鳃部吸收，导致血糖水平升高。由于这种非侵入性技术并不直接操控胰岛素水平，因此不能声称可诱导2型糖尿病（Type 2 DM）。然而，该方法可用于研究由高血糖引起的并发症，而高血糖正是2型糖尿病的主要症状之一。
最近，研究人员通过操控胰腺和十二指肠同源框基因1（pancreatic and duodenal homeobox 1）构建了斑马鱼pdx1-/-突变体，该基因与人类2型糖尿病（DM）的遗传病因相关。利用该突变体，研究人员能够模拟胰腺发育异常、高血糖，并研究高血糖诱导的糖尿病性视网膜病变17,18。
本文介绍了一种利用交替浸泡方案实现无创性高血糖诱导的方法。该方案可维持高血糖状态长达8周，并观察到后续出现的并发症。简言之，将成年斑马鱼置于糖溶液中24小时，随后转入清水溶液中24小时。与持续浸泡于外源性葡萄糖溶液不同，糖液与清水交替处理可模拟糖尿病中血糖水平的波动变化。此外，采用葡萄糖交替处理方案还能延长高血糖诱导的时间，因为斑马鱼在交替暴露于高浓度外源性葡萄糖环境时，其代偿能力较弱。为验证该方法的可行性，我们提供了实验数据，表明采用此方案诱导的高血糖会改变视网膜的化学成分与生理状态。

<table><tbody><tr><td>输气管</td><td>petsmart</td><td>5291863</td><td>可用于水族箱中空气的循环</td></tr><tr><td>气泵</td><td>petsmart</td><td>5094984</td><td>可用于水族箱中空气的循环</td></tr><tr><td>气石</td><td>petsmart</td><td>5149683</td><td>可用于水族箱中空气的循环</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270-5KG</td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Acros Organics</td><td>AC125340050</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Lite 血糖仪</td><td>Amazon</td><td>B01LMOMLTU</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Lite 测试条</td><td>Amazon</td><td>B074ZN3H2Z</td><td></td></tr><tr><td>捞网</td><td>petsmart</td><td>5175115</td><td></td></tr><tr><td>水族箱</td><td>Amazon</td><td>B0002APZO4</td><td></td></tr></tbody></table>

交替葡萄糖浸泡法诱导斑马鱼持续高血糖

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

斑马鱼（Danio rerio）是研究2型糖尿病（T2DM）典型特征——慢性高血糖——影响的理想模型。该交替浸浴方案是一种无创、逐步诱导高血糖的方法，可持续长达八周。成年斑马鱼交替暴露于糖（葡萄糖）和水中，每次各持续24小时。斑马鱼首先在1%葡萄糖溶液中处理2周，随后在2%溶液中处理2周，最后在3%溶液中处理剩余的4周。与水处理（应激对照）和甘露醇处理（渗透压对照）的对照组相比，葡萄糖处理组斑马鱼的血糖水平显著升高。葡萄糖处理组斑马鱼的血糖水平达到对照组的3倍，表明在处理4周和8周后均可成功诱导高血糖。持续性高血糖与视网膜中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）水平升高、核因子κB（NF-kB）&#160;水平升高、生理反应减弱以及认知功能缺陷相关，提示该方案可用于模拟糖尿病并发症。

使用本方案（图1），经4周和8周处理后，血糖值均显著升高（图2A），其中高血糖定义为水处理组和甘露醇处理组对照平均值的3倍。水处理对照组每天被转移入和移出水中，以提供应激/操作对照。在体外葡萄糖研究中，甘露醇作为渗透压对照19,20，因为甘露醇是一种与葡萄糖类似的六碳糖，但不会被细胞摄取。为了与这些研究以及其他斑马鱼研究21保持一致，我们以与葡萄糖相同的浓度给予甘露醇，以确定所观察到的效应是由于葡萄糖暴露引起的高渗透压所致，还是葡萄糖特异性的效应。
通过使用0.02%三卡因将鱼麻醉至鳃部运动减缓，然后进行断头处理，以采集血液样本。血糖水平通过血糖仪（图2B）测定，将血糖仪试纸直接接触穿刺后的心脏（即心腔血液）进行检测。
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本方案可对斑马鱼进行长达8周的非侵入性高血糖诱导。利用该方案，可深入研究高血糖的不良影响。

斑马鱼（Danio rerio）是研究2型糖尿病（T2DM）标志性特征——慢性高血糖效应的理想模型。这一……

本方案通过一种先升高后降低的模式诱导斑马鱼出现高血糖，该模式模拟了2型糖尿病中观察到的高血糖状态。该技术的主要优势在于其为非侵入性方法，可确保所观察到的斑马鱼体内任何改变确实由高血糖引起。本方案有望用于探索针对高血糖并发症的治疗途径或药物。本方案包含多个步骤，但只要正确且仔细地遵循这些步骤，操作很快就会变得得心应手。但请始终牢记，在整个实验过程中必须始终轻柔、人道地对待动物。首先设置六个水箱，每个实验组使用两个。若鱼的总数少于20条，使用两升的水箱；若鱼的总数超过20条，则使用四升的水箱。将两个水箱中的一个标记为饲养箱，另一个标记为溶液箱。将水箱置于28至29摄氏度的水浴中，以维持水温。第一天，将鱼类放入各自相应的处理溶液中，持续24小时。第二天，将鱼类从处理溶液转移到水中，持续24小时。第三天，将鱼类从水中转移到处理溶液中。在实验剩余时间内持续进行这种交替暴露处理。每天将经水处理的对照组鱼类从水中转移至水中。确保在整个实验期间，每天在相同的两小时时间窗口内对鱼类进行喂食和转移操作。使用标准的鱼网将每个处理组的鱼类从饲养箱转移到相应的溶液箱中。将装有鱼的箱子放回水浴中，并重新连接气石和箱盖。此时该箱即为饲养箱，而之前盛放鱼的箱子则变为溶液箱。弃去旧溶液，并清洗水箱、水箱盖、通气管、曝气石和网具，以防止葡萄糖和甘露醇的积累。使用水和针对每种处理条件专用的海绵彻底清洁水箱。用纸巾将清洗干净的溶液水箱擦干，并使用该水箱配制次日所需的溶液。确保其他物品经过干燥处理，并按相应的处理组分开。配制糖溶液时，向每个溶液罐中加入两升或四升系统水。使用电子天平和分别为每种化学物质准备的称量舟，准确称取所需量的葡萄糖和甘露醇。将称量好的葡萄糖或甘露醇等分试样加入相应的洁净溶液罐中。使用不同的玻璃搅拌棒分别搅拌溶液，直至糖类完全溶解。然后将溶液罐放回水浴中，并盖上相应的盖子。配制水溶液时，用系统水填充实验水箱。将这些溶液罐放回水浴中，并盖上相应的盖子。经过四周和八周的葡萄糖处理后，血糖值均显著升高。高血糖定义为经水处理组和甘露醇处理组对照组平均值的三倍。在高血糖持续四周后采集的视网膜组织中，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）水平升高。视网膜中的穆勒胶质细胞可表达GFAP，而此类细胞在糖尿病性视网膜病变中会发生改变。GFAP水平的升高与核因子κB水平的上升相关。这表明诱导的高血糖会引发炎症反应和反应性胶质增生。治疗四周后的视网膜电图（ERG）记录显示，与甘露醇处理的对照组相比，葡萄糖处理组的视网膜反应减弱。高血糖鱼类的光感受器和双极细胞组分的振幅均降低。该操作可结合其他高血糖检测方法进行补充。例如，可采用记忆实验来评估认知功能障碍，或记录基于视觉的反应（如视动反应）以评估与视力相关的并发症。该技术建立后，我们实验室已能够利用它在斑马鱼模型中研究高血糖诱导的并发症。我们在治疗四周后相对较快地观察到了这些并发症。

alternate-immersion-glucose-to-produce-prolonged-hyperglycemia

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

交替浸入葡萄糖中，在斑马鱼中产生长期血糖超血症

我们演示了对成年斑马鱼进行腹腔注射的方法。我们使用由Micro4控制器和UltraMicroPump III驱动的10 μl...

成年斑马鱼腹腔注射

本视频介绍了利用链脲佐菌素药物建立斑马鱼1型糖尿病模型的技术，以研究糖尿病并发症和代谢记忆的病理生理学机制。...

链脲佐菌素处理：一种斑马鱼1型糖尿病模型

代谢记忆是指即使通过药物实现正常血糖后，糖尿病并发症仍持续进展的现象。本文描述了一种独特的糖尿病斑马鱼模型，可用于研究代谢记忆中可通过有丝分裂遗传的表观遗传组分 体内.

糖尿病及代谢记忆的斑马鱼模型

斑马鱼是研究能量稳态的重要模式生物。通过使用对NADH2敏感的氧化还原指示剂刃天青（alamar...

高通量 Danio rerio 能量消耗检测

本研究描述了在斑马鱼中建立急性与慢性高血糖模型的方法。目的是研究高血糖对生理过程的影响，例如稳态神经发生及损伤诱导的神经发生。本研究还强调了利用斑马鱼结合正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）技术追踪放射性标记分子（此处为[18F]-FDG）的应用。...

斑马鱼中高血糖的急性和慢性模型：评估高血糖对神经发生及放射性标记分子生物分布影响的方法

本文介绍了一种实验方法，可用于对成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统进行简便分析，作为长期血管病变（与新生血管形成及结构改变相关）研究中的快速检测手段。...

通过鱼类之眼研究糖尿病：成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的显微解剖、可视化与分析

β细胞功能对于血糖稳态至关重要，可通过基因编码的钙离子内流报告系统在单细胞水平上进行评估。...

利用斑马鱼胰岛单细胞分辨率钙成像分析β细胞功能

我们介绍了一种用于评估认知功能的行为实验装置。我们提供的数据显示，斑马鱼在完成任务后8周仍能记住该任务。我们还发现，高血糖斑马鱼的认知表现发生改变，表明该实验范式适用于认知与记忆相关研究。...

利用斑马鱼作为模式系统进行的三室选择行为实验

在完全沉浸式虚拟现实环境中，采用经典恐惧条件反射范式对人类受试者进行了研究。通过辨别范式，利用皮肤电导反应来测量对动态虚拟蛇和蜘蛛（条件刺激）的条件性恐惧、线索和情境记忆保持以及消退情况，实验在两个不同的虚拟情境中进行。...

在完全沉浸式三维虚拟现实中进行的人类恐惧条件反射实验

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。...

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

了解利用斑马鱼建立长期高血糖模型的非侵入性方法，通过交替浸入葡萄糖溶液模拟二型糖尿病。该技术可研究高血糖对视网膜及生理功能的长期影响，为糖尿病并发症机制探索与药物筛选提供可靠平台。

交替葡萄糖浸泡法诱导斑马鱼持续高血糖

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