Name: 维持静止人类造血干细胞的文化方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 了解如何在体外维持静止状态的人类造血干细胞，通过模拟骨髓微环境培养条件研究细胞周期调控与分化机制。该方法支持无动物模型的高通量化合物筛选，助力血液疾病治疗研究。

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感谢M. Haraguchi和S. Tamaki提供技术支持和实验室管理，以及K. Shiroshita负责摄影。HK部分由文部科学省/日本学术振兴会的KAKENHI资助（资助编号19K17847）以及日本国立全球健康与医学中心资助。KT部分由文部科学省/日本学术振兴会的KAKENHI资助（资助编号18H02845和18K19570）、日本国立全球健康与医学中心（资助编号26-001和19A2002）、日本医疗研究开发机构AMED（资助编号JP18ck0106444、JP18ae0201014、JP20bm0704042和JP20gm1210011）、小野医学研究振兴财团、神泽医学研究振兴财团以及武田科学振兴财团资助。&#160;

本方案遵循国家全球健康与医学中心的指导原则。所有在小鼠上进行的实验操作均经国家全球健康与医学中心动物实验委员会批准。 
注：本方案的概览见图1。
1. 脂质制备
<ol>
	<li>在玻璃试管中将以下脂质溶于甲醇，浓度如下：棕榈酸钠，16 mg/mL；油酸钠，30 mg/mL；胆固醇，4 mg/mL。将脂质溶液储存于 -30 °C，使用前解冻。</li>
	<li>在洁净玻璃试管中混合步骤 1.1 制备的脂质溶液，加入量需达到终浓度为 100 µg/mL 棕榈酸、100 µg/mL 油酸和 20 µg/mL 胆固醇。例如，配制 10 mL 培养基时，可在玻璃试管中加入 62.5 µL 棕榈酸溶液、33 µL 油酸溶液和 50 µL 胆固醇溶液。</li>
	<li>通过向脂质溶液中通入氮气以蒸发甲醇（图 2A 和 2B）。若无氮气，可使用移液器辅助装置吹入空气。</li>
	<li>将玻璃试管置于 37 °C 水浴中加热，彻底蒸发残留的甲醇（图 2C）。 
	&#8203;注意：在密闭空间内使用高浓度 N2 气体可能存在危害。尽管本方案中用于蒸发甲醇的氮气体积有限，通常认为安全，但仍需确保房间充分通风，并对可能积聚高浓度 N2 气体的区域进行标识，以防意外泄漏。</li>
</ol>
2. 培养基制备
<ol>
	<li>配制含 HEPES 和谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养基。向培养基中加入青霉素和硫酸链霉素，使其终浓度分别为 50 单位和 50 µg/mL。含抗生素的 DMEM/F12 培养基可在 4 °C 保存至少 2 个月。</li>
	<li>向含 HEPES 和谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养基中加入 4% w/v 的牛血清白蛋白（BSA）。</li>
	<li>使用 NaOH 溶液将培养基的 pH 值调节至 7.4–7.8，通常调节至 pH 7.6。</li>
	<li>将培养基加入步骤 1 中准备好的玻璃管中。为获得最大溶解度的溶液，建议加入 3–15 mL 培养基。</li>
	<li>通过超声处理完全溶解脂质（最佳条件：超声时间超过 20 分钟）。BSA 和脂质完全溶解后，样品应保存于 -80 °C，并在 2 个月内使用。使用前立即解冻。</li>
	<li>向 DMEM/F12 培养基中加入 1/1,000 的胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺（ITS-X）混合物。使用 0.22 µm 滤器过滤混合后的培养基（标记为 &#34;培养液&#34;）。使用前，向培养液中加入人干细胞因子（SCF）和人血小板生成素（TPO），使其终浓度均为 3 ng/mL。加入细胞因子和 ITS-X 后，培养基不可保存。</li>
	<li>染色缓冲液：向不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 10% FCS。该溶液可在 4 °C 保存 2 周。</li>
	<li>解冻培养基：向 DMEM/F12 培养基中加入 10% FCS。该溶液为一次性使用。</li>
	<li>细胞因子储备液：将人 SCF 或人 TPO 分别溶于不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 中，浓度为 20 µg/mL。该溶液在 -80 °C 可保存至少一年而不损失活性。解冻后，将储备液保存于 4 °C，并在 1 个月内使用。 
	&#8203;注意：每次采购后均需检测批次，以避免 BSA 中污染物的差异。使用不同批次的 BSA 同时培养造血干细胞（HSCs），并在第 7 天按如下所述检测表型 HSC 数量。若某批次 BSA 导致 CD34+ 细胞数量或频率较低（例如少于初始细胞数量的一半），则应避免使用该批次。</li>
</ol>
3. 人骨髓CD34+细胞的制备
<ol>
	<li>购买人 CD34+ 骨髓细胞，并将细胞保存在液氮中直至使用。或者，在获得机构伦理委员会批准并取得供体知情同意后，也可使用健康志愿者的骨髓细胞或新鲜脐带血细胞。</li>
	<li>在37 °C水浴中预热15 mL离心管中的10 mL复苏培养基。</li>
	<li>在37 °C水浴中于2分钟内快速解冻冻存细胞小瓶。用70%乙醇擦拭小瓶表面以去除污染物后，将细胞转移至步骤3.2中含预热培养基的15 mL离心管中。</li>
	<li>在室温下以200 × g 离心15分钟。小心吸除上清液，保持沉淀完整（残留 &#60; 50 µL 培养基）。用残留的培养基重悬细胞，并将其转移至冰上的1.5 mL离心管中。 
	注意：人源样本若直接接触黏膜（包括眼睛或受损组织），可能引起已知或未知病原体的感染；因此，操作人源细胞时建议佩戴手套和护目镜。即使购买的 CD34+ 细胞经检测对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒1型（HIV1）呈阴性，一旦发生暴露事件，仍应根据机构指南进行严密监测。处理接触过人源细胞的废弃物时，应遵循机构相关规定。</li>
</ol>
4. 分选造血干细胞
<ol>
	<li>使用荧光染料偶联抗体标记细胞。将50 µL染色缓冲液与10 µL抗CD34-FITC、2 µL抗CD38-PerCP-Cy5.5、5 µL抗CD90-PE-Cy7以及10 µL抗CD45RA-PE混合。将细胞沉淀重悬于抗体混合液中。在4 °C避光条件下孵育30分钟。</li>
	<li>加入1 mL染色缓冲液以洗涤抗体。在4 °C下以340 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于0.5 mL染色缓冲液加0.1%碘化丙啶（propidium iodide）中。通过40 µm滤膜将悬液转移至5 mL离心管中。</li>
	<li>使用FACS Aria-IIIu仪器，在PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA-细胞群中设门以获取表型上的造血干细胞（HSCs），并将细胞分选至含有500 µL培养基的1.5 mL离心管中（图3）。根据图3所示的设门策略，预计CD34+细胞中约有10%为表型上的HSCs。记录分选所得细胞数量，用于计算第5.3步中重悬细胞所需的培养基体积。 
	注：设门策略如先前所述进行16，但由于健康个体来源的CD34+CD38-细胞群中谱系标记物（lineage markers）表达水平较低，因此省略谱系标记物的染色步骤17。</li>
	<li>将分选后的细胞在4 °C下以340 × g离心5分钟，弃去上清液。小心吸除上清液，确保沉淀不被破坏。</li>
	<li>将分选后的细胞置于冰上保存，直至进行培养。 
	&#8203;注：在首次实验时应完成荧光补偿以校正光谱重叠。</li>
</ol>
5. 细胞培养
<ol>
	<li>将步骤2中制备的含有细胞因子的200 µL培养基转移至平底96孔板中。</li>
	<li>为避免培养基蒸发，向所有未使用的孔中加入100–200 µL PBS。</li>
	<li>将分选后的HSCs重悬于不含细胞因子的培养基中，浓度为60个细胞/µL。</li>
	<li>每孔接种600个HSCs（即10 µL细胞悬液）。细胞数量可调整：每孔少于300个细胞会导致技术变异增大，因此需要增加每组条件下的孔数以检测生物学差异；应避免单孔培养超过1000个细胞，以防细胞因子/营养物质缺乏或不利的细胞因子/趋化因子积累。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、含5% CO2和1% O2的加湿多气体培养箱中培养。</li>
	<li>对于超过7天的培养，建议每隔3–4天更换一半体积的培养基。小心用移液器吸出每孔中的100 µL培养基，并向每孔加入100 µL新配制的含细胞因子的培养基。培养基应预先在37 °C预热。</li>
</ol>
6. 使用流式细胞术分析标志物表型
注意：尽管细胞应在培养 7 天后进行分析，但培养时间可以调整。
<ol>
	<li>使用8通道移液器弃去170 µL培养基。</li>
	<li>用抗体混合物标记细胞。每孔加入0.5 µL抗-CD34-FITC、0.1 µL抗-CD38-PerCP-Cy5.5、0.25 µL抗-CD90-PE-Cy7、0.5 µL抗-CD45RA-PE以及9 µL染色缓冲液，混匀。向96孔板每孔加入10 µL混合液，在4 °C避光孵育30分钟。</li>
	<li>为洗涤抗体，向各孔加入100 µL染色缓冲液，并在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，使用低加速度和中等减速度。</li>
	<li>小心吸除100 µL上清液，以保持细胞位于孔底，然后将细胞重悬于200 µL染色缓冲液 + 0.1% v/v PI + 1% v/v荧光微球（例如Flow-Check Fluorospheres）中。</li>
	<li>设置流式细胞仪。以快速模式采集样本数据，开启混合样本模式，进样体积为100 µL。</li>
	<li>将数据导出为FCS格式，并使用FlowJo等软件进行分析。可通过荧光微球数量计算细胞数量。例如，若研究人员每孔加入2000个微球，实际检测到微球数量为700，则将各细胞亚群的细胞数乘以2000/700，以估算该亚群在孔中的总细胞数。 
	&#8203;注意：由于含有甲醛，荧光微球对培养细胞具有毒性，可能在分析过程中诱导细胞死亡。为避免偏差，应尽量减少连续分析的孔数（&#60;50孔）。</li>
</ol>
7. 人类造血干细胞的移植
注意：培养细胞的重constitution活性需通过移植至免疫缺陷小鼠进行验证。所有实验操作必须获得动物实验委员会或其同等机构的批准。
<ol>
	<li>作为供体，准备足够数量的8至12周龄免疫缺陷型NOD-SCID-Il2rg-null（NOG）小鼠。由于NOG小鼠极易感染，应尽可能保持繁殖笼清洁，并给予小鼠灭菌饮食和饮水。</li>
	<li>按照步骤5所述培养足够数量用于移植的造血干细胞（HSCs）。例如，当将5000个HSCs（相当于第0天数量）移植至6只受体小鼠时，可在96孔板的40个孔中（每孔200 µL培养基）或24孔板的8个孔中（每孔1 mL培养基）培养35,000–40,000个HSCs。在37 °C、5% CO2 和1% O2 的加湿多气体培养箱中培养细胞2周，每3–4天更换一半培养基。培养时间可根据需要调整。</li>
	<li>在移植前6–24小时，以2.5 Gy剂量对NOG小鼠进行照射。</li>
	<li>将培养的HSCs收集至1.5 mL离心管中。在4°C下以340 ×g 离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，并将细胞重悬于无菌冰上预冷的染色缓冲液中，调整细胞密度为每200 µL含5000个HSCs（相当于第0天数量）。将该细胞悬液转移至3 mL聚丙烯管中。为确保染色缓冲液无菌，需使用0.22 µm滤器过滤。</li>
	<li>移植前，通过吸入七氟烷或异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>为移植5000个培养的HSCs（相当于第0天数量），使用1 mL注射器和27号针头，将200 µL细胞悬液注射至步骤7.1中已照射的NOG小鼠尾静脉或眶后窦。可将新鲜分离或解冻的骨髓HSCs作为对照进行移植。每次操作之间应使用70%（v/v）乙醇对手套进行消毒。</li>
</ol>
8. 外周血中人源细胞频率的分析
<ol>
	<li>为检测人源细胞的重群体情况，分别在移植后1、2和3个月采集外周血。</li>
	<li>采集外周血前，通过吸入七氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>使用肝素化玻璃毛细管从眶后窦采集40–80 µL外周血，并将样本悬浮于含肝素（1 U/mL）的1 mL PBS中，置于1.5 mL离心管内。</li>
	<li>将血液悬液在4 °C条件下以340 × g离心3分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL PBS + 1.2% w/v葡聚糖（200 kDa）中，室温孵育45分钟。</li>
	<li>将上清液转移至另一1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以340 × g离心3分钟。</li>
	<li>为裂解红细胞，将细胞重悬于0.17 M NH4Cl溶液中，孵育5分钟。</li>
	<li>将细胞悬液在4 °C条件下以340 × g离心3分钟，弃去上清液后将细胞重悬于50 µL染色缓冲液中，其中含0.3 µL抗小鼠Fc阻断抗体，4 °C孵育5分钟。</li>
	<li>加入以下抗体进行表面标志物染色：0.3 µL小鼠CD45-PE-Cy7、0.3 µL小鼠Ter-119-PE-Cy7、0.3 µL人CD45-BV421、0.3 µL人CD13-PE、1.2 µL人CD33-PE、0.3 µL人CD19-APC、0.3 µL人CD3-APC-Cy7，4 °C避光孵育15分钟。</li>
	<li>用1 mL染色缓冲液洗涤一次，在4 °C条件下以340 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于200 µL染色缓冲液 + 0.1% v/v碘化丙啶（PI）中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至96孔平底板中，使用流式细胞仪以快速模式采集数据，开启混样模式，上样体积为100 µL。</li>
	<li>将数据导出为FCS格式，用于FlowJo等软件分析。</li>
	<li>设置流式细胞仪参数，以快速模式采集样本数据，开启混样模式，上样体积为100 µL。</li>
	<li>将数据导出为FCS格式，用于FlowJo等软件分析。</li>
</ol>

<ol><li>Scala, S., Aiuti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+human+hematopoietic+stem+cells%3A+novel+concepts+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions.</a> Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).</li>
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<li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
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<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
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<li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).</li>
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<li>Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+SCID-repopulating+cells+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).</li>
<li>Kikushige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Flt3+is+expressed+at+the+hematopoietic+stem+cell+and+the+granulocyte%2Fmacrophage+progenitor+stages+to+maintain+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+All-Recombinant+Protein-Based+Culture+System+Specifically+Identifies+Hematopoietic+Stem+Cell+Maintenance+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

作者声明本研究不存在任何利益冲突。

最近，已有若干种在最小化分化的情况下扩增造血干细胞（HSCs）的方法被报道18,19,20,21。尽管这些方法效果良好，但这些方法中造血干细胞在高水平细胞因子存在下被迫进入细胞周期，这与体内造血干细胞几乎处于静止状态的生理情况不同。本方案通过模拟骨髓微环境，有助于将造血干细胞维持在静止状态，从而更接近其在体内的自然状态。
在低细胞因子、富含脂质且低氧的条件下培养人造血干细胞（HSCs）时，HSCs 增殖活性极低，同时维持其表面标志物表型。本方案的关键步骤是制备含有高浓度脂肪酸和胆固醇、低浓度细胞因子的培养基，并在低氧条件下进行培养（步骤 1、步骤 2 和步骤 4）。若缺乏胆固醇和/或脂肪酸，在低细胞因子浓度下 HSCs 的维持率会下降22。在低氧条件下培养细胞也至关重要，此前已有相关报道23。
培养条件与小鼠造血干细胞（HSCs）的培养条件相似，但细胞因子浓度有所不同。小鼠造血干细胞在无TPO的条件下仍可存活，而人类造血干细胞则至少需要2 ng/mL的TPO和3 ng/mL的SCF22。由于TPO的浓度远高于人血清中的水平（约100 pg/mL），本实验方案所用条件可能缺少支持人类造血干细胞存活的某些特定因子。FLT3在人类造血干细胞上表达24，加入其配体FLT3LG可略微降低维持造血干细胞所需的TPO浓度22。
与小鼠造血干细胞（HSCs）相比，人类造血干细胞需要更高浓度的胆固醇，这可能是由于其无法诱导胆固醇合成酶的表达，并且在高浓度（&#62;400 µg/mL）脂肪酸条件下易发生脂毒性22。尽管目前仅测试了棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸的组合——这些脂肪酸在人血清中含量丰富——但仍需评估其他脂质组合，以降低脂毒性并提高功能性造血干细胞的维持效率。
尽管已证实培养两周后的人类造血干细胞（HSCs）在免疫缺陷小鼠中具有重建造血活性22，但该培养体系并不能完全模拟体内HSCs的微环境功能。据报道，培养后CD45RA的表达水平升高，且其重建造血能力低于 freshly sorted HSCs22。然而，培养基中添加的营养物质（如葡萄糖、氨基酸、丙酮酸和胰岛素）浓度常高于生理水平，这些条件仍有优化空间。此外，BSA中的污染物也可能影响HSCs的维持18,25。同时，部分培养细胞会发生细胞死亡，而另一些则进行细胞分裂；因此，总细胞数量的维持并不能反映单个细胞的静息状态。
尽管存在这些局限性，本研究建立的实验方案中所描述的培养条件将有助于推进造血干细胞（HSCs）的研究与工程化，特别是在接近生理条件下的应用。能够维持HSCs处于最低限度分化和低增殖活性状态的培养条件，适用于特异性作用于HSCs的生物学和化学化合物的测试，可用于通过慢病毒转导或基因组编辑技术对HSCs进行遗传操作而不会丧失其干性，并有助于阐明白血病相关基因诱导转化的初始步骤。

造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）协同构成一个持续补充分化细胞的储备库，以维持人类终生的造血功能1。细胞周期静息是HSCs的一个显著特征，使其区别于MPPs2。传统上认为，HSCs位于造血系统层级的顶端，能够产生所有类型的分化血细胞。这一层级模型主要基于移植实验推断而来3。然而，最近的研究表明，HSCs在体内的动态行为与移植实验中的表现存在差异4,5,6,7。利用多种条形码系统进行的谱系追踪实验发现，表型上的小鼠HSCs并非唯一参与稳态造血的细胞类型，而MPPs——尽管在移植条件下仅表现出有限的自我更新能力——却持续地提供成熟的血细胞4,5,8。相反，HSCs对成熟细胞的贡献在骨髓损伤后增强4。这可能归因于骨髓消融（包括骨髓移植）后微环境发生的剧烈变化。尽管将小鼠细胞的谱系追踪方法应用于人类细胞存在困难，但结合单细胞克隆分离与全基因组测序的系统发育分析揭示了人类造血系统具有类似特性，即HSCs和MPPs均参与日常成熟血细胞的生成7。因此，尽管移植实验对于评估小鼠或人类HSC活性至关重要，但仍需其他实验模型来理解HSCs在生理条件下的行为。
为了理解造血干细胞（HSCs）的临床应用及其特性，研究人员已对HSCs的培养方法进行了深入研究。人类HSCs可在体外通过多种手段进行扩增，包括联合使用细胞因子、重建细胞外基质、去除自我更新的拮抗因子、与间充质细胞或内皮细胞共培养、添加白蛋白或其替代物、转导自我更新相关的转录因子，以及添加小分子化合物9,10。其中一些方法，例如添加小分子化合物SR111和UM17112，已在临床试验中得到验证，并取得了令人鼓舞的结果9。鉴于HSCs在体内具有静息特性&#160;，在体外培养过程中尽可能减少细胞周期活动，对于真实模拟HSCs的生物学行为至关重要。静息状态与增殖状态的HSCs在进入细胞周期的能力13、代谢状态14以及对多种应激的耐受性15方面表现出显著差异。目前，用于在体外维持人类HSCs静息状态的方法仍十分有限。
通过模拟骨髓的微环境（低氧且富含脂质）并优化细胞因子浓度，可在体外培养条件下维持人造血干细胞（HSCs）的未分化和静息状态。在体外重现HSCs的静息特性将有助于深入理解HSCs的稳态特征，并实现对HSCs的实验性操控。

<table><tbody><tr><td>人骨髓 CD34+ 祖细胞</td><td>Lonza</td><td>2M-101C</td><td></td></tr><tr><td>NOD/Shi-scid,IL-2R&amp;gamma;KO Jic</td><td>In-Vivo Science Inc.</td><td>https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD34-FITC（克隆：581）</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 560942; RRID: AB_10562559</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD38-PerCP-Cy5.5&amp;nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 551400; RRID: AB_394184</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45RA-PE</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 555489; RRID: AB_395880</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD90-PE-Cy7（克隆：5E10）</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561558; RRID: AB_10714644</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD13-PE（克隆：WM15）</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 301703; RRID: AB_314179</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD33-PE（克隆：WM53）</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561816; RRID: AB_10896480</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD19-APC（克隆：SJ259）</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 363005; RRID: AB_2564127</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3-APC-Cy7（克隆：SK7）</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561800; RRID: AB_10895381</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45-BV421（克隆：HI30）</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 563880; RRID:AB_2744402</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45-PE-Cy7（克隆：30-F11）</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 103114; RRID: AB_312979</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ter-119-PE-Cy7（克隆：TER-119）</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 557853; RRID: AB_396898</td><td></td></tr><tr><td>Fc阻断剂（抗小鼠 CD16/32）（克隆：2.4-G2）</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 553142; RRID: AB_394657</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Nacalai Tesque</td><td>Cat# 14249-24</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11320-033</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 51500056</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>明治制果</td><td>PGLD755</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>明治制果</td><td>SSDN1013</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>棕榈酸钠</td><td>东京化成工业株式会社</td><td>Cat# P0007</td><td></td></tr><tr><td>油酸钠</td><td>东京化成工业株式会社</td><td>Cat# O0057</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>东京化成工业株式会社</td><td>Cat# C0318</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 017-2995</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 191-01305</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2Na</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 345-01865</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>持田制药株式会社&amp;nbsp;</td><td>Cat# 224122557</td><td></td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 193-17791</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Nacalai Tesque</td><td>Cat#&amp;nbsp; 10927-54</td><td></td></tr><tr><td>重组人 SCF</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TPO</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-18</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Flt3 配体</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Life Technologies</td><td>Cat# P3566</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check 荧光微球</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# 7547053</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 版本 10</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria3u</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VELVO-CLEAR VS-25（超声波破碎仪）</td><td>VELVO-CLEAR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>氮气钢瓶</td><td>柯池产业株式会社</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>气体调节器</td><td>Astec</td><td>Cat# IM-055</td><td></td></tr><tr><td>多气体培养箱</td><td>Astec</td><td>Cat# SMA-30DR</td><td></td></tr><tr><td>玻璃管，16 mL</td><td>丸荣株式会社</td><td>N-16</td><td></td></tr><tr><td>玻璃管，50 mL</td><td>丸荣株式会社</td><td>NX-50</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 注射式滤器，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m，聚醚砜，33&amp;nbsp;mm，伽马射线灭菌</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

一种维持静息态人类造血干细胞的培养方法

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

人类造血干细胞（HSCs）与其他哺乳动物的造血干细胞类似，可在骨髓中维持终身的造血功能。与更分化的祖细胞不同，HSCs在体内通常处于静息状态，但在化疗或放疗后可迅速进入细胞周期，以修复骨髓损伤，或在体外培养中被激活。通过模拟骨髓微环境，即在富含脂肪酸、胆固醇、低浓度细胞因子以及低氧条件下，人类HSCs可在体外维持其静息状态。本文介绍了一种在体外维持功能性HSCs处于静息状态的详细实验方案。该方法将有助于在生理条件下研究人类HSCs的行为。

纯化的造血干细胞培养7天后，多达80%的细胞表现出CD34+CD38-的标志物表型（图4A）。总细胞数量取决于细胞因子浓度（图4B）。较高浓度的SCF和TPO可诱导细胞进入细胞周期，并促进增殖和分化（图4B）。具有CD34+CD38-CD90+CD45RA-标志物表型的表型造血干细胞数量随SCF或TPO浓度的增加而呈比例上升（图4B），但在总细胞中的频率则下降（图4C）。1.5 ng/mL SCF与4 ng/mL TPO组合，以及3 ng/mL SCF与2 ng/mL TPO组合的总细胞数量相当，提示在细胞周期最低程度激活条件下，造血干细胞处于静息状态。鉴于个体差异，建议对每位骨髓供体进行细胞因子滴定。 
在移植培养的成人骨髓造血干细胞（HSCs）3个月后，可通过检测外周血中人CD45+小鼠CD45-Ter119-细胞的频率来评估重建情况。在移植了新鲜解冻HSCs或培养HSCs的NOG小鼠中，均观察到三种谱系的重建，包括CD19+B细胞、CD13/CD33+髓系细胞和CD3+T细胞（图5）。
<img alt="造血细胞培养流程图：培养基配制、细胞准备、分选、培养、流式分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1．实验流程概览。 本图以图示方式总结了实验流程，包括人造血干细胞（HSCs）的分选、培养与分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="实验室实验步骤中的气体钢瓶压力控制、过滤装置和玻璃器皿细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2.从脂质溶液中蒸发甲醇的操作步骤。 A) 带有气体调压阀的氮气钢瓶。B) 将氮气通入溶解于甲醇中的脂质溶液的操作过程。C) 脂质附着在玻璃管底部的情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用 CD34、CD38、CD45RA 标记物进行细胞分化分析的流式细胞术图谱，FACS 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3. 造血干细胞（HSC）分选的设门策略。图中显示设门后的 CD34+CD38-CD90+CD45RA- 细胞。约 10% 的 CD34+ 细胞为表型上的造血干细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；CD34、CD38标志物；图表；造血干细胞频率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4。培养7天后的代表性细胞数量。 A) 在SCF（3 ng/mL）和TPO（2 ng/mL）条件下培养造血干细胞（HSCs）后的代表性荧光激活细胞分选图。第1组分富集活细胞，第2组分富集死细胞，第3组分富集碎片。粉红色数字表示门控组分的频率（%）。B) 在指定细胞因子条件下培养600个HSCs后，总HSCs、CD34+CD38-细胞以及CD34+CD38-CD90+CD45RA-细胞的数量。红色虚线表示初始接种细胞数量。S：SCF，T：TPO。均值±标准差，n = 4。S和T后的数字表示各细胞因子的浓度（ng/mL）。C) 在指定细胞因子条件下CD34+CD38-和CD34+CD38-CD90+CD45RA-细胞的频率。S：SCF，T：TPO。均值±标准差，n = 4。由于SCF（1 ng/mL）和TPO（0 ng/mL）培养组的误差值过高（分别为37.7和47.9），故未显示误差线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析图；细胞群设门；mCD45、hCD19标记物；新鲜样本与培养后样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5．移植后3个月供体小鼠的代表性FACS图谱。 将总共5000个新鲜解冻的（上图）和体外培养2周的造血干细胞（3 ng/mL SCF和3 ng/mL TPO；下图）移植至NOG小鼠体内。hCD19标记人B细胞，hCD13和hCD33标记人髓系细胞，hCD3标记人T细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig05large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案通过使用丰富的脂肪酸、胆固醇、较低浓度的细胞因子以及低氧条件模拟骨髓微环境，实现在体外维持静息态人造血干细胞。

人类造血干细胞（HSCs）与其他哺乳动物的造血干细胞类似，可在骨髓中维持终生的造血功能。HSCs 在体内保持静息状态，……

细胞周期静息是造血干细胞的关键特征。本方案有助于在接近生理条件的体外环境中理解静息态人源造血干细胞的行为。利用该方案，研究人员可以以可扩展的方式检测各种化合物、营养物质或蛋白质对造血干细胞细胞周期状态及分化的影响，而无需使用动物模型。抗癌药物对静息期造血干细胞（HSCs）和增殖期祖细胞的存活具有不同的影响。本方案使得筛选出能够保护静息期造血干细胞或选择性损伤静息期白血病干细胞的药物成为可能。演示该实验操作的是来自高桥实验室的高级研究员小林浩。首先，将16毫克/毫升棕榈酸钠、30毫克/毫升油酸钠和4毫克/毫升胆固醇溶解于玻璃试管中的甲醇中。将脂质溶液储存于-30摄氏度，并在使用前解冻。在一支新的玻璃试管中混合上述脂质溶液，以获得终浓度为100微克/毫升棕榈酸、100微克/毫升油酸和20微克/毫升胆固醇的混合液。通过向脂质溶液中通入氮气蒸发甲醇。将玻璃试管置于37摄氏度水浴中加热，彻底蒸发残留的甲醇。配制含HEPES和谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基。加入青霉素和硫酸链霉素，使其终浓度分别为 50 单位和 50 微克/毫升。该培养基可在 4°C 下保存至少两个月。向含 HEPES 和谷氨酰胺的 DMEM/F-12 培养基中加入 4% BSA，然后用氢氧化钠溶液调节培养基 pH 至 7.6。将培养基加入含有脂质的玻璃管中。通过超声处理使脂质完全溶解。如果超声处理后培养基仍呈浑浊，应延长超声时间。当 BSA 和脂质溶解后，样品应保存在负 80 摄氏度，并在两个月内使用。向 DMEM/F-12 中加入 0.001X 的胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺混合物，然后使用 0.22 微米滤器过滤混合培养基。使用前，向培养基中加入人干细胞因子（SCF）和人血小板生成素（TPO），使其终浓度均为每毫升 3 纳克。将200微升先前配制的含细胞因子的培养基转移至平底96孔板中。为避免培养基蒸发，向所有未使用孔中加入100至200微升PBS。将分选后的造血干细胞（HSCs）重悬于不含细胞因子的培养基中，浓度为每微升60个细胞。将600个细胞分装至每个孔中。每孔细胞数少于300会导致较大的技术变异，而单孔培养超过1,000个细胞则应避免，以防营养缺乏或不利的细胞因子和趋化因子积累。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳和1%氧气的加湿多气体培养箱中培养。纯化的造血干细胞培养七天后，多达80%的细胞呈现CD34阳性且CD38阴性的表型。总细胞数量取决于细胞因子浓度。较高浓度的干细胞因子（SCF）和血小板生成素（TPO）可促进细胞进入细胞周期，并诱导增殖和分化。具有CD34阳性、CD38阴性、CD90阳性及CD45RA阴性表型特征的表型造血干细胞（HSC）数量随干细胞因子（SCF）或血小板生成素（TPO）浓度的增加而呈比例上升，但在总细胞中的频率则下降。在体外培养的成人骨髓造血干细胞移植后三个月，可通过检测人源CD45阳性、小鼠CD45阴性且Ter119阴性细胞在外周血中的频率来评估其重建能力。在移植了新鲜解冻或体外培养的造血干细胞的NOG小鼠中，均重建了三种谱系：CD19阳性的B细胞、CD13阴性且CD33阳性的髓系细胞，以及CD3阳性的T细胞。培养后，可对造血干细胞（HSCs）进行基因表达谱分析，例如实时PCR和RNA测序。也可通过移植到免疫缺陷小鼠体内进行功能验证。研究人员可通过调整细胞因子浓度，在明确定义的条件下直接比较处于增殖和静息状态的HSCs。这将有助于理解静息态造血干细胞特异性的自我更新程序、应激抵抗机制和代谢特性，而这些特性在体内环境中难以进行检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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一种维持静息态人类造血干细胞的培养方法

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