利用Claisen-Schmidt缩合方法合成pH依赖性的吡唑、咪唑和异吲哚酮二吡咯酮类荧光染料

Claisen-Schmidt 缩合反应是一种古老的反应，最早由 Claisen 和 Schmidt 于 1881 年同时报道。该反应涉及在碱性条件下，由酮或醛（图中以蓝色表示）生成的烯醇负离子对芳香醛（图中以红色表示）的亲核加成。最初，烯醇负离子的加成会生成一种醇中间体，如方括号内所示。

然而，随后的脱水反应最终会生成一个烯酮。由于芳醛不含α-氢，因此无法形成烯醇负离子。因此，通常可以使用弱碱（如氢氧根）来生成烯醇负离子。

多年来，克莱森-施密特缩合反应已被用于合成多种化合物。然而，该反应被广泛用于连接查尔酮和黄烷酮中的芳香环体系，如图中红色和蓝色部分所示。其中蓝色部分表示来自烯醇负离子的部分，红色部分则代表芳香环部分。

查尔酮和黄烷酮是一类具有多种生物活性分子的核心结构，其活性类型（如抗菌、抗真菌、抗炎和抗肿瘤作用）取决于取代基的模式。通过克莱森-施密特缩合反应生成的另一大类分子是次甲基桥连化合物，本研究中提供了相关实例。我们实验室关注胆红素色素中的荧光组分，胆红素是血红素在体内自然降解的产物。

胆红素及其许多组分的合成围绕着克莱森-施密特型缩合反应展开，该反应可通过蓝色烯醇负离子与红色芳香醛组分的结构直观展示。通常，胆红素的直接组分（如二吡咯酮）不具有荧光性。然而，若通过亚甲基或羰基将两个氮原子连接起来，则所得分子会表现出强荧光性，例如黄荧素（xanthoglows）的情况。

通常，二吡咯酮吸收紫外光或蓝光，从而引发从 Z 式到 E 式的异构化过程。与无桥连的二吡咯酮类似，桥连二吡咯酮中的氮原子也能吸收紫外光或蓝光，但不同之处在于它们通过荧光在激发态下发生弛豫。我们最近发现了一系列二吡咯酮衍生物，它们实际上能够在没有共价桥连两个氮基团的情况下产生荧光。

相反，氢键似乎阻碍了从Z式到E式的异构化过程，从而导致了一种荧光模式的产生。此外，还意外发现这些分子在碱性介质中可发生去质子化，使其在去质子化状态下出现吸收和发射光谱的红移现象。因此，这些分子可能作为比率型pH探针具有应用价值。

使用荧光二吡咯酮衍生物，对传统的克莱森-施密特缩合反应进行了轻微改进。本方案与传统克莱森-施密特缩合反应的不同之处在于，采用由吡咯啉酮或异吲哚啉酮衍生的烯醇化物作为亲核试剂。该烯醇化物与吡唑或咪唑醛发生加成反应，从而生成一系列二吡咯酮类似物的小型化合物库。

本视频展示了构建该文库所采用的实验步骤。然而，类似的操作流程也可用于进行传统的克莱森-施密特反应。尽管克莱森-施密特反应过去已被广泛使用，至今仍是一种常用的合成反应，但据我们所知，本视频是首次对该方法进行的视频记录。

为通过羟醛缩合反应合成荧光二吡咯酮类似物，需称取等摩尔量的选定亲核试剂和亲电试剂。然后将其加入含有磁力搅拌子的25毫升圆底烧瓶中。使用量筒量取5毫升乙醇。

然后将乙醇加入圆底烧瓶中。使用量筒量取2.4毫升预先配制的10摩尔/升氢氧化钾溶液，再将氢氧化钾加入烧瓶中。

为使烧瓶处于回流状态，需在反应冷凝管的磨口接头处涂抹适量真空润滑脂，以防止磨口接头卡住。将冷凝管连接至冷水供应装置，然后将已涂润滑脂的冷凝管接头与圆底烧瓶连接。随后将烧瓶置于油浴中或置于铝块加热板上，该加热装置可通过热电偶与加热搅拌器联动，以维持恒定温度。

加热至回流温度，同时持续搅拌反应。应通过薄层色谱在反应进行1小时、3小时、6小时、12小时和24小时时监测反应混合物，以评估反应速率并确认起始原料是否完全消耗。待反应瓶冷却至室温后，使用旋转蒸发仪除去乙醇溶剂。

将烧瓶置于冰浴中，使其在五分钟内逐渐平衡至冰浴温度。向烧瓶中一次性加入1.7毫升乙酸，以中和残留的氢氧化钾。若中和后出现结晶现象，则按真空过滤纯化步骤进行操作。

若未观察到晶体形成，则按照快速柱层析纯化步骤进行操作。将一张圆形滤纸置于漏斗顶部，并用去离子水轻轻润湿滤纸，使其贴附于漏斗表面。为准备晶体的真空过滤，使用匹配的橡胶接头将赫希（Hirsch）或布氏（Buchner）漏斗连接至带侧臂的锥形瓶上。

为避免滤纸堵塞而影响过滤效果，我们使用了比常规类似规模过滤过程更大的赫氏（Hirsch）或布氏（Buchner）漏斗。将圆底烧瓶中的内容物倒入滤纸上，使混合物自然过滤。在过滤过程中，用10毫升冰冻的去离子水冲洗晶体。

过滤后，将晶体转移至一个25毫升的圆底烧瓶中。在高功率真空管路玻璃接头上均匀涂抹一层薄薄的真空润滑脂，然后将该接头连接到圆底烧瓶上。使用Keck夹固定玻璃接头。

为了利用高功率真空干燥晶体中残留的溶剂，需用干冰和丙酮的混合物充分冷却玻璃真空阱。将高功率真空管路连接至连接在圆底烧瓶上的玻璃接头。开启高功率真空泵，使晶体干燥至少一小时。

将晶体在真空下充分干燥后，关闭真空泵并释放真空密封，取下圆底烧瓶。称量干燥后的晶体以计算反应的百分产率。为进行快速柱层析纯化，将合成步骤中未结晶的酸处理混合物加入分液漏斗中。

使用量筒量取10毫升二氯甲烷，并用其稀释分液漏斗中经酸处理的混合物。关闭分液漏斗，轻轻振荡，同时确保频繁排气。随后，分液漏斗中应出现两个明显的分层。

使用额外的5 mL二氯甲烷萃取水层，重复此步骤两次。合并所有有机相，并加入足量的无水硫酸钠以干燥有机相。

将干燥的有机相转移至圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪除去二氯甲烷。用额外的5毫升二氯甲烷稀释残留物。使用约75克硅胶装柱，以含10%甲醇的二氯甲烷作为洗脱剂，对样品进行快速柱色谱分离。

使用旋转蒸发仪将收集到的馏分中的洗脱液蒸发除去。按照之前真空过滤纯化步骤中所述，准备好高功率真空泵和玻璃溶剂捕集阱，并将收集到的固体在高真空下干燥至少一小时。待晶体在真空条件下充分干燥后，称量干燥晶体的质量，以计算反应的百分产率。

为了确认文库中每种二吡咯酮类似物的结构，采用了多种光谱方法联用，包括核磁共振波谱、红外光谱和高分辨质谱。紫外-可见吸收光谱和荧光光谱用于荧光二吡咯酮类似物的光物理性质表征。通过Claisen-Schmidt缩合反应，我们合成了一个包含10种化合物的小型化合物库，其中包括一种无法参与分子间氢键作用的对照化合物。

二吡咯酮类似物的产率从大约40%到接近定量不等，每种分子下方均列出了相应的产率。在质子化和去质子化形式下均具有最高量子产率的化合物是由2-甲酰基咪唑衍生而来的，以粉红色框标出。作为对照的化合物不产生荧光，以青色框标出。

在标准的365纳米长波长灯下，二吡咯酮衍生物表现出可观察到的荧光。通过观察小瓶的颜色，可以直观地看到去质子化导致的荧光红移现象，其颜色从蓝色逐渐转变为青色。

有关二吡咯酮衍生物的光物理及其他物理性质的更多定量数据，我们引导读者参阅论文书面部分的表二。总体而言，克莱森-施密特缩合反应可制备一系列亚甲基连接的双环芳香族化合物。然而，该方法也存在一些局限性。

该反应的成功缩合依赖于同时使用可烯醇化的亲核试剂和不可烯醇化的醛类亲电试剂（例如芳香醛）。若未能满足这一基本要求，则尝试进行该反应很可能无法实现环系之间的连接，和/或产生竞争性副产物。另一个需考虑的因素是，反应需在碱性条件下生成烯醇负离子亲核试剂，这可能与易与氢氧根发生反应的官能团产生不相容性。

在这些情况下，可以使用氮碱或碳酸盐替代氢氧根，已有使用 DBU、三乙胺、哌啶、胡宁碱（Hunig's base）和碳酸钠实现的先例。我们选择使用氢氧化钾仅仅是由于其易得性和相对较低的成本。尽管存在这些局限性，本方案中所述的方法仍可通过一种操作简单且成本低廉的单步反应，为多种体系提供偶联芳香环的有效途径。

在我们已合成的二吡咯酮类似物中，克莱森-施密特缩合反应为迄今所报道的pH依赖性荧光团提供了最易实现的合成途径之一。然而，未来二吡咯酮类似物的设计将采用文中所述方法，以开发出具有更强分子间氢键能力及更低pKa值的荧光化合物。预计这些性能增强的pH依赖性探针将具有更高的量子产率，同时能够更广泛地可视化细胞内多种生理事件中的pH变化。