体外延时活细胞成像技术用于探究细胞向耳蜗柯蒂氏器的迁移

现有的体外研究间充质干细胞（MSCs）迁移的方法包括Transwell或伤口愈合实验。本文所述方法可用于实时追踪MSCs向组织块的迁移过程。在组织块培养方面，该方法相较于其他方法的优势在于能够缩短实验时间、降低成本，并简化实验步骤。

该技术可用于实时观察干细胞向靶部位的归巢过程，从而建立具有优化归巢效率的模型。对于缺乏经验的研究人员而言，移除盖膜具有较大难度。根据发育阶段的不同，掌握移除盖膜的合适时机对该实验方案的成功至关重要。

本实验操作将由我实验室的研究教授朴正恩（Dr. Jeong-Eun Park）和李秀恩（Dr. Su Hoon Lee）进行演示。首先，开启超净台的紫外灯照射约30分钟，对层流组织培养罩进行灭菌处理。使用前，用70%乙醇喷洒所有表面，并静置使其自然干燥。

将解剖器械置于70%乙醇中浸泡10分钟，然后干燥后再使用。处死一只3至4日龄的小鼠后，将其头部浸泡于70%乙醇中，并置于超净台内的体视显微镜下。迅速将组织浸入组织解离液中，以去除乙醇。

用手术刀沿颅骨中线切开，然后向前下方牵拉皮肤暴露颅骨，并剪开耳部的外耳道。沿眼线从前向后切开颅骨，随后打开颅骨，用钝头镊子取出前脑、小脑和脑干。使用显微镊将耳蜗从颞骨分离，并转移至含有组织解离液的培养皿中。

仔细解剖去除全部耳蜗骨囊，仅保留耳蜗内部的软组织。用一把镊子夹住耳蜗的蜗轴，另一把镊子夹住耳蜗管，然后缓慢分离这两种组织。轻轻剥离去除血管纹和盖膜。

将灭菌的塑料盖玻片放入新的组织解离液中，然后将耳蜗柯蒂氏器放置在盖玻片上，确保基底膜朝下。用镊子将前庭膜和残留的蜗轴组织压在盖玻片上，以固定组织。将带有嵌入组织的盖玻片转移至35毫米共聚焦培养皿的中央。

将玻璃克隆环置于培养皿上，耳蜗外植体位于培养皿中央，向环内加入 100 µL 外植体培养基。在玻璃环外的 2 mL 培养基中接种 5,000 个骨髓来源的 GFP 标记间充质干细胞（MSCs），然后将培养皿放入培养箱中。按照文本稿件中所述条件培养细胞后，吸除环内和环外的全部培养基，并从共聚焦培养皿中移除玻璃环。

向培养皿中加入 2 毫升新鲜培养基。将其置于加湿的培养箱中，直至准备进行分析。使用带有载台式培养箱的共聚焦显微镜系统。

打开共聚焦显微镜、荧光光源和计算机。将载物台顶部培养箱的条件设置为37摄氏度和5%二氧化碳 atmosphere。将样品皿放置在皿固定容器上，用皿固定盖盖住，并用顶部加热盖关闭腔室。

调整放大倍数和焦距，以在视野中定位耳蜗柯蒂氏器和间充质干细胞。打开图像处理软件。在定位选项下，选择20倍平场复消色差物镜或数值孔径0.8，并设置0.5倍裁剪区域。

在采集设置中，点击智能设置并选择EGFP。在采集下的通道选项卡中，将激光功率设为0.2%，针孔设为44微米，主增益设为750伏，数字增益设为1.0。在成像设置中点击ESID，并将ESID增益设为4，数字增益设为7.5。

点击图块并下注以生成 210 个图块。打开对焦策略并选择对焦模式。在时间序列下，将持续时间设置为 24 小时，间隔设置为 10 分钟。

在采集设置中，将帧尺寸设为 512 × 512 像素，扫描速度设为 8，扫描方向设为双向，平均次数设为 4X，像素位数设为 16 位。点击“开始实验”以启动实验。采用玻璃圆柱体作为间充质干细胞（MSCs）与柯蒂氏器之间的屏障，通过伤口愈合方法追踪 MSCs 的二维迁移路径。

当耳蜗柯蒂氏器进行培养时，成纤维细胞从最外层的外毛细胞处迅速向外生长。大多数表达GFP标记的间充质干细胞被快速增殖的成纤维细胞挤出。然而，仍有部分细胞能够穿透成纤维细胞层，并成功迁移至柯蒂氏器。

培养72小时后的结果显示，间充质干细胞（MSCs）迁移至柯蒂氏器，并主要定位于蜗轴以及蜗轴分离出的耳蜗神经纤维区域。MSCs的形态改变为类似神经纤维的放射状，细胞沿前庭阶边缘呈线性排列，而非定位于毛细胞区域。

间充质干细胞（MSCs）能够穿过各种细胞层和物理屏障，迁移并生长于神经纤维聚集区域。当使用卡那霉素处理16小时以诱导毛细胞损伤，并在去除卡那霉素后继续培养72小时时，MSCs不仅定位于蜗轴，还定位于外毛细胞。固定组织是本方案中的关键步骤，因为柯蒂器官在此过程中需要被牢固附着。

它不容易脱落。这是成功进行外植体培养的一个微小但实用的技巧。该方法可加以改进，用于研究间充质干细胞分泌的外泌体的功效。