Name: 功能化螺环杂环合成和细胞毒性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 学习固相合成螺环杂环化合物的方法，并使用MTT法测定其对COS7细胞的细胞毒性。该方案为药物开发和癌症研究提供了可靠的评估手段。

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本研究由美国阿苏萨太平洋大学研究与资助办公室授予 K.S.H. 的教员研究理事会资助项目提供经费支持。A.N.G. 和 J.F.M. 获得了本科生学术研究体验（SURE）奖学金。S.K.M. 和 B.M.R. 获得了美国阿苏萨太平洋大学科学研究中心 STEM 研究奖学金资助。我们感谢 Matthew Berezuk 博士和 Philip Cox 博士在生物测定实验方面提供的指导。

注意：本实验方案中使用的多种化学品和生物试剂具有毒性和致癌性。使用前请查阅相关的材料安全数据表（MSDS）。实验开始前，应穿戴适当的个人防护装备（经职业安全与健康管理局认证的安全护目镜、合适的手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。此外，在进行合成操作及处理有毒化学品和试剂时，应采取适当的安全措施（如在通风橱中操作）。
1. 螺环杂环化合物 6 和 7 的固相合成
注意：合成方法基于先前发表的研究11,12。更新后的方案表明，三环杂环的四丁基氟化铵催化的开环反应并非必需，因此省略该步骤可缩短合成路线。
<ol>
	<li>进行糠胺对REM连接剂的迈克尔加成反应（操作时间：25分钟准备 + 24小时反应时间）。
	<ol>
		<li>向25 mL固相反应容器中加入1 g（1当量[eq.]）REM树脂、20 mL（20当量）二甲基甲酰胺（DMF）和2.4 mL糠胺。反应启动后，在室温下振荡反应容器24小时。 
		注意：确保充分混合，防止树脂沉降于容器底部。</li>
		<li>反应完成后，用DMF洗涤树脂1次。随后交替使用二氯甲烷（DCM）和甲醇洗涤4次。洗涤后在反应容器中将树脂彻底干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行串联迈克尔加成/1,3-偶极环加成反应（操作时间：25分钟准备 + 48小时反应时间）。
	<ol>
		<li>向干燥的树脂中加入1.48 mL（5当量）三乙胺（TEA）、0.637 g（2当量）硝基烯烃以及10 mL干燥甲苯至反应容器中。</li>
		<li>然后在通风良好的通风橱中向反应容器中加入1.085 mL（4当量）三甲基氯硅烷（TMSCl）。 
		注意：该反应会产生HCl气体，因此在通风橱中释放气体前不得密封反应容器。</li>
		<li>将反应容器密封，于室温下振荡反应48小时。 
		注意：确保树脂与试剂充分混合。</li>
		<li>使用5 mL甲醇淬灭反应。</li>
		<li>排空容器以除去溶液，随后交替使用DCM和甲醇洗涤4次。洗涤后在反应容器中将树脂彻底干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对树脂负载的杂环进行N-烷基化以形成季铵盐（操作时间：10分钟准备 + 24小时反应时间）。
	<ol>
		<li>向反应容器中的干燥树脂中加入5 mL DMF和10当量的卤代烷，于室温下振荡反应24小时。 
		注意：确保试剂与树脂充分混合。</li>
		<li>反应完成后，用DMF洗涤树脂1次。随后交替使用DCM和甲醇洗涤4次。洗涤后在反应容器中干燥树脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过季铵盐的β-消除反应从聚合物载体上解离产物（操作时间：15分钟准备 + 24小时反应时间）。
	<ol>
		<li>向反应容器中的干燥树脂中加入3 mL DCM和1.49 mL（5当量）TEA，以将杂环从聚合物载体上裂解下来。</li>
		<li>振荡反应混合物24小时，确保树脂与溶液充分混合。交替使用DCM和甲醇洗涤4次。收集所有洗涤液的洗脱液，并通过旋转蒸发浓缩。</li>
		<li>用甲醇研磨以纯化螺环肟产物。洗涤后在反应容器中将树脂彻底干燥，以便在后续实验中重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用 MTT 进行细胞毒性检测14
<ol>
	<li>使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，水中含0.9% NaCl）作为稀释剂，配制20 mL浓度为5 mg/mL的MTT溶液。过滤后于-20 °C保存。然后，将步骤2.1中的MTT溶液用无血清细胞培养基（DMEM）进行1:1稀释。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，分别配制100 mM、10 mM、1 mM、100 µM、10 µM、1 µM、0.1 µM和0.01 µM浓度的待测化合物DMSO（二甲基亚砜）储备液，每种1 mL。于-20 °C保存。在1.5 mL离心管中，将上述储备液用无血清培养基按1:1000稀释，配制每种剂量的待测化合物工作液，每剂量200 µL。</li>
	<li>在组织培养超净台中，使用多通道移液器将COS-7细胞（非洲绿猴肾细胞，Cercopithecus aethiops 肾细胞）以4 × 103 个细胞/200 µL的浓度接种于平底、经组织培养处理的96孔板中，培养基为完全培养基[含10%胎牛血清（FBS）的DMEM]。选择COS-7细胞的原因是：（1）该细胞系常用于细胞毒性检测；（2）本机构已有该细胞资源。</li>
	<li>将COS-7细胞置于含5% CO2的环境中，于37 °C孵育24小时。</li>
	<li>使用连接真空泵的玻璃巴斯德吸管吸除各孔中的上清液。使用步骤2.2中配制的工作液对细胞进行加药处理，每组剂量设三个复孔（见表1）。按照步骤2.4所述条件孵育细胞。</li>
	<li>吸除各孔中的上清液。每孔加入200 µL MTT溶液。在含5% CO2的环境中，于37 °C孵育4小时。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动紫色的甲臜结晶。每孔加入200 µL DMSO以溶解紫色甲臜结晶。室温下孵育15分钟。</li>
	<li>使用96孔板读数仪测定各孔在590 nm14或600 nm处的吸光度。以不含细胞的孔作为空白对照，计算平均背景吸光度值。从每个处理孔的吸光度值中减去平均背景值。将数据归一化为零剂量组平均值的百分比（取三个零剂量孔的平均值）。作图时，y轴为线性坐标（相对细胞活力百分比），x轴为对数坐标（浓度）。每组数据绘制为独立曲线（例如，三复孔数据应绘制三条曲线）。</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

螺环化合物的合成基于本实验室先前的研究，但进行了一些修改（图1)11,12通过红外光谱监测每步反应的进程。REM连接子的迈克尔加成反应&#160;1&#160;与糠基胺反应得到聚合物结合的&#160;2&#160;（IR 1722 cm⁻¹）-1 → 1731 cm-1）。根据先前的报道，ISOC 的&#160;2&#160;生成了三环杂环化合物&#160;3，通过检测到TMS基团（IR 1214 cm⁻¹）得以证实-1）。这是合成过程中的关键步骤，因为异氰酸酯（ISOC）提供了产物所需的区域选择性和立体选择性。羟基的伸缩振动频率为3500 cm⁻¹-1&#160;观察到的是三...

已知小分子抑制E3泛素连接酶鼠双微体2同源物（MDM2）与p53之间的相互作用，可恢复p53介导的肿瘤细胞凋亡诱导作用1,2,3。MDM2是p53信号通路的负调控因子，在癌细胞中常呈过表达状态4,5,6,7,8,9。近期的晶体学与生物化学研究表明，含有螺环结构骨架的小分子可有效抑制MDM2与p53的相互作用10。该螺环骨架结构（图1，蓝色阴影部分）被视为一种优势结构基元，因其刚性正交环系的衍生化已促成多种新型治疗药物的发现。然而，采用传统有机合成方法构建此类独特结构仍具挑战性。尽管螺环分子在生物体系中的治疗效应已被广泛研究，其合成过程依然繁琐，常伴随副产物生成、反应条件剧烈以及使用有害过渡金属等问题。
螺环结构单元在药物开发中的潜在应用推动了一种利用固相合成方法构建分子库的方案的发展，该分子库包含螺环结构单元以及其他可替换的功能基团11,12。通过使用连接在树脂珠上的REM连接剂和固相过滤反应器，可在各步骤之间简便地实现产物与反应物的分离。这种方法可减少操作步骤，并有可能提高产率。该合成策略能够生成大量潜在的药物候选分子。然而，这些分子在生物体系中的有效性仍需进一步研究。
为了确定这些螺环化合物的细胞毒性，采用了MTT法13,14。该方法通过检测细胞活力，间接评估细胞毒性。将不同浓度的抑制剂加入96孔板中培养的细胞，通过比色法分析线粒体脱氢酶将黄色MTT还原为紫色甲臜化合物的程度，从而测定活细胞比例（图2）。实验结果通常以IC50值表示，即与未处理对照组相比，细胞生长被抑制50%时的化合物浓度。本文描述了MTT法的实验步骤以及这些新型螺环分子的初步研究结果。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS-7 细胞 (ATCC CRL-1651)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>非洲绿猴肾细胞</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-溴辛烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152951</td><td>卤代烷</td></tr><tr><td>烯丙基溴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>337528</td><td>卤代烷</td></tr><tr><td>苄基溴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td>卤代烷</td></tr><tr><td>顺铂</td><td>Cayman Chemical</td><td>13119</td><td>细胞毒性对照</td></tr><tr><td>二氯甲烷 (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺 (DMF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 L-谷氨酰胺</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>糠胺</td><td>Acros Organics</td><td>119800050</td><td>试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碘甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td>卤代烷</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）</td><td>EMD Millipore</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>试剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>REM 树脂</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>聚合物载体；负载量 0.500 mmol/g</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;反&lt;/em&gt;-&amp;beta;-硝基苯乙烯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>硝基烯烃试剂</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>三乙胺 (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>β-消除反应试剂</td></tr><tr><td>三甲基氯硅烷 (TMSCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529</td><td>试剂；注意——高度挥发性，会产生 HCl 气体</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;玻璃器皿/仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL 固相反应瓶</td><td>Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>带滤板的玻璃器皿</td></tr><tr><td>96 孔板读数仪</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td>仪器</td></tr><tr><td>AVANCE III 核磁共振波谱仪</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>仪器；300 MHz；溶剂：CDCl3 和 CD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicolet iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>仪器</td></tr><tr><td>腕式振荡器</td><td>Burrell Scientific</td><td>757950819</td><td>仪器</td></tr></tbody></table>

功能化螺环杂环化合物的合成及细胞毒性检测

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

最近文献报道，螺环杂环化合物可能成为癌症治疗的潜在药物。这些新型正交环系的合成具有挑战性。近期发表了一种高效的合成方法，将原本报道的五步合成缩短为四步固相合成。这种更短合成路线的优势在于避免了有毒试剂的使用。研究发现，低负载量的再生型迈克尔（Regenerating Michael, REM）接头树脂在合成中至关重要，因为高负载量的树脂会阻碍含有大位阻苯基和芳香侧链试剂的引入。采用比色法3-(4′,5′-二甲基噻唑-2′-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测这些新型螺环分子在微摩尔浓度下的体外细胞毒性。MTT试剂 commercially readily available，且能提供相对快速、可靠的结果，因此该实验非常适合用于评估此类螺环杂环化合物。实验同时测试了正交环结构以及糠基胺（一种合成方法中的前体，含有类似的五元环结构单元）。

螺环肟类化合物6和7采用改进的方案合成（图1）。将糠胺进行迈克尔加成反应连接到REM接头1b上，得到聚合物结合的树脂2。通过红外（IR）光谱监测反应进程，检测1722 cm⁻¹处α,β-不饱和酯峰的消失情况-1 (图3）。螺环固定树脂4由2通过瞬时中间体3形成。4的甲醇解反应生成3-[（3E)-(2S, 4R)-2-苯基-3-羟基亚氨基-4-羟甲基-吡咯烷-1-基]-丙酸甲酯 7，而烷基化反应随后进行β-消除则得到 (3E)-(2S, 4R)-4-羟甲基-1-甲基-2-苯基-3-吡咯烷酮肟 6。螺环肟类化合物的结构通过以下方法确定： 1H 和 13C核磁共振波谱分析以及基于我们先前结果的质谱纯度分析11.
MTT 法是一种众所周知的比色法，用于测定细胞活力<sup...

本文介绍了一种利用3-(4′,5′-二甲基噻唑-2′-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的生物测定法，用于测试先前合成的螺环肟类化合物。

螺环杂环化合物最近在文献中被报道为癌症治疗的潜在药物。这些新型正交环结构的合成……

本方案采用一种可循环利用且经过改进的方法来制备螺环化合物。MTT 法有助于解答这些新型分子细胞毒性的相关问题。该技术利用可再生的起始材料，生成可进一步修饰的新型分子。MTT 法可提供相对快速且易于分析的生物学结果。首先，按照先前已展示的方法进行螺环杂环化合物六和七的固相合成。使用无菌 PBS 作为稀释液，配制 20 毫升浓度为 5 毫克/毫升的 MTT 溶液。过滤后于 -20 °C 保存。然后，用DMEM将MTT溶液按1:1比例稀释。在1.5毫升微量离心管中，分别配制1毫升以DMSO为溶剂的待测化合物储备液。将储备液于-20°C保存。通过将储备浓度稀释，在无血清培养基中每剂量配制 200 微升的测试化合物工作液，稀释倍数为 1 至 1000。在组织培养超净台中，将 COS-7 细胞以每 200 微升 4,000 个细胞的浓度接种于平底组织培养处理的 96 孔板中，使用完全培养基。使用多通道移液器。将细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的 atmosphere 中孵育24小时。次日，使用连接真空泵的玻璃巴氏移液器吸出孔板中的上清液。使用先前配制的工作液，将待测化合物以三复孔的方式加入细胞中。然后将细胞放回培养箱中孵育。24小时后，吸去各孔中的上清液，并向每孔加入200微升MTT溶液。将培养板孵育四小时。轻轻抽吸各孔中的上清液，注意不要扰动紫色的甲臜结晶。每孔加入200 µL DMSO以溶解结晶。然后在室温下孵育平板15分钟。使用96孔板读板仪在590或600纳米波长下测定每个孔的吸光度。以不含细胞的孔作为空白对照，并计算吸光度的平均值。采用改进的方案合成了螺环缩醛糖苷六和七。通过红外光谱法检测α,β-不饱和酯的消失来监测反应进程。使用MTT法测定细胞活力。已知在高浓度下可诱导细胞死亡的顺铂被用作阳性对照。正如预期，顺铂浓度越高，细胞存活率越低。随后采用MTT法检测螺环化合物六和七以及糠基胺。糠基胺与螺环化合物六的细胞毒性相似。然而，螺环化合物七的毒性明显高于糠基胺和化合物六。在进行本实验方案时需注意，使用大位阻的酰卤进行N-烷基化反应会降低β-消除反应的速率，从而导致产物收率下降。

functionalized-spirocyclic-heterocycle-synthesis-cytotoxicity

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

功能化螺环杂环合成和细胞毒性测定

本文描述了一种合成对空气敏感的钛和钒类抗癌药物的方法，并通过MTT法评估了这些药物对人癌细胞系的细胞毒性活性。...

抗癌金属配合物：合成及通过 MTT 法评估细胞毒性

一种通过光催化与溴化物协同作用，利用C-H键官能团化与苯胺反应两步合成具有药理活性的吲哚衍生物的方法被描述，使用光催化和溴化物ø酸催化...

通过中间体过氧化物（CHIPS）的光化学和酸催化C-H官能化合成抗病毒四氢咔唑衍生物

本文介绍了一种高效合成螺环杂环化合物的实验方案。该五步合成法采用固相合成与可再生的迈克尔连接子策略。螺环化合物通常难以合成，本文所提出的方法具有可定制性，能够合成其他现代方法难以获得的螺环分子。...

[4.4]螺环肟的固相合成

通过简单的有机催化1,3-偶极环加成反应，可不对称合成对映体富集的双螺环[γ-丁内酯-吡咯烷-4,4'-吡唑啉酮]骨架。...

通过α-亚氨基-γ-内酯与亚烷基吡唑啉酮的有机催化环加成高效构建类药双螺环骨架

本文介绍了一种用于合成并测定具有可点击基团的模块化笼状化合物光化学性质的实验方案。...

可点击笼锁化合物的设计、合成及其光化学性质

温和条件下尾孢菌素光催化偶氮烯烃的[4+1]和[4+2]环加成反应

Claisen-Schmidt缩合反应是合成次甲基桥联共轭双环芳香族化合物的重要方法。通过采用碱介导的羟醛反应变体，可利用一种通常成本低廉且操作简便的合成途径，获得一系列具有荧光性或生物相关性的分子。...

利用Claisen-Schmidt缩合方法合成pH依赖性的吡唑、咪唑和异吲哚酮二吡咯酮类荧光染料

噻吩磺酰胺类化合物是高效且特异性的抑制剂 弧菌 群体感应调控因子LuxR/HapR，可阻断其活性 体内从而抑制毒力、运动性和生物膜相关基因的转录。本方案详细描述了这些化合物的合成与建模方法 计算机模拟，并进行检测 体内 针对 LuxR/HapR...

弧菌群体感应抑制剂的合成与检测

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一种基于荧光的天然来源蛋白质合成抑制剂初步筛选方案

本文介绍了一种通过表型筛选鉴定潜在抗结核药物候选物的实验方案，包括4-氨基喹啉类化合物的化学合成、其对结核分枝杆菌最低抑菌浓度的测定，以及在哺乳动物细胞系中对其细胞毒性的评估。...

潜在抗结核候选物的鉴定：合成、最低抑菌浓度测定及哺乳动物细胞毒性评估的逐步指南

学习固相合成螺环杂环化合物的方法，并使用MTT法测定其对COS7细胞的细胞毒性。该方案为药物开发和癌症研究提供了可靠的评估手段。

功能化螺环杂环化合物的合成及细胞毒性检测

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