植物样品中核苷/核苷酸含量测定的HPLC-MS/MS样品制备方法

核苷和核苷酸是所有生物体中核心的代谢组分。它们的代谢对于细胞发育至关重要。该方法为这些代谢物的定量提供了强有力的工具。

该方法可实现对植物中核苷和核苷酸的快速、准确定量。对于10至20个样本的一组样品，完整的样品预处理及LC-MS/MS分析约需两天时间。该方法适用于所有植物，甚至其他生物体。

本实验操作将由陈实验室的副教授 Changhua Zhu 演示。种植植物时，需将拟南芥种子在70%乙醇中灭菌10分钟，然后播种于含有1/2浓度Murashige和Skoog营养成分的琼脂平板上。将平板在4°C黑暗条件下孵育48小时，随后转移至人工气候室中，置于22°C光照16小时、20°C黑暗8小时的条件下培养。

收获两周大的幼苗100毫克，并用液氮速冻以用于代谢物提取。将100毫克冷冻植物组织与七至八颗钢珠在预冷的混合球磨仪中研磨五分钟，频率为60赫兹。配制提取溶液，其中甲醇、乙腈和水的体积比为2:2:1。

用一毫升提取液重悬匀浆后的材料。将所得溶液在4摄氏度下以12,000 ×g离心15分钟，然后将0.5毫升上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并在液氮中速冻。将冷冻样品在冷冻干燥仪中蒸发，再用0.5毫升5%乙腈和95%水重悬。

将所得溶液在 4,000 ×g 条件下，4 摄氏度离心 10 分钟。取上清液转移至小瓶中用于 LC-MS/MS 检测。通过将 1.5 克乙酸铵溶解于 2 升双蒸水中，配制 10 毫摩尔的乙酸铵缓冲液。

用10%氨水和乙酸将pH值调节至9.5。为核苷测定准备两升超纯100%甲醇，然后为核苷酸测定准备两升超纯乙腈。将每份先前制备的样品经预处理后的代谢物提取液各取0.02毫升注入配备二元泵的高效液相色谱系统，并连接三重四极杆质谱仪进行分析。

为生成标准校准曲线，将六个样品提取液混合并涡旋混匀，然后将混合液重新分装为六份提取液，以获得各自的背景值。分别向这六份提取液中加入六种不同浓度的标准品，随后依次注入高效液相色谱系统。通过质谱转换记录各标准品在不同浓度下的峰面积。

本方案用于鉴定和定量分析两周龄拟南芥野生型幼苗中的N1-甲基腺苷（一种已知的修饰核苷）。质谱分析谱图显示，N1-甲基腺苷标准品产生的产物离子质荷比（MZ）为150和133。在哥伦比亚零号（Colombia zero）提取物中也观察到相同的谱图。

由于质荷比为150的产物离子丰度较高，因此选择282.1至150的质量跃迁用于N1-甲基腺苷的鉴定。目标峰的保留时间为7.05分钟，与N1-甲基腺苷标准品的保留时间相同。

将一系列浓度的N1-甲基腺苷标准品加入六份样品提取物中。将标准样品注入液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），并将N1-甲基腺苷的峰面积增加值对标准品的标称浓度作图。这六份相同的背景提取物对于构建准确且可重复的定量校准曲线至关重要。

我们的方法可用于探索植物中的代谢通路。通过比较野生型与功能缺失突变体的代谢物谱，可绘制出代谢流图谱。