通过卵母细胞玻璃化冷冻实现生育力保存：临床与实验室视角

卵母细胞玻璃化冷冻及复温操作对于生育力保存至关重要。按照本方案进行操作，可使使用者最大程度地提高这些操作的有效性。目前，以卵母细胞玻璃化冷冻方式进行生育力保存已成为一种成熟且符合伦理的可接受方法。

这有助于实现有效且一致的临床结果，并克服与胚胎冷冻保存相关的伦理和法律限制。为了熟练掌握玻璃化冷冻技术，必须熟悉方案中的所有关键步骤，尤其要注意样本在冷冻保护剂中的暴露时间。在取卵后38小时内，在去颗粒细胞后立即用患者姓名、ID和溶液类型标记所有塑料耗材，并请见证人核对冷冻装置上的患者信息。

所有耗材标记完毕后，轻轻翻转卵母细胞小瓶数次以混匀，然后在培养皿中加入一滴30微升含人血清白蛋白的HEPES缓冲液，以及一滴相邻的30微升平衡液。使用剥卵移液器将卵母细胞放入第一滴液中，并在该液滴与另一30微升平衡液滴之间建立一段培养基桥，以实现冷冻保护剂浓度的逐步升高。三分钟后，在培养皿中再加入第二滴30微升平衡液，并用移液器在液滴之间形成培养基桥。

在卵母细胞平衡的同时，将每个冷冻装置所需的一滴30微升平衡液加入培养皿中。三分钟后，将卵母细胞转移至纯平衡液中，孵育6至9分钟，使卵母细胞恢复至初始大小。当卵母细胞恢复后，准备一个中央凹陷的体外受精培养皿，其中含有1毫升玻璃化冷冻液。

将卵母细胞转移至培养皿中，尽量减少携带的培养液，并轻轻移动以去除多余的平衡液。在孵育结束前约10秒，将标记有患者信息的冷冻载片置于显微镜下，并调节焦距至冷冻载片的尖端。将卵母细胞置于冷冻载片尖端旁，尽量使用最少的玻璃化冷冻液，并将移卵管移开，以去除多余的冷冻液，使卵母细胞表面仅覆盖一层薄薄的培养液。

迅速将冷冻装置浸入液氮中，并快速晃动装置以去除其表面的任何气泡。用镊子夹住冷冻装置的保护帽，先将液氮注入帽中，然后在保持丙烯条处于液氮中的同时，将装置插入帽内。随后将冷冻装置存放在标有患者信息的冻存管中，并更新实验记录表。

进行卵母细胞复温时，小心翻转已预热至室温的解冻液、稀释液和洗涤液小瓶，将1毫升解冻液加入培养皿的中央孔中，并在37摄氏度下孵育至少一小时。用患者的姓名、ID及溶液类型标记所有塑料耗材，并请见证人核对冷冻装置上的患者信息。对每个需要复温的装置，在六孔板的第一孔中加入200微升稀释液，并在第二和第三孔中各加入等体积的洗涤液。

向孔外区域加入 PBS，以防止溶液蒸发。将解冻液的培养皿置于体视显微镜下，并调节焦距至培养皿中心。在保持丙烯条处于液氮中的同时，小心扭转以取下冷冻装置的保护帽，并尽快将冷冻装置从液氮转移至解冻液中，以避免发生脱玻璃化。

一分钟后，聚焦于冷冻装置的尖端以定位卵母细胞，并可使用剥卵移液管轻轻将卵母细胞从装置上释放。使用直径为170微米的剥卵移液管，将卵母细胞及少量解冻液转移至六孔板第一孔中的稀释液中。三分钟后，将卵母细胞移入洗涤液的第一孔中，洗涤五分钟。

孵育结束后，将卵母细胞转移至第二孔洗涤液中，在37摄氏度下孵育1分钟，然后将卵母细胞转入适量预平衡的体外受精（IVF）培养基中培养1小时，并更新实验室记录表。在12年期间，共有285名女性接受了至少一次取卵手术，每次手术均对所获得的全部成熟卵子进行玻璃化冷冻。其中大多数女性仅接受了一次取卵手术。

35例患者接受了多次取卵。进行卵母细胞采集以实施卵子玻璃化冷冻的原因通常分为非癌症类医学原因、癌症、非医学原因及其他原因。因医学原因（非癌症）或因癌症进行生育力保存而接受卵子冷冻的患者，其年龄较轻，且窦卵泡计数高于因非医学原因或其他原因接受卵子冷冻的患者。

然而，由于出于医学原因患者的平均成熟率略低，各组间平均冷冻的卵母细胞数量相似。大约一半非癌症医学原因的患者以及大多数其他原因进行卵子冷冻的患者实际上返回进行了解冻。相反，因癌症或非医学原因进行生育力保存的患者中，极少数人使用其冷冻的卵母细胞进行体外受精（IVF）。

尽管玻璃化冷冻与复温之间的时间间隔存在差异，但各患者组的卵母细胞存活率相似，证实了卵母细胞玻璃化冷冻与复温方案的有效性和安全性。此外，存活率与执行玻璃化冷冻和复温操作人员的经验无关。其中最关键的、可能影响结果一致性的步骤与复温过程相关。

因此，严格控制解冻溶液的体积和温度至关重要。卵巢组织冷冻保存是目前唯一正在研究中的、可用于青春期前患者的生育力保存策略。尽管该方法前景广阔，但仍存在重要局限性，限制了其临床应用。