Name: 通过卵母细胞维他化保存生育能力:临床和实验室视角 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解卵母细胞玻璃化冷冻技术在生育力保存中的临床应用，掌握关键操作步骤与冷冻保护剂暴露时间控制。该方法可有效提高卵子存活率并确保治疗安全性与一致性。

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1. 处理与临床咨询
注意：对于因肿瘤相关原因需要进行生育力保存的患者，应确保安排咨询时无等待名单，并尽快提供就诊预约。
<ol>
	<li>检查患者的病史和既往资料，评估其整体健康状况。</li>
	<li>将所有信息（包括癌症患者接受促排卵治疗的肿瘤科医生批准意见）记录在关系型数据库中。</li>
	<li>向患者提供关于该操作可行性的专门咨询，解释操作步骤（卵巢刺激、卵母细胞采集、卵母细胞玻璃化冷冻），并告知其实际成功率（主要取决于母亲年龄及取卵时预计获得的MII期卵母细胞数量）、费用以及该操作的局限性。</li>
	<li>进行经阴道超声检查，获取卵巢储备功能信息（即窦卵泡计数，AFC），并评估卵巢是否便于取卵操作。</li>
	<li>要求进行血液检测，以评估血型和Rh因子、凝血功能筛查（血常规、凝血酶原、凝血活酶、纤维蛋白原、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III、同型半胱氨酸）以及传染病检测（乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、性病研究实验室试验/梅毒螺旋体血凝试验）。 
	注意：对于因非紧急医疗原因接受生育力保存项目的患者，更全面的评估可包括基础卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇、抗缪勒管激素（AMH）、乳腺检查、巴氏涂片、凝血相关基因筛查（V因子Leiden突变和凝血酶原基因突变）以及TORCH筛查（弓形虫、风疹、巨细胞病毒）。</li>
	<li>要求进行心脏科评估（心电图）。</li>
	<li>建议进行心理咨询服务。</li>
</ol>
2. 生育力保存的控制性卵巢刺激方案
注意：当开始癌症治疗前可用时间有限时，建议对有生育力保存指征的肿瘤患者采用随机启动方案（即在月经周期的任何时间启动卵巢刺激）。对于因非紧急医疗原因或社会因素进行生育力保存的患者，优选在卵泡早期阶段开始的传统刺激方案，卵巢刺激的启动需依据月经周期。控制性卵巢刺激（COS）方案应根据欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）最新指南24进行。

<ol>
	<li>根据患者的特征和卵巢储备标志物（主要是母体年龄、FSH、AMH 和 AFC）个体化制定控制性卵巢刺激（COS）方案。</li>
	<li>在月经周期第5天开始使用重组或尿源性FSH进行控制性卵巢刺激，剂量固定为150–300 IU/天（拮抗剂方案）。 
	注意：对于存在LH缺乏或反应差/反应欠佳的特定患者群体，可根据卵巢反应、LH水平及妇科医生判断，额外添加LH 75/150 IU/天。</li>
	<li>对于雌激素敏感性疾病患者，在促排卵开始第1天至取卵后第7天期间，联合使用促性腺激素与芳香化酶抑制剂（来曲唑）。</li>
	<li>以固定剂量给予促性腺激素持续4天。</li>
	<li>从第5天起监测卵泡生长，之后每2–3天监测一次，并根据情况调整促性腺激素剂量。</li>
	<li>当至少有3个卵泡直径达到17–18 mm时，给予单次皮下注射0.5 mL GnRH激动剂作为触发剂，诱导卵母细胞最终成熟。</li>
</ol>
3. 卵母细胞采集
<ol>
	<li>准备取卵
	<ol>
		<li>所需材料请参见 材料表并备好实验室鞋具和服装、外科口罩、头套、外科手套、永久性无毒记号笔、镊子、无菌小纱布、一次性或可重复使用的窥器、阴道手术器械以及表面消毒剂。确保手术室内配备有复苏设备、麻醉拮抗药物、过敏性休克治疗包以及氧气。</li>
		<li>根据欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）辅助生殖技术（ART）超声工作组的建议进行取卵手术25.
		<ol>
			<li>给予镇静或全身麻醉，以及预防性抗生素。 
			&#8203;注意：在本方案中，通过给予丙泊酚（剂量根据患者体重调整）、50–100 µg 芬太尼、1000 mg 对乙酰氨基酚，并辅以氧气面罩通气，实现深度镇静。</li>
			<li>使用由真空泵、连接至17 G单腔针头的收集管以及卵母细胞收集管组成的抽吸装置进行卵母细胞采集。采集过程中，负压不得超过约120 mmHg，以避免对卵母细胞造成损伤，例如去除卵丘细胞或破坏透明带。</li>
			<li>将工作台面温度校准至确保培养基温度为37 °C。在整个操作过程中，尽量减少卵母细胞暴露于任何可能影响其发育潜能的短暂温度变化。</li>
			<li>取卵术结束后，应在出院前对患者观察3-4小时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术室
	<ol>
		<li>进入手术室前，确认患者身份并核实排卵触发时间。</li>
		<li>让患者以妇科体位平卧于手术台上。</li>
		<li>取卵前清洁阴道/宫颈，以尽量减少细菌污染。</li>
		<li>进行初步的经阴道超声检查，以评估卵巢的位置及其与各器官和血管的解剖关系。</li>
		<li>在超声引导下，将单腔针穿过阴道壁并进入卵巢卵泡，注意避免损伤位于阴道壁与卵巢之间的器官或血管。</li>
		<li>从最近的卵泡开始抽吸，然后逐渐移向最远端的卵泡。</li>
		<li>穿刺所有直径大于11-12 mm的卵泡，操作时应 &#34;扭转运动&#34; 用针抽吸全部卵泡液，然后将其释放到手术室恒温块加热器中预热的无菌试管（圆底，14 mL）中。</li>
		<li>取出后立即密封试管，并贴上标注患者身份信息的标签。</li>
		<li>确保护士将试管送至实验室，立即检测其中是否存在卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。</li>
		<li>指示胚胎学家告知临床医生所获取的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）总数。</li>
		<li>完成第一个卵巢的操作后，用干净的培养基冲洗针头，然后采用相同的操作步骤对第二个卵巢进行处理。</li>
		<li>取卵后，评估卵巢或子宫旁组织血管是否有出血，以及道格拉斯窝内是否有游离液体。 
		&#8203;注意：为在临床层面实现配子和胚胎可追溯性的自动化并提高其有效性，该中心引入了电子见证系统（EWS）。26然而，本方案未提及电子配子/胚胎监控系统（EWS），以确保该方案可在任何体外受精实验室中重复实施。但需注意，操作流程的每一步均需第二位操作人员（即见证人）在场，以确保配子与胚胎的可追溯性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体外受精实验室
<ol>
	<li>取卵手术前一天
	<ol>
		<li>准备取卵收集管（参见材料表）。
		<ol>
			<li>在每个取卵收集管（圆底，5 mL）中加入 1 mL 体外受精培养基（参见材料表），并在其上覆盖 0.2 mL 矿物油（参见材料表），用于胚胎培养。 
			&#8203;注意：所需试管数量应根据预计获取的卵泡数量确定。每支试管最多可容纳 4 个卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用瓶盖（先卡紧）密封试管，并标注培养基类型和配制日期。将试管置于 37 °C、含 6% CO2 和 5% O2 的控制气氛培养箱中过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取卵当天
	<ol>
		<li>将塑料耗材（无菌培养皿和巴斯德吸管）在 37 °C 预热。</li>
		<li>请患者确认其身份信息（全名和出生日期）以及排卵触发时间。在实验室记录单上注明已完成身份识别（ID）程序，并已确认排卵触发时间。</li>
		<li>在手术开始前，将取卵收集管从培养箱中取出，压紧瓶盖以确保密封。用患者信息标记取卵收集管，并将其置于 37 °C 恒温金属浴中。</li>
		<li>在预热的无菌培养皿中检查卵泡液，识别卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。一旦发现一个或多个 COCs，用两滴培养基各冲洗一次，以去除卵泡液和血液污染。</li>
		<li>将 COCs 转移至取卵收集管中，并在管壁上标注 COCs 数量。松开培养基管的管盖，立即将其置于 37 °C、含 6% CO2 和 5% O2 的气氛中孵育。</li>
		<li>根据所获取卵母细胞的数量重复步骤 7 至 9。更新实验室记录单。 
		&#8203;注意：确保有见证人核查所有试管加热块（包括手术室内的）均已清空，并在实验室记录单上签署确认操作结束。</li>
		<li>操作完成后清洁工作台面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 卵母细胞去丘化
<ol>
	<li>在开始操作前至少1小时，将4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液和透明质酸酶（参见材料表）于37 °C预热。</li>
	<li>准备一个4孔体外受精（IVF）培养板（参见材料表），每孔加入0.6 mL预热的HEPES缓冲液（添加5%人血清白蛋白[HSA]），并在其上覆盖0.3 mL矿物油用于胚胎培养，于37 °C保温至少30分钟。</li>
	<li>在卵母细胞去颗粒细胞培养板上标注患者身份信息。</li>
	<li>在开始操作前立即向第一孔中加入透明质酸酶，使其终浓度约为20 IU/mL。</li>
	<li>将少量卵丘-卵母细胞复合体（COCs，最多6个）放入含酶的第一孔中，以分散卵丘细胞。</li>
	<li>为增强酶解去除卵丘细胞和放射冠细胞的效果，使用内径约250 μm的巴斯德移液管反复吹打卵母细胞，持续最多30秒，以机械剥离卵丘细胞。观察到细胞初步解离后，将卵母细胞转移至仅含HEPES缓冲液的第二孔中，注意尽量减少酶的带入。</li>
	<li>使用内径逐渐减小的去颗粒细胞移液管（170–145 µm）进一步去除放射冠细胞。仅在必要时使用更小内径（135 µm）的移液管。</li>
	<li>小心清洗去颗粒细胞后的卵母细胞，以彻底清除残留酶液。</li>
	<li>去颗粒细胞后，在倒置显微镜下检查卵母细胞，评估其完整性和成熟阶段。将MII期卵母细胞与未成熟卵母细胞（生发泡期和中期I）分开。</li>
	<li>将MII期卵母细胞转移至玻璃化冷冻区域，立即进行冷冻保存。更新实验室记录表。</li>
</ol>
6. 卵母细胞玻璃化冷冻
注意：建议在取卵后38小时内完成卵母细胞玻璃化冷冻，并在去颗粒细胞后立即进行。此处描述的玻璃化冷冻操作必须在室温（RT）下进行，并使用内径为170 µm的吹打移液管，以避免操作过程中对卵母细胞造成损伤。
<ol>
	<li>在操作前约30分钟，将平衡液（ES）和玻璃化冷冻液（VS）置于室温（25–27 °C）。</li>
	<li>使用患者的姓名和ID、治疗ID、冷冻日期、卵母细胞数量以及冷冻条形码，正确标记冷冻装置。</li>
	<li>用新鲜的液氮将一次性冷却架装至顶部，然后开始灭菌程序。</li>
	<li>标记玻璃化冷冻板（参见 材料表) 并填写患者的姓名和ID。请见证人核对冷冻器械的正确编号。</li>
	<li>使用前将每个小瓶轻轻倒置两次以混匀内容物，并在6 mm培养皿盖上准备一滴30 µL含5% HSA的HEPES缓冲液，旁边相邻位置准备另一滴30 µL的ES。 
	注意：使用前立即滴加，以减少培养基蒸发。</li>
	<li>使用直径为170 µm的吹打移液管，将卵母细胞（最多9个）以尽可能小的培养基体积转移至第一滴液中。用吹打移液管在第1滴与第2滴之间形成培养基桥接，以实现冷冻保护剂（CPAs）浓度的逐步增加图1A).</li>
	<li>将卵母细胞在第一滴液滴中孵育3分钟。加入30 µL的ES溶液作为第三滴（第3滴）。3分钟后，将卵母细胞转移至第二滴ES液滴中，并在第3滴与第2滴之间建立液体桥。图1B将卵母细胞在第3滴液中孵育3分钟。</li>
	<li>孵育期间，为每个将要使用的冷冻装置添加一滴30 µL的ES溶液（若要冷冻保存9个卵母细胞，则放置3滴ES溶液，每滴ES溶液中含3个卵母细胞）。将卵母细胞移入纯ES溶液中，静置6–9分钟（直至卵母细胞在皱缩后恢复至初始大小）。图1C).</li>
	<li>准备一个中心孔培养皿（60 × 15 mm），加入1 mL冷冻保护液（VS）。在第一个6 min结束时，将待冷冻保存的卵母细胞转移至VS溶液中，尽量减少携带的培养基。让卵母细胞在VS中停留1 min，然后通过将其从培养皿底部缓慢移至液面以轻轻洗涤，去除残留的平衡液（ES）。</li>
	<li>在孵育的最后约10秒前，将冷冻装置置于显微镜下，并对焦于黑色标记处（即冷冻装置的尖端）。将卵母细胞连同最少量的玻璃化冷冻液（VS）放置在冷冻装置上黑色标记旁图2A).</li>
	<li>将剥离用移液管从卵母细胞移开，并吸除多余的VS培养基（图 2B）以确保卵母细胞始终被一层薄薄的培养基覆盖（图2C).</li>
	<li>迅速将冷冻装置浸入液氮中，并快速晃动以去除其表面的气泡。用镊子夹住冷冻装置的保护帽，向其中注入液氮，然后在保持丙烯条处于液氮中的同时，将冷冻装置插入其中。</li>
	<li>将冷冻装置存放在已标记患者信息的可视管中。更新实验室记录表。</li>
</ol>
7. 卵母细胞复温
<ol>
	<li>操作前约30分钟，将解冻液（TS）、稀释液（DS）和洗涤液（WS）升温至室温（25–27 °C）。轻轻倒置每个小瓶两次以混匀内容物。取1 mL TS加入中心井培养皿中，并在开始操作前于37 °C下预热至少1小时。</li>
	<li>用患者姓名、ID及溶液类型标记所有塑料耗材。请见证人核对冷冻装置上的患者信息。</li>
	<li>对于每个需要复温的冷冻装置，准备一个6孔板，在第一孔中加入200 µL DS，第二和第三孔中各加入等量的WS（分别命名为WS1和WS2）。在孔外区域加入磷酸盐缓冲液（PBS）或无菌水，以防止蒸发。</li>
	<li>从培养箱中取出TS培养皿，置于显微镜下。调节显微镜焦距至培养皿中心。</li>
	<li>小心扭转并取下冷冻装置的保护帽，同时保持丙烯条处于液氮中。尽快将冷冻装置从液氮转移至TS中，以避免玻璃化状态破坏的风险，并立即开始计时（1分钟）。</li>
	<li>通过聚焦冷冻装置末端（即黑色标记处）定位卵母细胞。使用剥卵移液管将卵母细胞从冷冻装置上释放。 
	注意：尽量避免用移液管直接吸出卵母细胞；轻轻向其上方滴加少量液体，使其自然脱离并进入TS中。</li>
	<li>使用直径为170 µm的剥卵移液管，将卵母细胞连同少量TS一并转移至DS中（以形成浓度梯度），并在DS中静置3分钟。随后以同样方式将卵母细胞转移至WS1，静置5分钟。最后将其转移至WS2，静置1分钟。</li>
	<li>将卵母细胞转移至适当的预平衡IVF培养液中，在进行卵胞浆内单精子注射（ICSI）前孵育1小时。更新实验室记录表。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

临床注意事项 
尽管新兴策略（如卵巢组织冷冻保存和体外成熟技术）已被探索，但在控制性卵巢刺激（COS）后进行卵母细胞玻璃化冷冻仍是生育力保存的金标准技术。在此背景下，应尽可能在最短时间内获取并冷冻保存更多的卵母细胞，因为大多数癌症患者可能仅能在开始抗癌治疗前完成一个卵巢周期。因此，合理的卵巢刺激方案对于充分挖掘卵巢储备潜能、提高未来活产的累积概率至关重要28，而这一结局高度依赖于取卵时的 maternal 年龄。目前尚未提出用于生育力保存目的的卵母细胞玻璃化冷冻的理想年龄29，学界尚需在35岁18或37岁30,31之间达成共识。然而，只要向患者充分告知基于其年龄的成功率，生育力保存应向所有患者开放，包括年龄超过37岁的女性。
药物方案和...

建立并实施高效的人类卵母细胞冷冻保存方案是生殖医学领域的一项重大突破。近期证据表明，玻璃化冷冻是保存减数分裂II期（MII）卵母细胞最有效的方法，与慢速冷冻相比，其卵母细胞存活率在统计学上显著更高，且该结果不受患者人群（不孕患者或卵母细胞捐赠项目）的影响1,2,3。卵母细胞玻璃化冷冻技术取得的显著成果，促使美国生殖医学会（ASRM）和辅助生殖技术学会（SART）的实践委员会宣布，该技术是青春期后女性出于医学或非医学指征进行选择性生育力保存的最有效手段4,5,6。生育力保存的医学指征包括：（i）需要接受放疗、细胞毒性化疗或内分泌治疗的癌症及自身免疫性疾病7（这些治疗对卵巢储备功能的不利影响与母亲年龄以及治疗类型和剂量相关）；（ii）需要反复或根治性手术的卵巢疾病（如子宫内膜异位症）8；以及（iii）遗传性疾病（如脆性X染色体综合征）或早发性卵巢功能衰竭。此外，对于因非医学原因尚未完成生育目标的所有女性而言，生育力保存也已成为一项有价值的可选方案（亦称为社会性冷冻）。
无论出于何种指征进行生育力保存，根据主要的国际生育力保存指南，所有希望进行卵母细胞玻璃化冷冻的患者都应接受适当的咨询，以了解其实际的成功概率、费用、风险以及该操作的局限性9,10,11,12,13。最重要的是，必须明确的是，冷冻一批成熟II期（MII）卵母细胞并不能保证妊娠成功，而只是在必要时为未来的体外受精（IVF）治疗提供更高的成功率14。在这方面，女性进行卵母细胞冷冻时的年龄无疑是最重要的限制因素15，因为高龄产妇（AMA；&#62;35岁）是女性不孕的主要原因16。除了卵巢储备功能进行性下降外，高龄产妇还伴随着卵母细胞发育潜能的减退，这与代谢、表观遗传调控、细胞周期检查点以及减数分裂分离等生理通路的功能缺陷有关17。因此，需要冷冻保存的合理卵子数量主要取决于女性的年龄。对于年龄小于36岁的女性，至少需要冷冻8–10个MII期卵母细胞18，以最大化成功机会。总体而言，冷冻卵母细胞的数量越多，成功的机会就越高。因此，根据卵巢储备标志物（如抗苗勒管激素（AMH）水平或窦卵泡计数（AFC））个体化制定卵巢刺激方案，对于在尽可能短的时间内充分挖掘卵巢储备至关重要。
整个程序的安全性是患者接受生育力保存时的另一个关键问题。临床医生应采用最佳策略以尽量降低风险，并通过安全的方法预防（i）卵巢过度刺激综合征（OHSS），例如使用促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂方案，随后采用GnRH激动剂触发。19 以及（ii）取卵过程中存在远程但可能的风险，包括腹腔内出血、盆腔结构（输尿管、肠管、阑尾、神经）损伤或盆腔感染。最后，（iii）传统的促排卵方案会导致血清雌二醇水平高于生理范围，因此不建议用于乳腺癌等雌激素敏感性疾病。在此类情况下，采用芳香化酶抑制剂（如来曲唑或他莫昔芬）的方案更为合适20,21在实验室环境中，卵母细胞玻璃化冷冻最广泛使用的方案仍然是由Kuwayama及其同事首次描述的方法。2,23，该过程包含逐步添加冷冻保护剂（CPAs）的程序。第一阶段（平衡/脱水阶段），将卵母细胞置于含有7.5% v/v乙二醇和7.5% v/v二甲基亚砜（DMSO）的CPA溶液中；第二阶段，将卵母细胞转移至玻璃化冷冻液，其中含15% v/v乙二醇、15% v/v DMSO以及0.5 mol/L蔗糖。在玻璃化溶液中短暂孵育后，可将卵母细胞置于特制的开放式冷冻载具中，迅速投入-196 °C的液氮中保存，直至使用。
本文通过以下三个方面详细描述了生育力保存治疗的完整临床和实验室操作流程：（i）概述客观且基于证据的咨询建议，（ii）关注该操作的成本效益，（iii）阐述最合适的策略，以充分挖掘卵巢储备功能，并在尽可能短的时间内最大化获取卵母细胞的数量。文中将详细说明卵巢储备功能的评估、理想促排卵方案的制定，以及卵母细胞的采集、去颗粒细胞处理和玻璃化冷冻操作，并介绍提高这些步骤有效性、效率和安全性的方法。由于文献中存在其他类似或经修改的方案，本文的代表性结果与讨论部分仅适用于本方案所述的操作流程。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;采集&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;设备&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>IVF 技术</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室标志物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>IVF 技术</td><td></td><td>A级气流</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>试管加热器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三气培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5M-PE</td><td>02/CO2</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>库克</td><td>K-MAR-5200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSCM（连续单细胞培养完全）培养基</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90165</td><td>添加HSA的IVF培养基</td></tr><tr><td>用于胚胎培养的矿物油</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>取卵针（单腔）</td><td>库克</td><td>K-OSN-1730-B-60</td><td></td></tr><tr><td>初级培养皿</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Corning Primaria 培养皿 100x20 mm 标准细胞培养皿</td></tr><tr><td>圆底管</td><td>Falcon</td><td>352001</td><td>Falcon 14 ml 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖</td></tr><tr><td>圆底管</td><td>Falcon</td><td>352003</td><td>卵母细胞采集管 / Falcon 5 ml 12×75 圆底聚丙烯试管，带卡扣盖</td></tr><tr><td>橡胶球囊</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z111589-12EA</td><td></td></tr><tr><td>无菌玻璃巴斯德吸管</td><td>Hunter Scientific</td><td>PPB150-100PL</td><td>巴斯德棉塞移液管，150毫米，MEA 和 CE 认证</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;去颗粒细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet 可调节手柄套装</td><td>库克</td><td>G18674</td><td>去颗粒细胞&amp;nbsp; 持针器</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>66003</td><td>p20</td></tr><tr><td>k-System 培养箱</td><td>Coopersurgical</td><td>G210Invicell</td><td></td></tr><tr><td>实验室标志物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>IVF 技术</td><td></td><td>A级气流</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS 架</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90101</td><td>HEPES 缓冲 HTF 中含 80 IU/mL 透明质酸酶</td></tr><tr><td>IVF 培养皿（60 × 15 mm）</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>Corning Primaria Falcon 培养皿 60×15 mm TC Primaria 标准细胞培养皿</td></tr><tr><td>4孔带滑盖培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>176740</td><td>4孔多孔培养皿（Nunc）</td></tr><tr><td>IVF One 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353653</td><td>Falcon 60 x 15 mm TC 处理中心井 IVF</td></tr><tr><td>用于胚胎培养的矿物油</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>改良型 HTF 培养基</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>HEPES缓冲液</td></tr><tr><td>橡胶吸头</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z111589-12EA</td><td>1 mL 巴氏吸管</td></tr><tr><td>无菌玻璃巴斯德吸管</td><td>Hunter Scientific</td><td>PPB150-100PL</td><td>巴斯德棉签移液管，150 毫米，MEA 和 CE 认证</td></tr><tr><td>剥卵移液管&amp;nbsp; 提示（140 &amp;micro;m)</td><td>库克</td><td>K-FPIP-1140-10BS-6</td><td>移液器 Flexipets 用于去颗粒细胞</td></tr><tr><td>去卵丘细胞移液吸头（130 &amp;micro;m</td><td>库克</td><td>K-FPIP-1130-10BS-7</td><td>移液器 Flexipets 用于去颗粒细胞</td></tr><tr><td>剥离吸头（170 &amp;micro;m)</td><td>库克</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td>用于去核的FlexiPetts移液管</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;玻璃化冷冻&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexipet 可调节手柄套装</td><td>库克</td><td>G18674</td><td>去颗粒细胞&amp;nbsp; 持针器</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>p200</td></tr><tr><td>实验室标志物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>IVF 技术</td><td></td><td>A级气流</td></tr><tr><td>用于冷却架的不锈钢容器</td><td>Kitazato</td><td></td><td>玻璃化冷冻用液氮容器</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS 架</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>IVF 培养皿（60 × 15 mm）</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>Corning Primaria Falcon 培养皿 60 x 15 mm TC Primaria 标准细胞培养皿</td></tr><tr><td>IVF 培养皿 6 孔</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-SW02</td><td>OOSAFE&amp;nbsp;6 孔培养皿配吸管架</td></tr><tr><td>改良型 HTF 培养基</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>HEPES缓冲液</td></tr><tr><td>剥离吸头（170 &amp;micro;m)</td><td>库克</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td>用于去颗粒细胞的FlexiPetts移液管</td></tr><tr><td>玻璃化冷冻试剂盒</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90133-so</td><td>2 瓶 ES（平衡液，2 × 1 mL）和 2 瓶 VS（玻璃化冷冻液，2 × 1 mL）</td></tr><tr><td>Vitrifit</td><td>Coopersurgical Origio</td><td>42782001A</td><td>VitriFit&amp;nbsp; 方框</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;解冻&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexipet 可调节手柄套装</td><td>库克</td><td>G18674</td><td>脱颗粒细胞&amp;nbsp; 持针器</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>p200</td></tr><tr><td>k-System 培养箱</td><td>Coopersurgical</td><td>G210Invicell</td><td></td></tr><tr><td>实验室标志物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>IVF 技术</td><td></td><td>A级气流</td></tr><tr><td>用于冷却架的不锈钢容器</td><td>Kitazato</td><td></td><td>玻璃化冷冻用液氮容器</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS 架</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>CSCM（连续单细胞培养完全）培养基</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90165</td><td>添加HSA的IVF培养基</td></tr><tr><td>IVF 培养皿（60 × 15 mm）</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>Corning Primaria Falcon 培养皿 60×15 mm TC Primaria 标准细胞培养皿</td></tr><tr><td>4孔带滑盖培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>176740</td><td>4孔多孔培养皿（Nunc）</td></tr><tr><td>6孔IVF培养皿</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-SW02</td><td>OOSAFE&amp;reg;&amp;nbsp;6孔培养皿配吸管架</td></tr><tr><td>用于胚胎培养的矿物油</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>SAtripping pipette tips (300&amp;micro;m)</td><td>库克</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>移液器 Flexipets 用于去颗粒细胞</td></tr><tr><td>玻璃化冷冻解冻试剂盒</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90137-so</td><td>4 瓶 TS（解冻液，4 × 2 mL）+ 1 瓶 DS（稀释液，1 × 2 mL）+ 1 瓶 WS（洗涤液，1 × 2 mL）</td></tr></tbody></table>

通过卵母细胞玻璃化冷冻实现生育力保存：临床与实验室视角

Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives

在兼顾患者未来生活质量的多功能医疗体系中，保护女性生育力至关重要。对于青春期后女性，无论是出于医学还是非医学原因，卵母细胞冷冻保存已被多个国际科学组织公认为生育力保存的金标准。主要医学指征包括肿瘤性疾病、严重的子宫内膜异位症等妇科疾病、影响卵巢储备功能的全身性疾病，以及与早发性绝经相关的遗传性疾病。本文阐述了生育力保存治疗的完整临床与实验室工作流程，提出了基于客观证据的咨询建议。此外，本文重点讨论了该技术的有效性，并描述了如何在最短时间内充分挖掘并最大化获取可用卵母细胞的最优策略。文中详细说明了卵巢储备功能评估、理想促排卵方案的制定，以及取卵、去颗粒细胞和玻璃化冷冻等操作步骤，同时介绍了提高这些环节有效性、效率与安全性的具体方法。

本中心生育力保存项目的概述
在12年期间（2008–2020年），共有285名女性接受了至少一次卵母细胞采集，并对所获得的全部成熟卵子进行了玻璃化冷冻。其中大多数女性（n=250）仅接受了一次取卵，35名女性接受了多次取卵。进行卵子玻璃化冷冻的取卵原因被归纳为4类：医学原因（除癌症外）、癌症、非医学原因及其他原因。在250名仅接受一次卵子冷冻取卵的女性中，8%为非癌症相关的医学原因（10例子宫内膜异位症、3例子宫肌瘤、4例卵巢囊肿、1例输卵管积水），16%为癌症（31例乳腺癌、3例卵巢癌、2例结直肠癌、2例霍奇金淋巴瘤、1例外阴癌和1例宫颈癌），53%为非医学原因，23%为其他原因（43例因未获得精子、10例存在卵巢过度刺激综合征风险、4例感染及1例发热）。在接受多次卵子冷冻取卵的患者中，这一分布有所不同：9%为非癌症相关的医学原因（1例子宫内膜异位症、2例卵巢储备功能减退），6%为癌症（2例乳腺癌），80%为非医学原因，3%为其他原因（1例因未获得精子）。所有接受多次卵子冷冻取卵的患者均未解冻使用这些卵子，而250名仅接受一次卵子冷冻周期的女性中...

多个国际科学学会已将卵母细胞冷冻保存技术认定为青春期后女性生育力保存的金标准。恰当的临床与实验室策略可确保生育力保存治疗的最大有效性、效率和安全性。

保护女性生育力对于一个关注患者未来生活质量的多功能医疗保健系统至关重要。卵母细胞冷冻保存……

卵母细胞玻璃化冷冻及复温操作对于生育力保存至关重要。按照本方案进行操作，可使使用者最大程度地提高这些操作的有效性。目前，以卵母细胞玻璃化冷冻方式进行生育力保存已成为一种成熟且符合伦理的可接受方法。这有助于实现有效且一致的临床结果，并克服与胚胎冷冻保存相关的伦理和法律限制。为了熟练掌握玻璃化冷冻技术，必须熟悉方案中的所有关键步骤，尤其要注意样本在冷冻保护剂中的暴露时间。在取卵后38小时内，在去颗粒细胞后立即用患者姓名、ID和溶液类型标记所有塑料耗材，并请见证人核对冷冻装置上的患者信息。所有耗材标记完毕后，轻轻翻转卵母细胞小瓶数次以混匀，然后在培养皿中加入一滴30微升含人血清白蛋白的HEPES缓冲液，以及一滴相邻的30微升平衡液。使用剥卵移液器将卵母细胞放入第一滴液中，并在该液滴与另一30微升平衡液滴之间建立一段培养基桥，以实现冷冻保护剂浓度的逐步升高。三分钟后，在培养皿中再加入第二滴30微升平衡液，并用移液器在液滴之间形成培养基桥。在卵母细胞平衡的同时，将每个冷冻装置所需的一滴30微升平衡液加入培养皿中。三分钟后，将卵母细胞转移至纯平衡液中，孵育6至9分钟，使卵母细胞恢复至初始大小。当卵母细胞恢复后，准备一个中央凹陷的体外受精培养皿，其中含有1毫升玻璃化冷冻液。将卵母细胞转移至培养皿中，尽量减少携带的培养液，并轻轻移动以去除多余的平衡液。在孵育结束前约10秒，将标记有患者信息的冷冻载片置于显微镜下，并调节焦距至冷冻载片的尖端。将卵母细胞置于冷冻载片尖端旁，尽量使用最少的玻璃化冷冻液，并将移卵管移开，以去除多余的冷冻液，使卵母细胞表面仅覆盖一层薄薄的培养液。迅速将冷冻装置浸入液氮中，并快速晃动装置以去除其表面的任何气泡。用镊子夹住冷冻装置的保护帽，先将液氮注入帽中，然后在保持丙烯条处于液氮中的同时，将装置插入帽内。随后将冷冻装置存放在标有患者信息的冻存管中，并更新实验记录表。进行卵母细胞复温时，小心翻转已预热至室温的解冻液、稀释液和洗涤液小瓶，将1毫升解冻液加入培养皿的中央孔中，并在37摄氏度下孵育至少一小时。用患者的姓名、ID及溶液类型标记所有塑料耗材，并请见证人核对冷冻装置上的患者信息。对每个需要复温的装置，在六孔板的第一孔中加入200微升稀释液，并在第二和第三孔中各加入等体积的洗涤液。向孔外区域加入 PBS，以防止溶液蒸发。将解冻液的培养皿置于体视显微镜下，并调节焦距至培养皿中心。在保持丙烯条处于液氮中的同时，小心扭转以取下冷冻装置的保护帽，并尽快将冷冻装置从液氮转移至解冻液中，以避免发生脱玻璃化。一分钟后，聚焦于冷冻装置的尖端以定位卵母细胞，并可使用剥卵移液管轻轻将卵母细胞从装置上释放。使用直径为170微米的剥卵移液管，将卵母细胞及少量解冻液转移至六孔板第一孔中的稀释液中。三分钟后，将卵母细胞移入洗涤液的第一孔中，洗涤五分钟。孵育结束后，将卵母细胞转移至第二孔洗涤液中，在37摄氏度下孵育1分钟，然后将卵母细胞转入适量预平衡的体外受精（IVF）培养基中培养1小时，并更新实验室记录表。在12年期间，共有285名女性接受了至少一次取卵手术，每次手术均对所获得的全部成熟卵子进行玻璃化冷冻。其中大多数女性仅接受了一次取卵手术。35例患者接受了多次取卵。进行卵母细胞采集以实施卵子玻璃化冷冻的原因通常分为非癌症类医学原因、癌症、非医学原因及其他原因。因医学原因（非癌症）或因癌症进行生育力保存而接受卵子冷冻的患者，其年龄较轻，且窦卵泡计数高于因非医学原因或其他原因接受卵子冷冻的患者。然而，由于出于医学原因患者的平均成熟率略低，各组间平均冷冻的卵母细胞数量相似。大约一半非癌症医学原因的患者以及大多数其他原因进行卵子冷冻的患者实际上返回进行了解冻。相反，因癌症或非医学原因进行生育力保存的患者中，极少数人使用其冷冻的卵母细胞进行体外受精（IVF）。尽管玻璃化冷冻与复温之间的时间间隔存在差异，但各患者组的卵母细胞存活率相似，证实了卵母细胞玻璃化冷冻与复温方案的有效性和安全性。此外，存活率与执行玻璃化冷冻和复温操作人员的经验无关。其中最关键的、可能影响结果一致性的步骤与复温过程相关。因此，严格控制解冻溶液的体积和温度至关重要。卵巢组织冷冻保存是目前唯一正在研究中的、可用于青春期前患者的生育力保存策略。尽管该方法前景广阔，但仍存在重要局限性，限制了其临床应用。

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通过卵母细胞维他化保存生育能力:临床和实验室视角

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卵巢皮质组织玻璃化以实现聚集的玻璃态

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从接受辅助生殖技术治疗的个体中收集人卵泡液、卵泡体细胞及未成熟卵母细胞 体外 受精

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本文介绍了一种囊内旋切术（IRCP）的操作方案，这是一种改良的腹腔镜下囊内子宫肌瘤切除术，有助于保留生育功能。...

引入囊内旋转切割术（IRCP）：一种改良的保留生育功能子宫肌瘤切除术

了解卵母细胞玻璃化冷冻技术在生育力保存中的临床应用，掌握关键操作步骤与冷冻保护剂暴露时间控制。该方法可有效提高卵子存活率并确保治疗安全性与一致性。

通过卵母细胞玻璃化冷冻实现生育力保存：临床与实验室视角

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