分离高质量鼠心房和心室肌细胞，同时测量 Ca2+ 瞬变和 L 型钙电流

膜片钳和钙成像实验是劳动密集型、耗时且具有挑战性的。该方案提供了一种分离高质量小鼠心房和心室心肌细胞的便捷方法，适用于膜片钳实验和同时进行钙成像。该方案的主要优点是我们可以从同一只动物获得心房和心室心肌细胞。

小鼠心房心肌细胞的分离尤其具有挑战性，并且一直是以前实验的限制因素。首先用灌注缓冲液预填充 Langendorff 装置并确保其不含空气。在解剖显微镜下固定主动脉插管，并将其与装满灌注缓冲液的 1 毫升注射器连接。

从安乐死小鼠中取出心脏后，将心脏放入室温灌注缓冲液中，并在显微镜下尽快用钝头针插管主动脉。用一条缝合丝将心脏牢固地系在针头上，然后断开注射器。主动脉插管后，立即将插管的心脏连接到 Langendorff 装置，避免任何空气进入系统。

用灌注缓冲液在 37 摄氏度下灌注心脏 1 分钟，灌注速度为每分钟 4 毫升。从灌注切换到消化缓冲液，并在 37 摄氏度的温度下以每分钟 4 毫升的灌注速度灌注 9 分钟。完成后，将消化的心脏转移到具有足够消化缓冲液的培养皿中，以保持其完全覆盖。

然后在显微镜下仔细解剖心房和心室。将心房转移到含有 1.5 毫升消化缓冲液的培养皿中，将心室转移到另一个含有 3 毫升消化缓冲液的培养皿中。使用钝镊子小心但快速地将心房拉开成小块。

用 1000 微升移液器吸头小心地上下吹打以溶解组织，该吸头之前已被切割以加宽吸头开口。将溶液转移至 15 mL离心管中，沿管侧面移液，加入等量的终止缓冲液。将所有 3 毫升溶液穿过 200 微米的尼龙网，以去除剩余尚未完全消化的较大组织碎片。

要进行脑室清扫术，请使用解剖剪刀或镊子将心室组织切成小块，然后用另一个 1000 微升移液器吸头上下移液以溶解。将细胞和组织溶液转移到 15 mL离心管中，并小心地沿管侧面移液，加入等量的终止缓冲液以结束反应。将所有 6 毫升细胞和组织溶液穿过 200 微米的尼龙网，以去除尚未完全消化的较大碎片。

将心房细胞和心室细胞悬液在室温下放在工作台上 6 分钟以稳定。然后将试管以 5G 离心 2 分钟。使用塑料巴斯德移液管丢弃上清液，并小心地将细胞沉淀重悬于 10 毫升无钙 Tyrode 溶液中。

将心房和心室细胞放置 8 分钟，使其沉淀。将心房细胞以 5G 离心 1 分钟。然后丢弃两个细胞样品中的上清液，并小心地将沉淀重悬于 10 毫升含 100 微摩尔钙的 Tyrode 溶液中。

将细胞放置 8 分钟静置，然后重复心房细胞离心。弃去上清液，小心地将细胞沉淀重悬于 10 毫升含 400 微摩尔钙的 Tyrode 溶液中。再次重复此过程，将细胞重悬于 Tyrode 溶液中，加入 1 毫摩尔钙。

所有心房细胞都很小，细胞电容范围约为 35 至 100 皮法拉德。此处显示了来自心房工作心肌的典型细胞。心室肌细胞更呈棒状且更大，细胞电容范围为 100 至 400 皮法左右。

此处显示了来自一个心房肌细胞和一个心室肌细胞同时胞质钙瞬变的 L 型钙电流测量示例。在尝试这种技术之前，请务必练习器官摘取。快速执行该步骤并在正确的位置进行所有组织切割至关重要。

当器官摘取以可重复的质量进行时，请花一些时间来完善插管。用该方案分离的细胞适用于膜片钳测量。此外，它们还可以加载荧光染料，从而进行广泛的成像实验。