Name: 由加德纳菌阴道膀胱暴露在小鼠中引发的复发性大肠杆菌尿路感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解加德纳菌阴道暴露如何触发小鼠膀胱中大肠杆菌尿路感染复发的方法。该模型通过尿道接种和细菌分析，帮助研究者深入理解复发性尿路感染的机制并探索潜在治疗策略。

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作者感谢Lynne Foster在感染实验中的技术支持，感谢华盛顿大学细胞成像中心（WUCCI）的James Fitzpatrick提供扫描电镜（SEM）使用权限，感谢Scott Hultgren提供UTI89kanR&#160;UPEC菌株，以及感谢David Hunstad对稿件的审阅与宝贵意见。
本研究工作得到了美国国家科学基金会（VPO 的研究生研究奖学金 #DGE - 1143954）、华盛顿大学医学院女性传染病研究中心（NMG 的试点研究奖）、美国心脏协会（#12POST12050583，NMG；#14POST20020011，NMG）以及美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID：R01 AI114635，ALL）和国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK：R21 DK092586，ALL；P50 DK064540-11，SJH，项目 II 负责人：ALL；K01 DK110225-01A1，NMG）的资助。部分动物实验在获得 NCRR 资助（C06 RR015502）的设施中完成。华盛顿大学细胞成像中心（WUCCI，扫描电子显微镜实验在此进行）及 MSJ 得到了华盛顿大学医学院、华盛顿大学与圣路易斯儿童医院儿童发现研究所（CDI-CORE-2015-505）、Barnes-Jewish 医院基金会（3770）以及国家神经疾病和中风研究所（NS086741）的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。

作者声明他们与本研究无任何利益冲突。

在此模型中，第一个关键步骤是鉴定在初次尿路感染（UTI）阶段未能清除UPEC菌尿的小鼠。这些小鼠必须从实验中剔除，否则会干扰后续暴露于G. vaginalis后UPEC菌尿发生率的评估。在初次接种UPEC后，应每周采集尿液以监测细菌清除情况。约65–80%的C57BL/6小鼠可在4周内清除UTI89kanR感染。其他近交系小鼠对UPEC的清除能力及储菌库形成倾向各不相同42,43，因此可能不适用于本模型。第二个关键点是，已有实证研究表明，需进行两次连续的G. vaginalis接种（间隔12小时或1周），才能诱导出显著高于对照组（仅暴露于PBS）背景自发储菌库形成的储菌库。两次接种之间的其他时间间隔尚未经过测试，但可能产生类似结果。需要注意的是，仅在两次G. vaginalis暴露间隔1周的模型中观察到UPEC膀胱滴度的降低39。虽然可给予超过两次的暴露，但实验证据表明，仅重复导管插入操作本身就会增加储菌库的形成，这可能干扰结果解读，或需要增加动物数量以区分暴露组与对照组之间的差异。最后，原位&#160;膀胱固定方法包含多个关键步骤。操作者需具备一定技能，以确保固定液保留在夹闭的膀胱内。膀胱塌陷将增加扫描电镜（SEM）成像的难度。向膀胱内注入固定液时必须格外轻柔，因为携带固定液的导管刮擦尿路上皮可能独立于G. vaginalis诱导的效应而引发尿路上皮脱落。固定液混合物中提及的所有浓度均为终浓度。若配比不当，可能导致固定不足，或细胞发生肿胀或收缩。固定液应预热至生理温度，以避免细胞和组织受到温度冲击。预热还可略微提高固定剂穿过质膜的扩散速率。尽管在用于扫描电镜分析的样品制备中，常可省略锇染色步骤，但在此方案中该步骤至关重要，用于稳定脂质并防止在临界点干燥过程中细胞膜开裂。
本方案可进行修改，以检测其他尿路致病性大肠杆菌（UPEC）和/或阴道加德纳菌（G. vaginalis）菌株形成储库的能力，以及触发其重新出现的能力。也可添加其他实验因素，例如暴露于其他阴道细菌（如卷曲乳杆菌 Lactobacillus crispatus PVAS100）或热灭活的 G. vaginalis，这两种处理在此模型中均不引起病理变化39。在选择其他待测细菌菌株时，重要的是要证明其生长具有一致性，以便在所有实验中使用标准化的接种浓度。JCP8151BSmR 的培养已在厌氧培养箱中优化。该菌株也可能在厌氧 GasPak 系统中培养，但需进行条件优化以确保细菌生长旺盛。最后，可能可以调整模型中某些步骤的时间安排。例如，可在 UPEC 储库形成阶段的早期时间点收集尿液，以监测菌落形成单位（CFU）或宿主反应。在此模型中，尚未观察到在早期时间点（感染后3、6、12小时）采集尿液样本对感染进展或储库建立产生不利影响。已有报道显示，给予两剂 JCP8151BSmR（间隔12小时或1周）后可诱导 UPEC 储库的重新出现，但其他时间间隔尚未测试。此外，可能还可以通过将 UPEC 储库形成阶段缩短至2周（而非4周）来减少整个实验周期，因为许多小鼠在此时已清除菌尿。先前研究在探讨化学剥脱剂处理膀胱后 UPEC 重新出现的情况时，采用了1周或2周的 UPEC 储库形成期17,18。然而，缩短 UPEC 菌尿清除时间可能导致需要更多动物被处死以满足实验要求。最后，可增加膀胱扫描电镜（SEM）分析的时间点，以观察 G. vaginalis 对尿路上皮作用持续的时间。
关于故障排除，在膀胱扫描电镜（SEM）分析中有一些特别需要注意的事项。根据所使用的小鼠品系及炎症程度的不同，某些膀胱的壁可能非常薄。这类膀胱在临界点干燥过程中更容易发生卷曲，形成类似宝螺的形状。若出现这种情况，最佳处理方法是沿卷曲界面将呈壳状的膀胱纵向切开成两半，然后再进行第二次切割，以去除大部分悬垂的组织。使用聚四氟乙烯（PTFE）涂层的双刃剃须刀片进行切割效果最佳。在锇酸染色步骤中，过量脂肪有时会溶解，可能导致产生不溶性脂肪滴，这些脂肪滴在后续的清洗和脱水步骤中难以去除，并可能在干燥过程中沉积于膀胱表面。这些脂肪滴在样品表面呈分散分布的小球状或盘状结构（图4D）。为减少此类问题，应在取材时尽可能彻底清除膀胱周围的脂肪组织。在镀膜时可用铂替代铱，但镀层厚度应尽可能薄，以避免掩盖精细的结构细节。强烈建议在镀膜过程中使用旋转样品台。
该模型的一个局限性在于需要使用大量小鼠。仅有65%-80%的C57BL/6小鼠能够清除其UPEC菌尿，从而适合后续的G. vaginalis或PBS接种（见图2C）。为了获得每组10-12只小鼠（G. vaginalis接种组与PBS对照组），最初应使用约30只小鼠进行UPEC感染。此外，通常需要进行多次实验，以获得检测统计学显著性所需的生物学重复数。当两次处理间隔1周时，在PBS处理组中，有14%的小鼠出现UPEC复发（图3B）。因此，若要以0.8的检验效能（alpha=0.05，单侧检验）检测到G. vaginalis暴露组相对于PBS对照组UPEC复发性尿路感染（rUTI）的显著增加，每种处理组至少需要累计测试40只小鼠。另一个需考虑的问题是，这些实验成本较高且劳动密集。必须每周监测小鼠是否清除了UPEC，而整个实验周期为4-5周，具体时长取决于G. vaginalis是间隔12小时给予两次，还是间隔1周给予两次。扫描电镜（SEM）操作较为耗时，且成本可能较高，具体取决于显微镜的可用性及服务费用。将整个膀胱用于SEM制样可提供充足的分析材料，但缺点是每只膀胱的分析过程可能非常耗时。因此，与用于尿液和组织滴度检测的较大小鼠数量相比，能够用于SEM分析的膀胱数量可能有限。此外，由于阴影可能影响可视性，要获得膀胱曲面结构——即&#34;杯状结构&#34;——的高质量图像需要较高的技术熟练度。尽管膀胱SEM是观察尿路上皮脱落的有用工具，但该方法主要是定性的。由于样品被固定为圆形结构，并且固定液中含有戊二醛，因此无法通过光学显微镜检测荧光表达的细菌。此外，由于戊二醛会导致大多数抗原发生交联，而锇酸会遮蔽抗原位点并使组织变暗，免疫染色和化学染料在此过程中均不适用。尽管如此，SEM技术仍可用于无需额外探针即可定量评估的参数，例如细胞大小48,49。
该模型相较于先前描述的方法具有多项优势。它能够研究由膀胱储存库中细菌重新激活所导致的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）复发性尿路感染（rUTI）的机制，而非来自膀胱外源性再感染。其他因膀胱储存库释放细菌所致rUTI的模型通常使用化学试剂（如鱼精蛋白硫酸盐或壳聚糖）诱导尿路上皮脱落17,18，而这些化学物质在女性中并非rUTI的自然诱因。G. vaginalis 是一种常见的泌尿生殖道细菌，在部分女性通过导尿或耻骨上穿刺直接采集的膀胱尿液中已被检测到23,26。这一事实，结合已知的细菌性阴道病（BV，其特征为阴道内 G. vaginalis 过度增殖）与尿路感染之间的关联，提示 G. vaginalis 是临床上可能引发rUTI的诱因。最后，原位&#160;膀胱固定法可有效保存膀胱的超微结构并减少损伤，确保膀胱各层组织不发生分离。传统的尿路上皮可视化方法通常要求操作者无菌取出膀胱，将其切开、拉伸并固定在解剖托盘上，然后将拉伸后的膀胱浸入固定液中48。该方法虽可获得非常平坦的样本，但无法保证组织被均匀或自然地拉伸，容易导致局部过度或不足拉伸（造成组织严重皱褶），并可能引起膀胱层间分离。此外，对膀胱进行拉伸和固定等物理操作本身也可能造成损伤，包括尿路上皮脱落。另一种方法是将完整的膀胱直接浸入固定液，随后包埋于石蜡中，并使用切片机获取薄切片。薄切片对于免疫组织化学实验以检测细菌和宿主蛋白定位极为重要，但无法用于观察尿路上皮表面结构。而本&#160;扫描电镜（SEM）方法可实现对整个膀胱表面的一次性全面观察。
如上所述，该模型的未来应用包括测试其他尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株，以确定它们是否形成细胞内储存库，并测试&#160;其他 G. vaginalis 菌株，以评估它们是否引发上皮细胞脱落及UPEC释放，从而导致复发性尿路感染（rUTI）。也可测试除C57BL/6小鼠以外的其他小鼠品系，但不建议使用易于发展为慢性膀胱炎的小鼠（例如C3H背景的小鼠），因为这将导致实验中需要淘汰过多小鼠。C57BL/6小鼠的另一优势在于，目前市面上可获得多种基因敲除品系，这些品系为研究宿主因素在储存库形成和/或病原体释放过程中的作用提供了良好机会。

尿路感染（UTI）在全球范围内造成了沉重的医疗负担，每年影响数百万人的生活质量，尤其是女性1。尿路致病性大肠杆菌（Escherichia coli，UPEC）是导致尿路感染最常见的病因1。尽管通过抗生素清除了初次感染，仍有大量患者（约20–30%）在6个月内会经历复发性尿路感染（rUTI）2。不幸的是，多达5%的绝经前女性每年会经历3次或以上的rUTI3,4。rUTI的连续发作可能由初次感染中同一UPEC菌株的持续存在所引起5,6,7,8。来自人体样本和小鼠模型的研究数据表明，同菌株rUTI可能是由于UPEC存在于膀胱内的静息储存库中所致。在人类中，已在尿路感染患者的上皮细胞和膀胱活检组织中检测到UPEC9,10,11,12,13。在C57BL/6小鼠中的研究表明，某些UPEC菌株可在膀胱内建立静息的胞内储存库，通过荧光显微镜观察以及膀胱组织匀浆培养可检测到这些储存库，并可在菌尿症消退后持续数月14,15,16。使用可诱导膀胱上皮（尿路上皮）脱落的试剂（如硫酸鱼精蛋白17或壳聚糖18）处理膀胱，可触发UPEC从储存库中释放，从而引发rUTI。这些数据提示，在既往感染后膀胱内存有UPEC储存库的女性中，任何导致尿路上皮脱落的膀胱刺激因素均可能诱发rUTI。
越来越多的证据表明，阴道微生物群在尿路感染中起着重要作用19,20。Gardnerella vaginalis 是阴道和尿道微生物群中常见的成员之一21,22,23,24,25,26,27,28,29。在阴道中，高水平的 G. vaginalis 与一种称为细菌性阴道病（bacterial vaginosis, BV）的微生物失调相关，约影响30%的女性30,31,32。与阴道菌群以乳杆菌属（Lactobacillus）为主的女性相比，患有BV的女性发生尿路感染（UTI）的风险更高33,34,35,36,37。在小鼠模型中，G. vaginalis 可导致阴道38 和膀胱39 的上皮细胞脱落。在携带尿道致病性大肠杆菌（UPEC）膀胱储库的C57BL/6小鼠中，连续两次膀胱暴露于 G. vaginalis（而非PBS）可导致UPEC从储库中重新释放，引发UPEC反复性尿路感染（rUTI）。这一现象表现为：先前已清除UPEC菌尿的小鼠尿液中再次出现UPEC滴度，且在处死时其膀胱匀浆中的UPEC滴度较PBS暴露的对照组动物显著降低39。有趣的是，G. vaginalis 并未在膀胱中长期定植。在绝大多数情况下，仅需两次短暂暴露，每次尿液中可存活的 G. vaginalis 不足12小时（h），就足以诱发尿路上皮细胞脱落并促进rUTI的发生。
本方案描述了一种由定植于膀胱细胞内储存库中的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）引发的复发性尿路感染（rUTI）小鼠模型，通过阴道加德纳菌（G. vaginalis）膀胱接种以诱导感染复发。该模型的创新之处在于，与先前使用的化学诱导剂相比，G. vaginalis 是一种具有临床相关性的生物学触发因素。此外，G. vaginalis 在小鼠泌尿道中存活时间相对较短，使得研究人员能够探究短暂微生物暴露对尿路上皮的影响，类似于性行为后可能发生的情况。除了阐述rUTI模型的建立方法外，本方案还介绍了尿液细胞学检测，以及通过扫描电子显微镜（SEM）对膀胱进行原位固定和尿路上皮成像的技术方法。
本实验方案采用携带卡那霉素抗性盒的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株UTI89（UTI89kanR）建立由G. vaginalis诱导的复发性尿路感染（rUTI）模型40。并非所有测试的UPEC菌株均能在小鼠急性感染阶段形成胞内细菌群落41，目前尚不清楚所有UPEC菌株是否均具备形成潜伏性胞内储存库的能力。在将其他UPEC菌株用于该模型前，应先验证其是否能够形成储存库。本方案使用一株自发产生链霉素抗性的G. vaginalis分离株JCP8151BSmR38。JCP8151BSmR诱导rUTI需要两次连续接种G. vaginalis，间隔时间为12小时或7天39。其他G. vaginalis菌株是否也能诱导尿路上皮脱落和/或UPEC rUTI，仍有待通过该模型进一步验证。必须使用已知抗生素抗性的UPEC和G. vaginalis菌株（例如UPEC对卡那霉素或壮观霉素耐药，G. vaginalis对链霉素耐药），因为在琼脂平板中添加相应抗生素可抑制小鼠内源性微生物群的生长，避免其干扰菌落形成单位（CFU）的计数，从而准确监测感染情况。这一点在培养尿液样本时尤为重要，因为小鼠尿液中常含有其他细菌，若无抗生素存在，这些细菌可能在培养平板上过度生长。这些内源性细菌的来源尚不明确，但很可能是在尿液采集过程中沾染的尿道周围及泌尿生殖道细菌。
G. vaginalis 是一种兼性厌氧细菌，因此本实验方案描述了在厌氧培养箱中培养 G. vaginalis JCP8151BSmR 的方法。若无厌氧培养箱，也可采用其他维持厌氧生长条件的方法（例如在密闭容器中使用 GasPak 厌氧袋）。此外，某些 G. vaginalis 菌株（包括 JCP8151BSmR）可在标准组织培养孵箱（5% CO2）中生长。与使用 JCP8151BSmR 以外的 G. vaginalis 菌株时需进行测试以确保细菌在该模型中表现一致类似，改变培养条件时也需通过实验确定培养时间（平板和液体培养）以及光密度（OD）600 的最佳值，以获得所需的活菌接种浓度。此外，目前尚不清楚培养条件是否会影响 G. vaginalis 的致病生物学特性。
最后，在考虑是否采用此模型时，研究人员应注意，该模型每组所需的动物数量可能多于典型的尿路感染小鼠模型。部分原因是，为诱导复发性尿路感染（rUTI），需确保小鼠能够清除由初始膀胱感染引起的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌尿。因此，任何未能清除菌尿的小鼠（该表型通常提示存在持续性肾脏感染）将不被纳入实验的rUTI阶段。所需小鼠数量还受到以下因素影响： &#34;自发的&#34; 尿液中UPEC的出现（平均占12-14%）。最后，不同小鼠品系在形成慢性菌尿与胞内储存库的倾向性方面存在差异。42,43若在此模型中使用除 C57BL/6 以外的小鼠品系，必须确认动物能够形成静息状态的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）胞内储存库。

<table><tbody><tr><td>30G × 1/2 针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td>用于导管</td></tr><tr><td>5 1/2&quot; 直型止血钳</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; 膀胱固定</td></tr><tr><td>ACE 600 溅射镀膜仪</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>铝制 SEM 样品台</td><td>Ted Pella</td><td>16111</td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; 膀胱固定</td></tr><tr><td>导电碳胶粘接片&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>导电银漆</td><td>Ted Pella</td><td>16034</td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>CPD 300 临界点干燥仪</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>Cytofunnel 金属夹</td><td>Simport</td><td>M964B</td><td>尿液细胞离心分析</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>用于 NYCIII &lt;em&gt;G. vaginalis&lt;/em&gt; 培养基</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; 膀胱固定</td></tr><tr><td>Hema 3 染色试剂盒</td><td>Fisher</td><td>23123869</td><td>尿液细胞离心分析</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>25-060-Cl</td><td>用于 NYCIII &lt;em&gt;G. vaginalis&lt;/em&gt; 培养基</td></tr><tr><td>铱</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td></td><td></td><td>小鼠麻醉</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>添加至 UPEC LB 选择性平板（50 µg/mL）</td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>UPEC 生长平板</td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>UPEC 生长培养基</td></tr><tr><td>Merlin 场发射扫描电镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>扫描电子显微镜</td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>用于 NYCIII &lt;em&gt;G. vaginalis&lt;/em&gt; 培养基</td></tr><tr><td>Olympus Vanox AHBT3 显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>尿液细胞离心分析</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>SEM 样品处理</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; 膀胱固定</td></tr><tr><td>聚乙烯导管</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td>用于导管</td></tr><tr><td>蛋白胨 #3&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>DF-122-17-4</td><td>用于 NYCIII &lt;em&gt;G. vaginalis&lt;/em&gt; 培养基</td></tr><tr><td>PTFE 涂层双刃剃刀片</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>用于 SEM 膀胱组织切片</td></tr><tr><td>Shandon 细胞离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300002</td><td>尿液细胞离心分析</td></tr><tr><td>Shandon Cytofunnel 滤膜</td><td>Simport</td><td>M965FWDV</td><td>尿液细胞离心分析</td></tr><tr><td>Shandon 双孔 Cytofunnel</td><td>Simport</td><td>M964-1D</td><td>尿液细胞离心分析</td></tr><tr><td>Shandon 双孔细胞涂片（涂层）</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>尿液细胞离心分析</td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>&lt;em&gt;in situ &lt;/em&gt;膀胱固定</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td><td>测定细菌 OD600</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>添加至 &lt;em&gt;G. vaginalis&lt;/em&gt; NYCIII 选择性平板（1 mg/mL）</td></tr><tr><td>结核菌素滑动针头注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td>用于导管</td></tr><tr><td>酵母提取物&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>用于 NYCIII &lt;em&gt;G. vaginalis&lt;/em&gt; 培养基</td></tr></tbody></table>

复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

由尿路致病性大肠杆菌引起的复发性尿路感染（rUTI） 大肠杆菌 尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染常见且治疗成本高。既往研究已描述了在雄性和雌性小鼠中建立尿路感染（UTI）模型的方法，包括细菌接种以及尿液和组织中细菌的定量检测。在C57BL/6小鼠初次膀胱感染期间，UPEC可在膀胱上皮细胞内建立潜伏性储存库，即使菌尿被清除后，这些储存库仍可持续存在。本模型在上述研究基础上，进一步探讨由潜伏性膀胱储存库中UPEC重新激活所导致的复发性尿路感染（rUTI）。该泌尿生殖道细菌 Gardnerella vaginalis 在该模型中，使用该菌作为rUTI的诱因，因为它常存在于女性泌尿生殖道中，尤其是在与尿路感染相关的阴道菌群失调背景下。此外，本文还描述了一种原位膀胱固定后接膀胱组织扫描电镜（SEM）分析的方法，该方法可能适用于其他涉及膀胱的研究。

接种后，可在尿液中检测到尿路致病性大肠杆菌（UPEC）滴度（图2B）。若未将尿液样本接种至含有卡那霉素的选择性培养基上，内源性小鼠尿液微生物群可能过度生长，从而污染样本。UPEC菌尿水平在第1天通常较高，并可能在第一周内升高，随后在后期时间点下降（图2C）。约65%-80%的小鼠在感染后28天（dpi）时尿液中已无法检测到UPEC（图2C，绿色圆圈）。这些小鼠可用于模型的后续步骤。仍持续出现菌尿的小鼠（图2C，红色椭圆）应从实验中剔除。
两次连续的 G. vaginalis 暴露间隔 12 小时（图 3A）或 1 周（图 3B）可导致胞内储存库中的 UPEC 释放，从而引发反复性菌尿。与 PBS 对照组相比，暴露于 G. vaginalis 的小鼠其 UPEC 菌尿水平（Mann-Whitney 检验）以及表现出 UPEC 复发性尿路感染（rUTI）的小鼠比例（Fisher 精确检验）均显著升高。尿液细胞学分析在表现出 UPEC 释放的 G. vaginalis 暴露小鼠尿液中检测到中性粒细胞（PMNs）（图 3C）。在两次暴露间隔为 1 周的模型中，与 PBS 组相比，G. vaginalis 暴露小鼠膀胱组织中的 UPEC 滴度较低（图 3D），这可能是由于 UPEC 从储存库中释放后被清除所致。
通过扫描电镜观察原位固定的膀胱组织，显示经PBS处理的对照组小鼠膀胱表面由大量表层伞状尿路上皮细胞覆盖图4A）。尿路上皮脱落表现为表层伞状细胞丢失，揭示出暴露于相应处理的小鼠体内更深层的较小移行上皮细胞 G. vaginalis (图4B）。在UPEC接种后早期、胞内存活库形成初期，可在尿路上皮上观察到UPEC，并可见其从脱落细胞中伸出丝状结构（图4C).

<img alt="细菌生长测定：琼脂平板上的菌落形成、稀释系列、小鼠感染时间线、数据图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2。I期（储库形成期）期间尿液中UPEC滴度的监测。 （A）菌落形成单位（CFU）涂布实验示意图。（B）LB+卡那霉素培养基上尿液样本中UPEC滴度的代表性图像。黑色圆圈标示应计数的尿液样本点，用于计算CFU/mL。（C）C57BL/6小鼠尿液中UPEC菌尿的时间进程。每条线代表一只单独的小鼠，追踪其尿液中UPEC滴度随时间的变化。虚线表示检测下限（1000 CFU/mL）。红色椭圆标示出20只小鼠中的4只未能清除UPEC菌尿，因此不适用于G. vaginalis诱导的复发性尿路感染模型。相反，绿色圆圈标示出已清除UPEC菌尿并进入后续实验阶段的小鼠。（D）用于生成C图所示曲线的数据表格。黄色表示可检测到CFU；绿色表示未检测到CFU。（E）根据尿液中UPEC CFU不再被检测到的时间点（“清除日”），将小鼠随机分配至不同暴露组。D图左侧列中的小鼠编号与E图中所列编号一致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="UPEC 定量，Mann-Whitney 分析；图表与显微图像；膀胱感染研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3．G. vaginalis 诱发 UPEC 反复性尿路感染（rUTI）。在两次间隔 12 小时（A）或 1 周（B）的尿路暴露于 PBS（圆形）或 G. vaginalis （Gvag；方形）后，尿液中 UPEC 的滴度。每个符号代表一只独立的小鼠。绘制的是第二次暴露后 1–3 天内每只小鼠检测到的最高 CFU/mL UPEC 值。未检测到菌尿的小鼠数据绘制在检测限处（虚线）。 （C）尿液细胞学分析，显示 UPEC（箭头）和多形核（PMN）细胞（箭头）。比例尺 = 20 μm。（D）在两次间隔 1 周的尿路暴露后第 3 天采集的膀胱组织中的 UPEC 滴度。每个符号代表一只不同的小鼠，零值绘制在检测限处（虚线）。在 A、B 和 D 中，方框表示第一和第三四分位数，中位数以线标记，须线从最小值延伸至最大值。Mann-Whitney U 检验 * P &lt; 0.05；** P &lt; 0.01；**** P &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="植物表面结构的扫描电镜观察；细胞模式的显微图像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4．原位固定的膀胱组织扫描电镜分析。 膀胱组织取自经两次PBS（A）或 G. vaginalis（C）暴露（间隔12小时）后3小时的小鼠。虚线标示单个尿路上皮细胞，G. vaginalis 暴露组膀胱中细胞更小，原因是表层的大细胞已脱落，暴露出下方的移行上皮。 （B）在模型第一阶段，初始接种UPEC后6小时采集的膀胱组织，显示尿路上皮脱落及细胞外UPEC。 （D）膀胱表面存在的不溶性脂肪滴示例。主图比例尺为20 μm，插图为2 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

一种尿路致病性小鼠模型 E. coli (UPEC) 经尿道接种以建立潜伏性胞内膀胱储存库及随后的膀胱暴露于 G. vaginalis 展示了诱导复发性尿路致病性大肠杆菌（UPEC）尿路感染的方法。同时展示了细菌计数、尿液细胞学检查，以及用于扫描电子显微镜观察的膀胱原位固定与处理步骤。

复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术

由尿路致病性大肠杆菌（UPEC）引起的复发性尿路感染（rUTI）十分常见且治疗成本高昂。以往描述相关模型的研究文章……

复发性尿路感染是一个严重的健康问题。本方案将帮助我们理解泌尿生殖道细菌的短暂暴露如何导致膀胱损伤并引发大肠杆菌复发性尿路感染。该模型的一个优势在于，膀胱脱落和复发性尿路感染是由泌尿生殖道细菌加德纳菌（Gardnerella vaginalis）触发的，这种细菌在经历复发性尿路感染的女性中通常大量存在。首先将阴道加德纳菌菌株从-80°C冰箱冻存管中取出，转移至厌氧培养箱中进行复苏。将细菌划线接种于不含抗生素的NYCIII平板上。在37°C厌氧条件下培养24小时。在厌氧工作站中，用接种环取一微升NYCIII平板上的菌体，接种于5毫升厌氧NYCIII培养基中，在37摄氏度厌氧条件下静置培养18小时。培养基中不添加抗生素。使用分光光度计测定菌液在600 nm处的光密度（OD600）。然后在9,600 × g条件下离心1分钟，并吸除上清液。用PBS将细菌沉淀重悬至所需浓度，进行系列稀释后涂布接种物。在带有滤膜的细胞滤筛盒中，将10微升尿液加入90微升PBS中。将样本盒放入细胞离心机中，配以载玻片，在高加速度条件下以600至800 ×g离心6分钟。取出载玻片后室温静置过夜使其干燥，随后使用血液学染色试剂盒对载玻片进行染色，并通过光学显微镜观察中性粒细胞（PMNs）和上皮细胞的存在情况。取一支带有固定液的结核菌素侧孔注射器，将导管连接至其末端，确保斜面朝向与注射器刻度相反的方向。从针头末端剪去一到两毫米的多余导管，注意不要暴露针尖。轻弹注射器以去除气泡，并推动推杆排出空气。然后在微型离心管上方用固定液充满导管。在麻醉并处死小鼠后，待四肢固定，用镊子和手术剪剪开小鼠的盆腔区域，暴露膀胱。小心地将周围的脂肪组织推开，但保留膀胱原位。用惯用手握住注射器，使针头朝下。将导管尖端浸入无菌润滑剂中，并将导管尖端置于尿道开口处，同时将注射器筒身倾斜，与小鼠身体呈30至45度角。用轻微的顺时针动作向下施加压力，轻柔地将导管插入尿道。当导管尖端进入尿道后，在继续将导管进一步推入尿道的同时，将注射器向小鼠尾部方向转动，直至注射器筒体与操作台面平行。整个导管针轴应完全进入小鼠体内，使导管尖端位于膀胱腔内。缓慢注入50至80 µL固定液，使膀胱像气球一样膨胀。 保持导管位置不变，并将注射器略微上抬，使针尖向上倾斜。用另一只手打开止血钳，将其中一个钳臂从尿道交叉处插入导管针下方。部分闭合止血钳，直至其刚好与针头接触。轻轻将导管针从膀胱中抽出，同时完全夹紧并锁定止血钳，以防止固定剂流失。握住止血钳，使其与工作台面平行，膀胱置于其上方。轻柔抬起，小心地在止血钳下方剪切，将膀胱连同仍附着的止血钳一并取下。将膀胱及附带的止血钳放入含有预热固定液的 Falcon 管中。确保膀胱完全浸没在液体中，且未紧贴管壁。为了通过扫描电镜成像，需使用洁净的双面剃须刀片或手术刀沿矢状面将膀胱切开，并在止血钳附近做第二个切口，使其与止血钳相切，以释放膀胱。这将得到两个半膀胱杯。如果膀胱外部仍存在任何残留的脂肪垫，请轻轻将其去除。用二甲胂酸钠缓冲液将膀胱的两半部分清洗三次。将组织在室温下用1%四氧化锇的0.15摩尔卡可基酸盐缓冲液染色一小时。此步骤需用铝箔包裹染色容器，以保持避光环境。染色后，用超纯水冲洗膀胱半片三次。如果在水表面看到经锇酸处理的油状物，应吸除或用灯芯吸干，以防止在干燥步骤中造成污染。组织脱水后，使用干净的双面刀片将膀胱半片各切成两半，共得到四块组织。接种后，可在尿液中检测到尿路致病性大肠杆菌（UPEC）滴度。小鼠接种后第一天UPEC菌尿水平较高，可能在第一周内进一步升高，随后在后期时间点逐渐下降。大约65%至80%的小鼠在接种后28天时尿液中已检测不到UPEC。这些小鼠可用于模型的后续实验步骤。应将仍存在菌尿的小鼠从实验中剔除。间隔12小时或一周的两次连续加德纳菌（G.vaginalis）暴露可导致尿路致病性大肠杆菌（UPEC）从细胞内储存库中释放，引发复发性菌尿。可通过尿液细胞学分析检测经加德纳菌（G.vaginalis）暴露后出现UPEC释放的小鼠尿液中的多形核细胞。在间隔一周给予两次暴露的模型中，与PBS组相比，经G.vaginalis暴露的小鼠膀胱组织中的UPEC滴度较低，这可能是由于UPEC从储存库中释放并随后被清除所致。通过扫描电镜（SEM）对原位固定的膀胱组织进行可视化观察，显示仅暴露于PBS的对照组小鼠膀胱表面由大而表浅的伞状尿路上皮细胞构成。在G.vaginalis暴露的小鼠中，表浅伞状细胞的缺失导致下方较小的移行上皮暴露，表明发生了尿路上皮脱落。在UPEC接种后的早期阶段，即胞内储存库建立期间，可在尿路上皮上观察到细菌细胞，并从脱落的细胞中伸出丝状结构。本文所述方法为未来研究其他加德纳菌菌株或其他泌尿生殖道物种对大肠杆菌复发性尿路感染（rUTI）的影响奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

由加德纳菌阴道膀胱暴露在小鼠中引发的复发性大肠杆菌尿路感染

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经尿道诱导小鼠尿路感染

来源：O'Brien, V. P., 等，小鼠膀胱暴露于Gardnerella vaginalis诱发反复性大肠杆菌尿路感染。J. Vis. Exp.

小鼠膀胱组织样本制备以可视化细菌感染

来源：O'Brien, V.P. 等 复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术 J. Vis. Exp. (2020)本视频演示了制备一种 Gardnerella vaginalis...

制备用于建立小鼠复发性尿路感染模型的Gardnerella vaginalis接种物

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建立尿路感染模型：一种向小鼠施用尿路致病菌以建立尿路感染模型的技术

关键词：尿路感染，尿路致病性大肠杆菌，动物模型，小鼠，膀胱感染，肾盂肾炎，UTI模型，细菌感染，泌尿系统，实验方法

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小型动物模型中的尿路感染：雄性和雌性小鼠的经尿道导管插入术

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了解加德纳菌阴道暴露如何触发小鼠膀胱中大肠杆菌尿路感染复发的方法。该模型通过尿道接种和细菌分析，帮助研究者深入理解复发性尿路感染的机制并探索潜在治疗策略。

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