Name: 酶的结晶和结构确定:多功能微流体芯片中串行晶体学的基板复合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解使用ChipX微流控芯片进行酶结晶和原位X射线衍射分析的方法。该技术通过反扩散法生长高质量晶体，无需低温冷却，可在室温下直接进行串行晶体学研究，适用于Planococcus halocryophilus等多种生物分子的结构生物学研究。

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作者感谢瑞士光源（瑞士维利根）为本项目在X10SA（PXII）和X06DA（PXIII）光束线上分配的机时，感谢Alexandra Bluhm在结构精修方面的贡献，Clarissa Worsdale参与配音录制，以及François Schnell（斯特拉斯堡大学）在视频剪辑和音效方面的协助。本工作得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、斯特拉斯堡大学、LabEx联盟&#34;NetRNA&#34;（ANR-10-LABX-0036_NETRNA）、斯特拉斯堡大学卓越计划（IdEx）框架下法国国家“未来投资”计划（&#34;Investissements d'Avenir&#34;）为R.dW提供的博士生资助、法德大学（UFA-DFH，项目编号CT-30-19）为K.R.提供的博士生资助，以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号Mo 634/10-1）的资助。作者还受益于PROCOPE Hubert Curien合作项目（法国外交部与德国学术交流中心共同支持）。

1. 在 ChipX 中设置结晶实验
注意：ChipX 微流控装置可向作者索取。芯片的描述见图1。用于引发结晶的含结晶剂（或结晶诱导剂）溶液可为商用来源，也可由实验人员自行配制。
<ol>
	<li>加载生物分子样品 
	&#8203;注意：在ChipX每个通道的直段部分进行单个对流扩散实验实际所需的样品体积为300 nL。但为方便操作，建议加载5 µL，以完全填充八个通道，同时考虑其弯曲段长度和进样口死体积的差异。
	<ol>
		<li>使用标准10 µL移液器和吸头吸取5 µL酶溶液。</li>
		<li>将吸头垂直插入样品进样口，并注入溶液，直至八个通道均被充满至另一端（结晶剂储液池入口）。</li>
		<li>在样品进样口注入1 µL石蜡油，以使各通道相互隔离。</li>
		<li>使用标准10 µL移液器，从每个通道末端的结晶剂储液池中回收多余的溶液。</li>
		<li>用一块1 cm × 1 cm的封口膜密封样品进样口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载结晶溶液
	<ol>
		<li>使用标准10 µL移液器和吸头吸取5 µL结晶溶液。储液池体积为10 µL，但仅加载一半体积可避免用封口膜密封时发生溢出，并便于后续浸泡实验中添加配体。若初始结晶条件是通过气相扩散法获得的，则应将结晶剂浓度提高1.5–2倍。每个储液池中的溶液可以不同（在本示例中，全程使用1 M磷酸氢二铵、100 mM醋酸钠，pH 4.5）。</li>
		<li>将移液器吸头朝向储液池漏斗形区域的通道入口处，以避免加样时产生气泡。气泡会阻碍两种溶液之间的接触，并影响结晶剂向通道内的扩散。</li>
		<li>将结晶剂溶液注入储液池中。</li>
		<li>用一块2.5 cm × 1 cm的封口膜密封储液池。</li>
		<li>将芯片在20 °C下孵育（温度可根据目标分子调整，通常在4至37 °C之间4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于荧光检测的羧基罗丹明蛋白标记
注意：此步骤为可选步骤。必须在上样前完成，以利于通过荧光检测芯片中的晶体。微量荧光标记的详细方法由 Pusey 及其同事7描述。所有步骤均在室温下进行。
<ol>
	<li>将5 mg羧基罗丹明酯粉末溶于1 mL无水二甲基甲酰胺中，分装成每份0.6 µL，于-20 °C保存。</li>
	<li>配制1 M、pH 8.75的硼酸钠储备液。</li>
	<li>将上述储备液稀释，配制成0.05 M、pH 8.75的反应缓冲液。</li>
	<li>用800 µL反应缓冲液冲洗脱盐柱（分子量截留值7 kDa，体积0.5 mL）。</li>
	<li>以1400 × g离心1分钟，弃去滤液。</li>
	<li>重复此操作两次（步骤2.4–2.5），以洗涤脱盐柱。</li>
	<li>将80 µL以储存缓冲液溶解的蛋白质加至脱盐柱上（如需增加体积，可将蛋白质稀释至最低1 mg/mL）。</li>
	<li>以1400 × g离心1分钟。此步骤旨在将蛋白质从储存缓冲液转移至反应缓冲液中。</li>
	<li>收集流出液（含反应缓冲液中的蛋白质），并与0.6 µL羧基罗丹明溶液混合。</li>
	<li>室温孵育5分钟。</li>
	<li>同时，用储存缓冲液冲洗脱盐柱3次，每次以1400 × g离心1分钟，并弃去滤液。</li>
	<li>将反应液加至脱盐柱上。</li>
	<li>以1400 × g离心1分钟，收集流出液（即储存缓冲液中的标记蛋白质溶液）。</li>
	<li>向储备蛋白质溶液中添加0.1–1 %（w/w）的标记蛋白质。</li>
	<li>按照第1节所述设置ChipX结晶实验。</li>
	<li>使用520 nm波长光源激发荧光探针，检测实验中是否存在蛋白质晶体。</li>
</ol>
3. 晶体观察
注意：除非需要控制温度，ChipX 设备即使内部含有晶体，也可无需特殊护理进行操作。
<ol>
	<li>使用任意体视显微镜检查 ChipX 中结晶实验的结果。其外形尺寸符合标准显微镜载玻片规格，可兼容各类显微系统及载物台夹持器。</li>
	<li>从结晶剂浓度最高的储液池开始，依次检查微流控通道内的内容，直至结晶剂浓度最低的样品入口。ChipX 材料对可见光透明，兼容偏振片使用，也可用于紫外光照下通过色氨酸固有荧光识别蛋白质晶体8。</li>
	<li>利用通道旁压印的标签记录晶体位置，或使用永久性记号笔在芯片表面晶体旁绘制彩色标记点以标定位置。</li>
</ol>
4. 配体浸泡晶体
注意：此步骤为可选步骤。用于将配体、酶底物或重原子引入晶体中，应在X射线分析前至少24-48小时进行，以允许化合物沿通道扩散并进入晶体内部。
<ol>
	<li>轻轻移除储液池上的密封胶带。</li>
	<li>使用 10 µL 微量移液器，在一个或多个储液池中加入最多 5 µL 的配体溶液（示例中，向储液池加入 3 µL 的 10 mM 胞苷-5'-[(α,β)-亚甲基]三磷酸（CMPcPP）溶液，以达到 3.75 mM 的终浓度）。CMPcPP 是 CTP 的一种不可水解类似物，而 CTP 是该酶的天然底物。</li>
	<li>用一块 2.5 cm × 1 cm 的胶带密封储液池。</li>
	<li>将芯片置于受控温度条件下孵育 24–48 小时，以使配体在芯片的通道中充分扩散。</li>
</ol>
5. 通过序列晶体学进行晶体分析
注意：本实验步骤的这一部分需要根据光束线设置以及晶体的衍射特性进行相应调整。此处仅根据在X06DA光束线（SLS，瑞士维利根）进行的实验，提供晶体学分析的一般性指导。
<ol>
	<li>将ChipX安装到光束线测角仪上 
	&#8203;注意：ChipX支架的3D打印文件见参考文献4。
	<ol>
		<li>关闭光束线的低温气流。本实验在室温下进行。</li>
		<li>将ChipX安装在专用支架上，使含有待分析晶体的微通道位于支架中心。该ChipX支架4&#160;无需螺丝或其他附加部件，因其设计可与ChipX完美贴合。</li>
		<li>将支架连接至测角仪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>将ChipX最厚的一层（顶层，图1）朝向直射光束方向放置，最薄的一面则位于晶体后方，以最大限度减少衍射信号的衰减，如参考文献3所述。</li>
		<li>为避免ChipX与周围部件（光束挡板、准直器）发生碰撞，将测角仪&#160;的旋转范围限制在±30°以内（0°对应通道垂直于X射线束的方向）。</li>
		<li>借助沿通道压印的标签确定晶体位置。</li>
		<li>选择一个晶体位置。</li>
		<li>通过标准的低剂量网格/光栅扫描或一键式程序对晶体进行居中定位（视频展示了一个网格扫描示例）。</li>
		<li>在-30°至+30°范围内采集衍射数据。</li>
		<li>移动芯片后，在同一通道内的另一个晶体上重复步骤5.2.4–5.2.6。</li>
		<li>手动将另一个ChipX通道重新对准支架中心，并继续对该通道内的晶体进行数据采集。</li>
		<li>使用标准晶体学软件包和流程对数据进行处理与合并，进而求解并精修结构。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

当前生物晶体学的标准方案包括使用悬滴扩散法或批量法等方法制备晶体13, 14，随后将晶体转移至微环中进行低温冷冻15, 16&#160;，然后在低温条件下利用氮气射流进行衍射分析。相比之下，ChipX3无法实现晶体的直接冷冻，且晶体无法从其微流控通道中取出，这可被视为该系统的局限性。然而，本文所述方案提供了一条完全集成的流程，用于在室温条件下（即更接近生理条件）测定晶体结构。尽管在室温下收集数据会导致辐射损伤增加19，但这一效应被快速的数据采集（每颗晶体仅收集最多60°的旋转数据）以及多个部分数据集的合并所抵消。ChipX的设计与材料均经过优化，以减少背景散射和衍射信号衰减3，且可在晶体尺寸相当于通道一半大小（40 µm）时仍成功进行数据收集4。
总之，该实验方案的主要优势如下：晶体在无对流环境（微流控通道）中生成，这一条件非常有利于高质量晶体的生长。ChipX 中实施的对流扩散法在筛选过饱和度范围方面效率很高；结晶剂向芯片通道内的扩散形成浓度梯度和过饱和波，有助于确定合适的成核与生长条件5晶体从不直接操作，而是在芯片内原位进行分析，以保持其真实的衍射特性（即不会因物理接触或低温冷冻而改变晶体镶嵌性）。20衍射分析在沿芯片通道分布的一系列晶体上进行，采用低剂量曝光以最小化辐射损伤，并通过合并来自该系列晶体的部分数据来组装完整的数据集。ChipX 的标准尺寸和简单设计将使其在未来能够完全自动化 原位 使用同步辐射或XFEL设施进行数据收集。本方案的所有步骤均在ChipX中完成。从实验人员的角度来看，芯片的设置操作简单，仅需使用常规移液器即可完成，无需任何额外设备。样品入口处的树状通道连接设计可最大限度减少系统的死体积，这对于难以纯化或仅有有限数量的样品尤为重要。
综上所述，在ChipX中实现的芯片实验室方法通过逆扩散结晶和晶体结构测定，简化并高效地实现了从样品到其三维结构的微型化过程，能够在单一装置中完成整个流程。该方法具有广泛的适用性，为室温下常规的序列生物晶体学研究提供了一种用户友好且成本效益高的解决方案。

晶体学是一种解析生物大分子三维结构的方法。了解酶如何选择和加工其底物，这一方法至关重要。测定晶体结构需要对目标大分子进行结晶，并对晶体进行处理，以便通过X射线衍射进行分析1。晶体的制备与操作都是关键但极为精细的步骤，可能影响晶体质量及其衍射特性，从而影响最终三维结构的分辨率（即准确性）。为了便于高质量晶体的制备，并减少不必要的操作以保持其衍射性能，我们设计了一种用户友好且多功能的微流控装置，称为ChipX2,3,4。
本文将演示如何使用常规实验室材料将蛋白质溶液加载到ChipX通道中，通过逆扩散法进行晶体生长。由于结晶剂扩散形成浓度梯度，该结晶方法可在含有酶溶液的微流控通道内高效筛选过饱和状态及潜在的成核条件5,6。
芯片装置结构简单，仅使用常规实验室移液器，无需任何昂贵设备。当晶体在ChipX中生长后，可通过扩散方式引入酶的配体。随后，在室温下利用同步辐射X射线源，对芯片通道内的一系列晶体进行衍射数据收集。本文所述的结构研究成功解析了tRNA成熟酶在无配体状态及其与类似物结合状态下的结构。&#160;通过浸泡引入其CTP底物。这种被称为CCA添加酶的蛋白质可在tRNA的3'端聚合CCA三核苷酸尾。通过序列晶体学获得的两张三维图像的比较揭示了配体结合所引发的局部构象变化，其条件相较于冷冻晶体学更为接近生理状态。本视频所述方案普遍适用于任何生物分子，无论是蛋白质、核酸或多组分复合物。

<table><tbody><tr><td>Axioscope A1 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>晶体观察&amp;nbsp;（步骤 3）</td></tr><tr><td>羧基罗丹明琥珀酰亚胺酯</td><td>Invitrogen</td><td>C-6157</td><td>蛋白质标记（步骤 2）</td></tr><tr><td>CMPcPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-438</td><td>晶体浸泡（步骤 4）</td></tr><tr><td>Crystal clear 封膜胶带</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td>ChipX 封装&amp;nbsp;（步骤 1）</td></tr><tr><td>石蜡油</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-411</td><td>ChipX 加载&amp;nbsp;（步骤 1）</td></tr><tr><td>Ultimaker 2 extended+</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D 打印机 — 代表性结果</td></tr><tr><td>紫外光源</td><td>Xtal Concepts Gmbh</td><td>XtalLight100c</td><td>晶体观察&amp;nbsp;（步骤 3）</td></tr><tr><td>Zeba 旋转脱盐柱，7K 分子量截留</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89882</td><td>蛋白质标记&amp;nbsp;（步骤 2）</td></tr></tbody></table>

通过多功能微流控芯片中的序列晶体学对酶-底物复合物进行结晶及结构测定

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

制备出良好衍射质量的晶体，并在X射线分析前妥善处理这些晶体，是生物晶体学研究中的两个关键步骤。我们描述了一种多功能的微流控芯片，可通过高效的对流扩散法实现晶体的生长。微流控通道提供的无对流环境非常有利于晶体生长，并有助于将底物扩散至结晶酶的活性位点。在本示例中，我们将该方法应用于嗜冷细菌Planococcus halocryophilus的CCA添加酶。在完成结晶以及底物扩散/浸泡后，通过在室温下对芯片内多个晶体进行连续晶体学分析，测定了该酶与底物复合物的晶体结构。整个过程无需对晶体进行任何操作，因而能够完整保持样品本真的衍射特性。

本文所述的微流控芯片旨在便于在室温下进行结晶实验的设置和晶体分析。上述及视频中描述的实验步骤已应用于嗜冷细菌Planococcus halocryophilus的CCA添加酶的结构表征研究中。该酶属于一个必需的聚合酶家族，能够利用CTP和ATP催化在tRNA上逐个添加3'端CCA序列9,10。
首先利用该芯片通过逆扩散法为酶制备晶体，以进行结构分析。具体操作中，通过芯片样品入口单次注入，将酶溶液加载至八个微流控通道（结晶室）中（见图1）。所用酶溶液浓度为5.5 mg/mL，溶剂为储存缓冲液，其中含有20 mM Tris/HCl（pH 7.5）、200 mM NaCl和5 mM MgCl2。此步骤使用标准10 µL微量移液器手动完成。随后，将结晶溶液（100 mM乙酸钠，pH 4.5，1 M磷酸氢二铵）加入通道另一端的储液池中。
上样过程简单，不超过五分钟（图2）。随后，结晶剂扩散进入通道，在其中形成浓度梯度，从而触发晶体的成核与生长。该梯度动态演化，探索一系列过饱和状态5,6，直至通道与储液池之间的结晶剂浓度达到平衡。结晶实验通常在显微镜下观察2至4周，以追踪晶体生长情况。在20 °C孵育数天后，CCA添加酶的双锥形晶体在整个通道中出现（图3）。对蛋白质进行可选的荧光标记7，可极大地方便蛋白质晶体的识别，并将其与盐晶体区分开来（图4）。
我们利用芯片通道中的扩散环境，将底物递送至催化晶体形成的酶。在本实验中，向储液池溶液中加入CTP类似物CMPcPP，终浓度为3.75 mM（图5）。该步骤在晶体学分析前两天进行，以使CMPcPP有足够时间到达并占据酶的催化位点，后续晶体结构结果也证实了这一点（见下文）。
我们使用3D打印机以聚乳酸材料制造了一个芯片支架（图6）。该支架可利用标准磁性接头将芯片安装在测角仪上，从而能够方便地在X射线光束中对芯片进行定位和移动，使晶体进入衍射位置。数据收集策略需根据光束线特性和晶体性质进行相应调整。对于CCA加成酶，数据分别在瑞士光源（SLS）的X06DA和X10SA光束线上采集，X射线波长为1.0 Å，探测器分别为Pilatus 2M-F和6M像素探测器。在室温下，对每颗晶体采集30–60°的旋转数据，每幅图像的旋转步长为0.1°或0.2°，曝光时间为0.1 s（见表1）。部分数据集被单独处理，并在因辐射损伤导致衍射图样分辨率开始下降时进行截断（通过信噪比 <img alt="静态平衡方程 ⟨|σ(l)|⟩，符号表示，教学用途，物理概念。" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" style="margin: 0" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"> 和CC1/2降低以及高分辨率壳层中Rmeas 升高来判断）。完整的数据集通过合并5颗晶体的数据重新构建（表1）。晶体结构通过分子置换法获得，采用标准的晶体学软件包和流程进行数据处理11和结构精修12。酶本身及其与CMPcPP复合物的结构比较揭示了底物结合过程中CCA加成酶活性位点发生的局部构象变化（图7）。
<img alt="微流控装置示意图；标注有通道、样品入口和用于流体分析的储液池。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：ChipX 设计。 该芯片由顶部的环烯烃共聚物（COC）层（厚度：1 mm）构成，其上压印有八条微流控通道和储液池。整个芯片通过一层厚度为 0.1 mm 的 COC 密封。所有通道在左侧共用一个样品入口，用于同时注入样品；右侧则分别连接独立的储液池，用于加载结晶溶液。这些通道即为芯片的实际结晶室，长度为 4 cm，横截面为 80 µm × 80 µm。沿通道压印的标签（A1、A2、A3 等）有助于在显微镜下定位晶体，并便于准备数据采集用的样品列表。ChipX 的尺寸与标准显微镜载玻片相同（7.5 cm × 2.5 cm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用微流控芯片进行精确溶液混合的蛋白质结晶过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：在 ChipX 中设置结晶实验。 1) 使用标准的 10 µL 移液器和枪头，加入 5–6 µL 酶溶液。2) 将枪头垂直插入样品入口，并将溶液注入八个通道中。3) 用移液器吸取 1 µL 石蜡油。4) 将枪头垂直插入样品入口，并注入石蜡油，以使各通道相互隔离。5) 用一小片胶带密封入口。6) 使用标准的 10 µL 移液器和枪头，吸取 5 µL 结晶溶液。每个储液池中的溶液可以不同（例如，来自筛选试剂盒）。7) 将移液枪头对准储液池漏斗状区域的通道入口处（以避免加样时产生气泡），注入结晶液。8) 用一小片胶带密封储液池，并将芯片在受控温度下孵育。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显微镜图像中的晶体学过程；晶体生长序列，可见标尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：在ChipX微流控通道中通过反向扩散法培养的CCA添加酶晶体。 标尺为0.1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结合实验示意图，显示在微阵列芯片上加样配体溶液的过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：晶体浸泡实验流程。 1) 轻轻揭去储液池上的封口膜。2) 使用10 µL微量移液器，向每个储液池中加入最多5 µL的配体溶液。3) 将配体加入一个或多个储液池中。4) 用封口膜重新密封储液池，并在受控温度下孵育芯片24–48小时，之后进行数据采集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="晶体学实验；晶体结构的显微镜图像，显示分子结构图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：荧光标记可区分蛋白质（左）与盐（右）晶体。 CCA-添加酶溶液中含有0.4 %（w/w）以羧基罗丹明标记的蛋白质。右侧晶体使用波长为520 nm的光源照射，并通过550 nm长通滤光片（LP550）采集图像；（插图）羧基罗丹明-琥珀酰亚胺酯的结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="X射线晶体学实验装置、结构分析和衍射研究的示意图与设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：（左）ChipX样品托架的示意图；（右）在瑞士（Villigen）保罗谢勒研究所SLS光源X06DA光束线上，ChipX安装于测角仪上用于连续晶体分析的实物图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质结构与电子密度图的叠加；氨基酸相互作用的可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：CCA加尾酶在无配体状态（粉红色）及其与CTP类似物复合状态（绿色）下活性位点的比较。尽管酶的整体构象未受影响，但CMPcPP配体的结合伴随着活性位点内侧链的轻微重排。2Fo-Fc电子密度图（蓝色）等高线水平设为1.2 sigma。差值电子密度图（绿色）等高线水平设为4 sigma，证实了配体存在于活性位点中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>结晶样品</td>
			<td>CCA添加酶</td>
			<td>CCA添加酶 + CMPcPP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>晶体分析</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X射线光束线</td>
			<td>SLS – X06DA</td>
			<td>SLS – X10SA </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>波长 (Å)</td>
			<td>1.000</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度 (K)</td>
			<td>293</td>
			<td>293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>探测器</td>
			<td>Pilatus 2M-F</td>
			<td>Pilatus 6M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>晶体-探测器距离 (mm)</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>收集的晶体数量</td>
			<td>6</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>筛选的晶体数量</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每张图像的旋转范围 (°)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每张图像的曝光时间 (s)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>筛选的图像数量</td>
			<td>1000</td>
			<td>540</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总旋转范围 (°)</td>
			<td>100</td>
			<td>108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空间群</td>
			<td>P43212</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a, c (Å)</td>
			<td>71.5, 293.8</td>
			<td>71.4, 293.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均镶嵌度 (°)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分辨率范围 (Å)</td>
			<td>46 – 2.54 (2.6 – 2.54)</td>
			<td>48 – 2.3 (2.4 – 2.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总衍射点数</td>
			<td>176105 (9374)</td>
			<td>232642 (32937)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>唯一衍射点数</td>
			<td>23922 (1598)</td>
			<td>34862 (4066)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>数据完整性 (%)</td>
			<td>90.6 (84.6)</td>
			<td>99.5 (100.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冗余度</td>
			<td>7.5 (6.0)</td>
			<td>6.7 (8.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><img alt="静态平衡方程 ⟨|σ(l)|⟩，符号表示，教育用途，物理概念。" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"></td>
			<td>8.1 (1.3)</td>
			<td>6.9 (0.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rmeas (%) §</td>
			<td>18.6 (126.0)</td>
			<td>18.0 (231.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC1/2 (%) £</td>
			<td>98.7 (55.0)</td>
			<td>98.7 (46.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilson图计算的整体B因子 (Å2)</td>
			<td>57.4</td>
			<td>60.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>晶体学精修</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反射数，工作集 / 测试集</td>
			<td>23583 / 1180</td>
			<td>34840 / 3405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终Rcryst (%) / Rfree (%)</td>
			<td>18.8 / 21.4</td>
			<td>20.0 / 22.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非氢原子数：总体 / 蛋白质 / 配体 / 溶剂</td>
			<td>2998 / 2989 / 0 / 9</td>
			<td>3057 / 2989 / 29 / 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>键长 (Å) / 键角 (°) 的均方根偏差</td>
			<td>0.009 / 1.23</td>
			<td>0.010 / 1.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均B因子 (Å2)：总体 / 蛋白质 / 配体 / 溶剂</td>
			<td>60.1 / 60.1 / 0 / 52.7</td>
			<td>62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ramachandran图：最适构象 (%) / 允许构象 (%)</td>
			<td>98.1 / 1.9</td>
			<td>97.2 /  2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDB编号</td>
			<td>6IBP</td>
			<td>6Q52</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1：数据收集与精修统计
§ 无冗余性依赖的 Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)- &lt;I(hkl)&gt;| / ΣhklΣi Ii(hkl)，其中 N 为数据多重性17。
£ 低数据 &lt;I/σ(I)&gt; 在外壳中（&lt;2.0）是根据CC1/2标准（数据集两个随机半集之间的相关性）纳入的 &gt; 50%)，如 Karplus 所提出 &amp; Diederichs 18.

本文描述了一种多功能微流控装置，该装置能够利用逆扩散法实现酶的结晶，通过浸泡法将底物引入晶体，并在室温下对芯片内的晶体进行连续分析，从而测定酶与底物复合物的三维结构。

获得高质量衍射晶体及其在X射线分析前的处理是生物晶体学研究中的两个关键步骤。我们……

您好，欢迎来到斯特拉斯堡分子与细胞生物学研究所的RNA结构与反应性实验室。生长出高质量的衍射晶体是任何晶体学研究中的关键步骤。在本视频中，我们将演示如何使用一种新型微流控工具来生长生物大分子的晶体，并通过原位X射线衍射测定其三维结构。一种名为ChipX的微流控装置具有多项优势。该装置通过逆扩散法设计，可实现结晶过程的微型化和便利化。其组装简单，可使用标准实验室材料完成。它还针对芯片内生长晶体的直接表征进行了优化，适用于串行X射线晶体学分析。ChipX消除了晶体操作和低温冷冻步骤，能够在原位和室温条件下保持晶体的本征质量并进行分析。ChipX的外形尺寸与显微镜载玻片相同，为7.5厘米×2.5厘米。它包含八个用作结晶室的微流控通道，每个通道的截面为80乘以18微米，长度为4厘米。左侧的入口可用于手动注入生物分子溶液，该溶液将填充至八个通道末端的储液区。结晶溶液则被放置在右侧的这些储液区中。结晶由一种称为逆向扩散的现象引发。当结晶剂扩散进入生物分子溶液时，会形成浓度梯度和过饱和梯度。通道上的标签和标记有助于更方便地定位晶体。设置芯片需要五到六微升生物分子溶液，典型浓度为每毫升五到十毫克。另需一微升石蜡油、每个储液池五微升结晶溶液以及胶带。ChipX 的加样通过移液器和标准吸头手动完成。本示例中使用蓝色样品溶液，以便更清楚地观察注射过程。为避免泄漏，将进样针头垂直插入芯片的样品入口。样品之后加载 1 µL 石蜡油，以使各通道相互隔离。然后用胶带将样品入口密封。八个储液池分别加入五微升的结晶试剂溶液。操作时，将移液枪吸头以约45度角靠近通道末端。这可以防止样品与结晶试剂之间形成气泡。储液池可填充含有各种缓冲液、聚合物或盐等成分的混合溶液，用于筛选或优化条件。储液池用封口膜密封。如本演示所示，芯片的安装非常简单，仅需几分钟即可完成。在ChipX中，结晶通过逆向扩散实现。储液池中加入的结晶剂会扩散进入含有生物大分子的通道中。这会形成浓度和过饱和度的梯度，从而引发结晶。这些是在通道内获得的酶晶体示例。晶体可能生长至填满横截面为 80 乘 80 微米的通道。使用紫外光下色氨酸残基的天然荧光，或如图所示使用荧光标记蛋白，可通过荧光显微镜在ChipX中轻松检测到晶体。本节展示了在瑞士菲拉格里斯的瑞士光源（Swiss Light Source）进行的克里斯电信分析。芯片可直接送至同步辐射设施，无需任何附加设备或特殊防护。让我们进入瑞士光源大厅。电子在中心环中循环，产生宽谱的电磁波，包括在不同光束线上利用的X射线。本视频录制于X06光束线，该光束线专用于大分子晶体学研究。不同同步辐射装置的实验方案可能有所差异，但总体原理保持不变。ChipX被安装在3D打印的支架上，该支架随后固定在标准测角仪的磁体上。通过持续收集芯片上生长的一系列晶体的数据来进行序列分析。利用芯片通道两侧的标签和标记建立晶体位置列表。研究人员移动芯片，使晶体位于黄色窗口所示的X射线束中心。启动使用X射线束的快速居中程序。光束挡板升至指定位置，探测器向样品移动。进行网格扫描以确保晶体与光束对齐。将芯片旋转30度后，重复上述步骤。第二步至关重要，因为芯片材料会产生视差效应，导致衍射极大值相对于观察到的晶体位置发生偏移。一旦晶体在光束中居中，即开始数据采集。该序列展示了实时数据采集过程。芯片旋转30度，同时探测器收集相应的衍射图像。该晶体的表征已完成。芯片移至通道中的下一个晶体，整个过程重复进行。需要注意的是，该分析在无需直接接触晶体且在室温条件下原位完成。随后将收集到的一系列晶体数据合并，以获得完整的衍射数据集，用于计算电子密度图（以蓝色显示）并构建原子模型。本视频中描述的方法已应用于低温适应细菌嗜冷盐球菌（Planococcus halocryophilus）的tRNA修饰酶——CCA添加酶的结构表征研究中。使用ChipX通过反向扩散法在硫酸铵作为结晶剂的条件下使酶结晶。在20摄氏度下孵育数天后，沿通道出现了双锥形晶体。对蛋白质进行荧光标记有助于识别蛋白质晶体，并将其与盐晶体区分开来。一系列晶体在原位和室温条件下进行了分析。其衍射数据经合并后，得到了分辨率为2.5埃的载脂蛋白E（APOE）酶的晶体结构。此外，利用芯片通道中环境的扩散效应，将底物递送至酶中，从而促进晶体的形成。在本案例中，于同步辐射分析前两天，将 CTP 类似物加入到储液溶液中。这使得该化合物得以扩散并到达酶的催化位点。如在分辨率为 2.3 埃的复合物晶体结构中所见。本视频中展示的方案具有广泛的适用性，并已在多种生物分子上经过测试。综上所述，ChipX 是一种集成化验芯片工具，可将晶体学研究的全部步骤整合在一起，使您能够在单一的微流控装置中从生物医学溶液获得晶体结构。感谢您观看本视频。我们希望已使您信服，使用 ChipX 来结晶并测定您感兴趣的生物大分子的晶体结构具有诸多优势。

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