酶的结晶和结构确定:多功能微流体芯片中串行晶体学的基板复合物
2021年3月20日
描述了一种多功能的微流体装置，它利用反扩散方法使酶结晶，通过浸泡在晶体中引入基材，以及酶的3D结构测定:通过在室温下对芯片内部晶体进行连续分析，使酶结晶复杂。
您好，欢迎来到斯特拉斯堡分子和细胞生物学研究所的实验室架构和RNA反应性。生长良好的晶体是任何晶体学研究的关键一步。在这段视频中，我们将演示使用一种新的微流体工具来生长生物分子的晶体，并通过原位X射线衍射确定其3D结构。
名为 ChipX 的微流体设备具有几个优点。它旨在通过反扩散的方法使结晶资产小型化和便利化。其设置简单，使用标准实验室材料执行。
它还经过优化，通过串行 X 射线晶体学对芯片中生长的晶体进行直接定性。ChipX 消除了晶体处理和低温冷却步骤，并保留了在原地和室温下分析的晶体的内在质量。ChipX 具有显微镜滑梯的格式，7.5 x 2.5 厘米。
它包含8个微流体通道，用作结晶室，部分为80乘18微米，长度为4厘米。左侧的入口允许手动注入生物分子溶液，将填充到水库的八个通道。结晶溶液沉积在这些水库的右侧。
结晶是由一种叫做反扩散的现象触发的。当结晶剂扩散到生物分子溶液中并产生浓度和超饱和度梯度时。沿通道的标签和波斯特有助于更容易地找到晶体。
设置芯片需要五到六微升的生物分子溶液，典型浓度为每毫升5至10毫克。一个微光石蜡油，每个储层和胶带的结晶溶液五微升。ChipX 的加载使用微点和标准提示手动执行。
本示例中使用了蓝色样品溶液，以便更好地可视化注射过程。为了避免泄漏，尖端入样品入口垂直于芯片。样品后装载一微升石蜡油，将通道彼此分离。
然后用胶带密封样品入口。八个储层分别装载了五个微升的结晶剂溶液。为此，移液器尖端位于通道末端附近，角度约为 45 度。
这防止样品和结晶剂之间形成气泡。储藏罐中可以装满含有各种缓冲区、聚合物或盐等的鸡尾酒，以进行筛选或优化。储层用胶带密封。
如这里所示，设置芯片很容易，只需几分钟。在 ChipX 中，结晶通过反扩散发生。沉积在水库中的结晶剂扩散到含有生物分子的通道中。
这会产生浓度和超饱和度的梯度，从而触发结晶。这些是通道内获得的酶晶体的例子。它们可能会生长以填充横截面为 80 乘 80 微米的通道。
在 ChipX 中，通过荧光显微镜，使用紫外线下色氨酸残留物的自然荧光，或使用荧光标记的蛋白质，在 ChipX 中很容易检测到晶体。本节显示了在瑞士菲拉格林斯的瑞士光源进行的克里斯电报分析。芯片可以携带到同步加速器，无需任何额外的设备或特殊照顾。
让我们进入瑞士光源大厅。电子在中心环中循环，产生广泛的电磁波，包括在不同光束线被利用的X射线。这段视频是在X06录制的，X06是一个致力于宏观分子晶体学的光束线。
该协议可能会从一个同步加速器设施更改为另一个同步加速器设施，但总体原则保持不变。芯片X安装在3D打印支架上。然后，此支架连接到标准测高仪的磁铁上。
串行分析一致地从芯片中生长的一系列晶体中收集数据。晶体位置列表是使用芯片通道沿线的标签和 bost 建立的。研究人员将芯片移到以黄色窗户为标志的X射线束中的晶体中心。
使用 X 射线束启动快速中心程序。光束停止到位，探测器向样品移动。进行网格筛选，以确保晶体与光束对齐。
将芯片旋转 30 度后重复相同的过程。第二步很重要，因为芯片材料产生视差效应，导致与观测到的晶体位置有关的最大衍射变化。一旦晶体以光束为中心，数据收集就会开始。
此序列实时显示数据收集。芯片旋转30度。同时，探测器会收集相应的衍射图像。
这个晶体的特征是完整的。芯片翻译成通道中的下一个晶体，整个过程重复。请注意，此分析是在不直接处理晶体和室温的情况下就地操作的。
然后，在一系列晶体上收集的数据被合并，以获得一个完整的衍射数据集，用于计算以蓝色显示的电子密度图，并构建原子模型。本视频中描述的程序应用于 tRNA 改性酶的结构特征框架中。CCA添加的酶来自冷适应细菌，普莱诺球菌。
ChipX 用于在硫化铵作为结晶剂存在的情况下通过反扩散使酶结晶。经过几天在20摄氏度的潜伏后，沿通道出现了由金字塔状晶体。蛋白质的荧光标签有助于蛋白质晶体的识别及其对盐晶体的歧视。
在原地和室温下对一系列晶体进行了分析。他们的衍射数据被合并，并导致APOE酶的晶体结构，分辨率为2.5安斯特罗姆。此外，还利用芯片通道中环境的扩散，为建立晶体的酶提供基材。
在本例中，在同步加速器分析前两天，在储层溶液中添加了 CTP 模拟。这使得化合物扩散并到达酶的催化部位。如在2.3安斯特伦分辨率下确定的复合物的晶体结构中所见。
本视频中演示的协议通常适用，并已在各种生物分子上进行了测试。总结ChipX是一个实验室芯片工具，集成了晶体学研究的所有步骤，并允许您从生物医学解决方案到晶体结构在一个独特的微流体设备。感谢您观看此视频。
我们希望我们已经说服你使用ChipX来结晶和确定你最喜欢的生物分子的晶体结构的好处。
概述
本文介绍了一种名为ChipX的微流控装置，用于通过逆扩散进行酶结晶。它有助于生长高质量的晶体，并允许进行原位X射线衍射分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 晶体学
- 结构生物学
背景
- 结晶对于确定生物分子的3D结构至关重要。
- 传统方法涉及复杂的处理和低温冷却步骤。
- 微流控装置可以简化结晶过程。
- ChipX针对室温下直接表征晶体进行了优化。
研究目的
- 展示ChipX在酶结晶中的应用。
- 展示原位X射线衍射的优势。
- 提供有效使用该装置的协议。
使用的方法
- ChipX与生物分子和结晶溶液的设置。
- 在微流控通道中通过逆扩散进行结晶。
- 用于结构分析的原位X射线衍射。
- 从多个晶体收集数据而无需处理。
主要结果
- 使用ChipX成功生长酶晶体。
- 原位分析提供了高质量的衍射数据。
- 消除了晶体处理，改善了晶体完整性。
- 在Planococcus halocryophilus的CCA添加酶上展示了应用。
结论
- ChipX是一种用于生物分子结晶的多功能工具。
- 它简化了过程并提高了数据质量。
- 这种方法可以应用于各种生物分子的结构研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-quality structural determination of enzyme:substrate complexes is a critical inflection point in early drug discovery and target validation. The ChipX microfluidic platform enables in situ crystallization and serial X-ray analysis, reducing sample handling and preserving crystal integrity for more reliable structural insights. This integrated workflow supports predictive confidence in structure-based drug design and accelerates portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of enzyme:substrate interactions for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing high-resolution structural data.
- Facilitates rapid hypothesis testing through streamlined crystallization and analysis.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, convection-free crystal growth for assay standardization.
- Allows parallel screening of crystallization conditions within a single chip.
- Provides quantitative diffraction outputs for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Preserves native-like crystal environments for disease-relevant structural studies.
- Enables substrate diffusion into crystals, supporting translational biomarker alignment.
- Maintains continuity from discovery-stage structural biology to preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
ChipX integrates seamlessly from early discovery through lead identification by enabling in situ structural analysis without cryo-cooling or manual crystal handling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven target interrogation and pathway clarification via direct structure determination.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible crystals for downstream screening workflows.
- Analytics: Generates high-quality diffraction datasets for robust comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates substrate soaking and complex formation for translationally relevant targets.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform adaptable to diverse biomolecules and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Minimizes manual handling, enhances reproducibility, and streamlines workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics and crystallography for optimal setup and analysis.
- Needs access to synchrotron or advanced X-ray diffraction infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chip loading and data collection protocols.
- Adaptable to a range of protein and enzyme systems with minimal protocol modification.
- Limited by the size and type of biomolecules compatible with microfluidic channels.
