慢病毒递送的特异性shRNA在内质网应激神经元中的分子调节

在本研究中，通过使用特定的shRNA敲低PERK途径的两个下游信号成分，即细胞保护性钙调磷酸酶和促凋亡CHOP的表达。相反，这些调节原代皮质神经元在诱导内质网应激后对神经突萎缩的易感性。

这种方法可以通过操纵下游对组分的分子表达来用于内质网应力的细胞系统模型。该技术的主要优点是通过神经通路的可视化和测量来消除配对信号传导的影响。该方法有助于了解除GM2神经节苷脂增多症以外的各种神经退行性疾病模型中ER应激急性期和慢性期之间过渡的分子基础首先，在20X放大镜下解剖组织，用两个细尖五号镊子，将额叶皮层与脑膜分开。

将额叶皮层转移到15毫升锥形管中，并在37摄氏度下用3至4毫升胰蛋白酶EDTA孵育组织15分钟以进行化学消化。之后，用不含钙镁离子的Hank平衡盐溶液和0.1%葡萄糖洗涤三次。通过在DMEM和10%FCS中使用1， 000微升吸头上下移液，机械解离组织10次。

将匀浆以100G离心一分钟，收集上清液，并在1， 000微升中完成剩余体积。用含有10%FCS、1%青霉素链霉素和1%必需氨基酸添加剂的两毫升DMEM以每平方毫米520个细胞的密度将细胞悬浮液铺在细胞培养皿上。在含有5%二氧化碳的潮湿环境中在37摄氏度下孵育两个小时。

为了允许神经细胞分化，用无血清补充剂将培养基更换为无血清神经基础培养基。将培养物保持在37摄氏度，含5%二氧化碳直至处理。对于退火，将两个单链寡核苷酸与摩尔量的互补序列混合。

在 95 摄氏度下加热两分钟。将样品从加热块转移，并将所得产物稀释至终浓度为0.5微摩尔。将shRNA插入到慢病毒载体pLKO中。

3G，用EcoR1和PAC1限制性内切酶消化一微克载体。通过移液轻轻混合，并在 37 摄氏度下孵育反应三到四个小时。对于连接，混合消化的载体并以3:1的摩尔比插入。

将其与T4连接酶和连接酶缓冲液在16摄氏度下孵育过夜。接下来，将组分大肠杆菌与连接反应的总体积混合，并在冰上冷却15分钟。将其放入 42 摄氏度的浴缸中两分钟，然后再次在冰上冷却 15 分钟。

将承受热冲击的总体积转移到15毫升管中，并用Luria-Bertani或L-B液体培养基将体积完成至1， 000微升。在大约 330 RPM 的轨道摇床中以大约 37 摄氏度摇动细菌 90 分钟。在 4 摄氏度下达到 5， 000 G 五分钟的离心机。

弃去900微升上清液，并使用剩余的上清液重悬沉淀。将细菌悬浮液均匀地铺在固体氨苄青霉素 L-B 板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。选择一个菌落转移到装有 10 毫升 L-B 液体培养基和氨苄青霉素的 15 毫升管中。

在 37 摄氏度下以大约 330 RPM 摇动细菌，并将培养物离心以 5， 000 G 在 4 摄氏度下沉淀细菌五分钟。弃去上清液后，将细菌沉淀保存在零下20摄氏度。转染前24小时，将1至500万个HEK-293细胞接种到100毫米培养皿中。

混合14微克pKLO的pKLO。具有特定插入片段的 3G 载体、10.5 μg 包装质粒 psPAX 和 3.5 μg 包膜质粒 pMD2。G.将45微升质粒转染试剂稀释在700微升还原血清培养基中，在室温下孵育5分钟。

然后将DNA混合物与稀释的质粒转染试剂混合，轻轻混合，并在室温下孵育20分钟。转染后用新鲜培养基更换HEK-293细胞培养皿的培养基，并逐滴加入整个体积的DNA溶液。轻轻摇动培养皿，并将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 48 至 72 小时，以使 shRNA 达到最佳转导。

用慢病毒收集培养基并储存在四摄氏度。用0.45微米尼龙膜过滤病毒上清液，并等分试样一毫米的流出物。以17， 000 G离心4小时。

弃去上清液并保存沉淀。让看不见的颗粒干燥，干燥后储存在零下 80 摄氏度。用特异性shRNA寡核苷酸感染原代皮质神经元培养物，靶向钙调磷酸酶A-α或CHOP的三素UTR，并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育一天。

之后，将GM2储备溶液以终浓度为2微摩尔的培养皿中，并在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育16、24和48小时。用4%多聚甲醛和120毫摩尔蔗糖在PBS中在37摄氏度下固定细胞20分钟，然后用PBS洗涤。加入透化液五分钟，用PBS洗涤。

使用在PBS中稀释的5%BSA45分钟以允许阻塞。然后，与抗MAP2抗体在4摄氏度下孵育过夜。在孵育时间结束时用PBS洗涤细胞两次后，与二抗孵育一小时。

用PBS清洗细胞后安装眼镜。使用落射荧光倒置显微镜获得图像后，加载图片以获得ImageJ并通过单击"过程"然后"减去背景"来减去背景。单击图像、调整、阈值以调整最小值，从而可以区分路径和某些跟踪。

使用手绘选择删除体细胞。选择跟踪，然后单击编辑、选择、创建选择。通过单击所选内容的控件和 T 键来获取投资回报率并保存它。

打开原始图像。单击"ROI 管理器"面板，然后选择起始 ROI。然后单击原始图像。

一旦ROI在图像上跟踪，按控制和M键处理统计分析。这里试图检查沉默2pERK下游组分是否会影响ER应激细胞模型中未折叠蛋白质反应的过渡阶段。钙调磷酸酶A-α基因和CHOP基因在原代神经元细胞培养物中被两个特定的shRNA序列沉默一天。

通过蛋白质印迹分析表达。在敲低细胞中观察到ER应激介导的钙调磷酸酶A-α和CHOP水平增加的明显抑制。通过对原代神经元培养物进行MAP2免疫染色，检查GM2积累诱导的ER应激与神经元变性的可能联系。

在 16 至 48 小时孵育 GM2 诱导 ER 应激后，神经突萎缩显着增加。钙调磷酸酶A-α表达的沉默显着增强神经突萎缩，特别是在相对于GM2未治疗组的GM2积累16小时时。因此，钙调磷酸酶A-α敲低加速了神经元的变性过程，证实了钙调磷酸酶在未折叠蛋白质反应的早期阶段的促生存作用。

相反，CHOP敲低在16至24小时内相对于对照组导致神经突萎缩显着减少。该细胞方案具有适当的原代细胞培养物，并获得90个或更高百分比的感染细胞与相应的慢病毒。由于神经末梢轴突的损失是我们在此过程中布置的第一步，因此也可以通过执行测定来评估这一点。

这种技术使我们的小组和其他人能够评估一些分子作为潜在的治疗工具。