利用靶向Cofilin的腺相关病毒操控小鼠大脑皮层区域的皮层脑电图记录

本方案可用于确定特定分子靶点在不同警觉状态下调节皮层脑电活动中的作用。使用腺相关病毒的优势之一是能够精确定位特定脑区和特定细胞类型。本方案将由我团队的研究助理 Julien Dufort-Gervais 演示。

在确认12周龄小鼠对脚趾夹捏反射无反应后，使用毛发修剪器将耳朵后部至两眼之间前额区域的毛发剃除。在每只眼睛上涂抹适量的眼科软膏以防止脱水，并使用耳杆将小鼠头部小心固定在立体定位仪上。轻轻将舌头从口中拉出，以避免窒息。

将小鼠的鼻部固定在仪器上，使用70%乙醇对头部暴露的皮肤进行消毒。用超细格拉夫镊子夹住皮肤，用组织剪从耳基部剪至眼睛水平位置，然后在切口两侧各放置两个手术夹，以拉伸皮肤并暴露颅骨。避开脑缝，用剪刀尖在颅骨表面划擦，去除骨膜，并沿两个或多个方向形成重叠的划痕。

使用 70% 乙醇去除骨碎片并消毒颅骨。将先前准备好的套管固定在立体定位仪机械臂上，确定前囟和后囟的位置，并记录各自的空间坐标。利用立体定位仪机械臂和记号笔，在颅骨上标记套管的位置：位于中线右侧 1.5 毫米，前囟前方 1.5 毫米处。

使用0.7毫米钻头，在标记位置处垂直于颅骨表面并与垂直轴对齐，小心穿透颅骨，然后用浸有10%聚维酮碘溶液的无菌棉签擦拭颅骨。接着，将10微升注射器的推杆回抽1微升，使导管内吸入1微升空气泡。随后，通过缓慢移液充分混匀目标AAV混合物，并取1.7微升该混合物加入无菌培养皿中。使用该注射器将1.5微升溶液装入导管，并在连接的PE50管上标记空气泡的位置。

将套管与颅骨上的孔垂直对齐，使套管到达骨的上边缘，并标记颅骨表面的 Z 坐标。缓慢降低套管，直至其尖端到达颅骨表面下方 1.5 毫米处的运动皮层第五层，然后启动注射泵，以每分钟 0.025 微升的流速在 40 分钟内注入 1 微升 AAV。利用管中的气泡监测注射过程，并根据需要进行调整。

当病毒全部注入后，将套管留置原位5分钟，以确保充分扩散并防止回流，然后缓慢而小心地抬起立体定位臂，将套管从皮层中取出。进行电极植入时，使用直型Kelly镊子将一个带有直金丝的皮层电极缓慢旋入注射AAV的孔洞垂直轴中，使至少2.5毫米的螺钉部分露于颅骨外，以尽量减少对硬脑膜和大脑皮层的损伤。使用记号笔标记参考电极的位置：位于中线右侧2.6毫米、前囟后方0.7毫米处；标记后部心电图电极的位置：位于中线右侧1.5毫米、人字缝前方1.5毫米处；并在左半球标记三个固定螺钉的位置，无特定坐标，但应尽可能彼此之间以及与皮层电极之间保持最大距离。

使用钻头在标记好的其他电极和螺钉位置处，垂直于颅骨表面小心钻孔，并用10%聚维酮碘溶液冲洗钻孔后的颅骨。在安装螺钉前，用卷成小团的精细擦拭纸堵住孔洞，以防止出血和污染；使用直型凯利钳，沿钻孔时的角度将螺钉插入钻孔中。在螺钉内部环形空间的中央滴入少量牙科水泥，然后使用超细格拉夫钳提起颈部肌肉上方的皮肤。

使用Dumont 5号镊子夹住一个肌电图电极的弯曲端，将其插入肌肉内约1至2毫米。将电极的弯曲面和折叠点置于牙科水泥中，并以相同方式插入第二个肌电图电极。在遮盖动物眼睛后，照射光线3至5分钟以固化水泥，并使用额外的牙科水泥覆盖皮层脑电图电极和固定螺钉的基部，形成冠状轮廓。

再照射三到五分钟光线后，用丙烯酸树脂水泥填充阵列中心，并移除外科夹具。使用合成可吸收单丝缝线闭合阵列前后两端的皮肤，确保颅骨不外露；用弯头镊子夹住连接器，使其位于阵列上方，仔细将电极的金线与连接器的引脚对齐，然后迅速将每个电极末端焊接到对应的单个连接器引脚上。将小鼠从固定架上取下后，用丙烯酸树脂水泥填充连接器与头部之间的空隙。

称重后，将小鼠放入带有非网状盖子的清洁笼中，并置于加热垫上。手术两周后，将小鼠连接至记录电缆，至少一周后再持续记录24小时或更长时间的皮层脑电图和肌电图信号。通过注射部位周围运动皮层内神经元的HA染色可确认感染成功，显示存在cofilin S3D HA。在高倍镜下，与兴奋性神经元标志物CaMKII alpha共染色表明cofilin S3D HA与CaMKII alpha存在明显共表达。

在失活cofilin的条件下，清醒、慢波睡眠和矛盾睡眠的对数转换相对功率谱显示出不同状态下的谱活动特异性差异。结合皮层脑电图记录与AAV介导的特定分子靶点操控，该方法还可应用于多个脑区及其他神经科学子领域，如癫痫或记忆研究，而不仅限于睡眠研究。