通过质谱法研究蛋白质高级结构的二乙基焦碳酸酯共价标记

表征蛋白质结构对于理解其功能至关重要。质谱技术已成为实现这一目标的有力工具，尤其适用于难以通过传统方法研究的蛋白质体系。为了通过质谱研究蛋白质结构，需在溶液中进行特定的化学反应，将蛋白质的结构信息编码至其质量中。

一种特别有效的方法是使用共价修饰可及氨基酸侧链的试剂。这些反应会导致质量增加，当与蛋白酶解消化和串联质谱联用时，可实现残基水平定位。本文中，我们描述了使用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）作为共价标记试剂并结合质谱检测的相关实验方案。

DEPC 是一种高亲电性分子，能够标记平均蛋白质中多达 30% 的残基，从而提供优异的结构分辨率。DEPC 已成功与质谱联用，用于获取多种不同蛋白质的结构信息。首先配制目标蛋白质的缓冲溶液，浓度范围为数十微摩尔。

我们通常使用 10 毫摩尔、pH 7.4 的 MOPS 缓冲液。或者，如果原始样品中含有具有亲核功能基团的缓冲液，则可将现有蛋白质溶液置换到 MOPS 或其他缓冲液中。缓冲液中必须不含亲核功能基团，因为它们会干扰 DEPC 与蛋白质的反应。

在另一个微量离心管中，用无水乙腈配制 100 毫摩尔的 DEPC 储存液。使用无水乙腈配制储存液是为了防止 DEPC 发生水解。在新的微量离心管中，用 HPLC 级水配制 1 摩尔的咪唑溶液。

在新的微量离心管中，混合 MOPS 缓冲液与蛋白质溶液。向蛋白质和缓冲液中加入一份 DEPC 储存液，确保充分混匀，然后将反应混合物置于 37 摄氏度水浴中孵育一分钟。所用 DEPC 储存液的体积应根据所需的最终 DEPC 与蛋白质浓度比例来确定。

并不存在一套适用于所有蛋白质的DEPC和蛋白质浓度组合，尽管可以根据蛋白质中溶剂可及的组氨酸和赖氨酸残基的数量来估算最佳DEPC浓度。需要注意的是，所加入乙腈的体积（即相当于加入的DEPC溶液的体积）不应超过总体积的1%，以避免在反应过程中干扰蛋白质结构。反应时间最终由使用者决定，但在示例条件下进行一分钟反应可最大程度减少蛋白质的过度标记以及DEPC的水解。

一分钟后，加入咪唑以淬灭反应，清除未反应的DEPC。确保咪唑的终浓度为DEPC浓度的50倍。为了鉴定被DEPC修饰的残基，必须将蛋白质通过蛋白酶解消化成肽段片段。

进行消化时，应选择适合目标蛋白的条件。此处描述的常见步骤包括使蛋白变性，然后还原并烷基化二硫键，以提高消化效率。根据我们的经验，在消化前使用变性剂并加热使蛋白解折叠，可提高消化效率。

在蛋白质变性过程中，应在适当的消化缓冲液中比较TCEP和碘乙酰胺溶液。应使用TCEP作为还原剂，而非二硫苏糖醇（dithiothreitol）或DTT，因为DTT可与DEPC修饰的残基发生反应。还原后对生成的巯基进行烷基化至关重要，以避免发生标签混杂，即游离巯基与蛋白质和修饰氨基酸发生反应。

变性步骤完成后，向反应体系中加入TCEP以还原二硫键，并在室温下反应3分钟。还原后，向反应体系中加入碘乙酰胺，在室温下避光反应30分钟。可通过将反应体系置于盒子中来实现避光。

碘乙酰胺的终浓度应为TCEP使用浓度的两倍，或蛋白质浓度或二硫键浓度的80倍。根据制造商的说明，配制所需的酶（通常为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶）。配制好所选酶后，开始消化反应，并将反应混合物在37摄氏度下孵育。

对于DEPC标记的蛋白质，通常选择10:1的蛋白质与酶比例，并使用固定化酶进行3小时消化，效果较佳。消化完成后，样品应立即进行LC-MS/MS分析，或用液氮速冻，以尽量减少样品降解和标记丢失。可采用自下而上蛋白质组学（bottom up proteomics）的标准LC-MS/MS参数，用于鉴定蛋白水解肽段上的标记位点。

应使用反相 C18 固定相以实现肽段的最佳分离。根据我们的经验，由于使用了更高的样品量，毛细管液相色谱（capillary LC）比纳米液相色谱（nano LC）在修饰水平的定量分析方面提供更可靠的信息。用于分离 DEPC 标记肽段的典型液相色谱流动相由两种溶剂组成。

溶剂A为含有0.1%甲酸的水，溶剂B为含有0.1%甲酸的乙腈。采用梯度洗脱，分离时间可根据样品复杂程度进行优化。需要使用能够进行在线LC-MS和MS/MS的质谱仪，以鉴定肽段上的DEPC修饰位点。

在我们的实验中，已成功使用了多种类型的质谱仪。我们发现，Thermo Orbitrap Fusion 能够提供优异的结果，但任何能够在 LC-MS 分析过程中自动对多个肽段进行 MS/MS 分析的质谱仪均适用。在测量前，应正确设置高效液相色谱条件和质谱参数。

如果样品经过速冻，应在分析前立即解冻。尽量缩短样品制备与高效液相色谱（HPLC）进样之间的时间间隔。将消化后的标记蛋白质样品加载并注入液相色谱（LC）系统，启动液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）采集，或进行DEPC标记位点鉴定与峰面积定量，目前存在多种方法。

在 Thermo Fisher 仪器上，可使用 Excalibur 或 Proteome Discoverer。在程序中设置合适的肽段鉴定参数。DEPC 加成和羧氨甲基化作为可变修饰，用于辅助残基或分配。

通过测定肽段修饰与未修饰形式的色谱峰面积，可确定残基水平的修饰百分比。DEPC标记结合质谱检测也是表征蛋白质高级结构变化的有力工具。根据我们的研究，DEPC共价标记能够识别蛋白质在热应激和氧化应激条件下发生结构变化的特定区域。

在图中，修饰百分比显著降低的区域以蓝色显示，显著增加的区域以红色显示，而无显著标记变化的残基则以浅绿色表示。例如，β-2微球蛋白在受到热应激后，许多标记程度显著降低的残基（如N端、丝氨酸28、组氨酸31、丝氨酸33、丝氨酸55、丝氨酸57和赖氨酸58）位于蛋白质的一侧，表明该区域发生了构象变化，或可能介导了聚集。当蛋白质受到氧化应激后，标记程度降低的残基（如丝氨酸11、组氨酸13、赖氨酸19、赖氨酸41和赖氨酸94）则在蛋白质的另一区域形成簇状分布，表明氧化诱导的构象变化发生在其他位置。

本研究对蛋白质治疗药物具有重要意义，目前蛋白质治疗药物是制药市场中增长最快的领域。我们课题组的其他工作也表明，DEPC共价标记质谱技术能够检测并鉴定在压力条件下单克隆抗体治疗药物中构象变化的位点。如您所见，DEPC共价标记在实验操作上简便易行，却能为蛋白质提供有价值的结构信息。

与X射线晶体学和核磁共振（NMR）等技术相比，DEPC标记质谱所提供的结构分辨率较为有限，但它几乎适用于任何蛋白质，无论其分子大小或是否能够结晶。DEPC共价标记质谱还可用于蛋白质混合物，并能处理极为复杂的样品类型，例如细胞裂解液和haCat细胞。观看本视频后，我们相信您会发现DEPC标记是表征蛋白质结构的一种有用工具。