Name: 通过质谱学研究蛋白质高阶结构，与二乙基碳酸酯共价标签 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习使用二乙基焦碳酸酯（DEPC）共价标记结合质谱技术解析蛋白质高阶结构的方法。该技术通过修饰溶剂可及氨基酸残基，经蛋白酶解和液相色谱-串联质谱分析，实现残基水平的结构信息定位，为研究蛋白质动态变化提供有效工具。

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作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 GM075092提供的支持。本文所述部分数据所使用的赛默飞世尔Orbitrap Fusion质谱仪，由美国国立卫生研究院资助项目S10OD010645的资金购置。

1. 蛋白质和试剂的准备
注意：本方案包含使用 DEPC 标记蛋白质的示例工作流程。所列某些条件和试剂浓度可能因所选蛋白质的不同而有所变化。
<ol>
	<li>在1.5 mL微量离心管中配制所有试剂溶液。</li>
	<li>制备所需浓度的蛋白质溶液，通常浓度范围为数十 &#181;M，置于 pH 7.4 的 10 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）缓冲液中。或者，若样品中含有可与二乙基焦碳酸酯（DEPC）发生反应的亲核性缓冲液，则将现有蛋白质溶液置换为 10 mM、pH 7.4 的 MOPS 缓冲液。也可使用其他缓冲液（如磷酸盐缓冲生理盐水），只要其不含亲核性功能基团即可。</li>
	<li>在干燥的乙腈（ACN）中配制 100 mM DEPC 溶液，用移液器移取 1.45 &#181;L 6.9 M DEPC 储存液的 98.55 &#181;L ACN 的 
	注意：并非存在一套适用于所有蛋白质的通用浓度，但可根据组氨酸（His）和赖氨酸（Lys）残基的数量估算出最佳浓度23例如，使用 50 &#181;L 的 50 &#181;M &#946;2-微球蛋白溶液，将蛋白质与 0.2 &#181;L 100 mM DEPC 的最终浓度为 200 &#181;M （等于蛋白质浓度的4倍），以确保使用此通用示例时达到所需摩尔比（表1）。DEPC标记是一种2nd 一级反应，因此改变反应体系中蛋白质或DEPC的浓度都会改变标记速率。</li>
	<li>称取10 mg咪唑，溶于适量水中，配制成1 M咪唑溶液 146.9 &#181;L 色谱纯水。</li>
</ol>
2. 完整蛋白质的共价标记
<ol>
	<li>将水浴温度设置为 37 °C，并等待水浴达到稳定温度。 
	注意：示例标记实验方案中的试剂浓度和体积详见表 1。</li>
	<li>在新的微量离心管中，按表 1所列体积加入 MOPS 缓冲液和蛋白质溶液。</li>
	<li>向蛋白质与缓冲液混合物中加入 0.2 µL DEPC 溶液，充分混匀后，将含有反应混合物的离心管置于 37&#160;°C 水浴中反应 1 分钟。 
	注意：所加乙腈（ACN）体积不应超过总反应体积的 1%，以避免标记反应过程中蛋白质结构发生扰动。反应时间由使用者决定，但在示例条件下进行 1 分钟反应可最大程度减少过度标记以及 DEPC 水解的可能性14。</li>
	<li>1 分钟后，从水浴中取出含有反应混合物的离心管，并加入 1 µL 1 M 咪唑溶液以终止反应，清除未反应的残余 DEPC。 
	注意：反应混合物中咪唑的终浓度应为 DEPC 浓度的 50 倍，以确保完全清除未反应的 DEPC。</li>
</ol>
3. 自下而上液相色谱-质谱法蛋白质消化物的制备
注意：选择适合目标蛋白的消化条件。常见步骤包括使蛋白变性，以及还原和烷基化所有二硫键。
<ol>
	<li>通过向反应体系中加入适当的变性试剂使蛋白质展开。 
	注意：常用的变性剂包括乙腈（ACN）、尿素和盐酸胍（GuHCl）。</li>
	<li>分别称取5 mg的三(2-羧乙基)膦（TCEP）和碘乙酰胺（IAM），并分别溶于新的微量离心管中的174.4 µL和270.3 µL的10 mM pH 7.4 MOPS缓冲液中，以用于还原和烷基化步骤。</li>
	<li>向反应体系中加入2 µL的100 mM TCEP溶液（反应体系中终浓度为2 mM），室温反应3分钟，以还原二硫键。 
	注意：TCEP在溶液中的终浓度应为每分子蛋白质中每个二硫键对应蛋白浓度的40倍。</li>
	<li>在避光条件下，加入4 µL的100 mM IAM溶液（反应体系中终浓度为4 mM），反应30分钟，以烷基化还原后的半胱氨酸残基。IAM对光敏感，在直射光下会分解。 
	注意：IAM在溶液中的终浓度应为TCEP使用浓度的两倍，或为每分子蛋白质中每个二硫键对应蛋白浓度的80倍。</li>
	<li>使用适当的酶（如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶）对蛋白质进行消化。对于DEPC标记的蛋白质，通常采用固定化酶，在37&#160;°C、300次/分钟振荡条件下，按10:1的蛋白质与酶质量比进行3小时消化即可。参见讨论部分。</li>
	<li>消化完成后，以12,000 rpm离心5分钟，将固定化酶与消化后的肽段分离。</li>
	<li>立即进行LC-MS/MS分析，或使用液氮快速冷冻样品，以最大限度减少样品降解和标记丢失。将速冻样品保存在&lt; -20 °C条件下，直至进行LC-MS/MS分析。</li>
</ol>
4. 液相色谱-串联质谱分析
注意：可采用自下而上蛋白质组学的标准液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）参数来鉴定蛋白水解肽段上的标记位点。以下概述了一个通用示例。
<ol>
	<li>使用反相C18固定相分离DEPC标记的肽段。采用典型的液相色谱流动相体系，包含两种溶剂：(A) 水 + 0.1% 甲酸 和 (B) 乙腈 + 0.1% 甲酸，并使用梯度洗脱（例如 图2）以实现肽段的最佳分离。 
	注意：分离时间可根据样品复杂程度进行优化，流动相流速则取决于使用的是毛细管液相色谱还是纳升液相色谱。</li>
	<li>使用能够在线进行液相色谱-质谱（LC-MS）和串联质谱（MS/MS）分析的质谱仪，以鉴定肽段上的DEPC修饰位点。在我们的实验中，已成功使用多种类型的质谱仪。任何能够在LC-MS分析过程中自动对多个肽段进行MS/MS分析的质谱仪均适用。相关质谱参数包括：电喷雾离子源电压 = -4000 V（常规ESI）；-2000 V（纳喷雾）；Orbitrap分辨率 = 60,000；动态排除时间 = 30 s；MS/MS激活方式：CID、ETD或两者兼用；质荷比扫描范围 = 200–2,000；自动增益控制 = 4.0E5（Orbitrap中的一级质谱MS1）和 5.0E4（线性四极杆离子阱中的二级质谱MS2）。</li>
	<li>将消化并标记后的蛋白质样品加载并注入液相色谱系统，启动LC-MS/MS数据采集。若样品曾快速冷冻，分析前需先解冻。前5分钟将液相色谱流出液导流至废液，以避免过多盐分进入电喷雾离子源。 
	&#8203;注意：通常使用5 µL的进样环，可向LC-MS/MS系统注入约2.5 µg蛋白质。具体进样量需根据液相色谱的加载条件确定，以避免堵塞进样器。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用适用于所用质谱仪的适当软件，鉴定 DEPC 标记位点并量化肽段峰面积。</li>
	<li>将 DEPC 加成（72.02 Da）和羧氨甲基化（57.02 Da）设为可变修饰。MS/MS 分析的其他搜索参数如下：最大漏切位点数 = 3；碎片离子类型 = b 和 y；前体离子 m/z 容差 = 10 ppm（若使用四极杆离子阱质谱仪，该值应更高）；碎片离子 m/z 容差 = 0.5 Da（若使用高分辨率质谱仪进行产物离子扫描，该值应更低）；前体离子电荷 = 1–4。 
	注意：不同的数据库搜索算法具有不同的评分系统，许多算法在识别 DEPC 修饰肽段时可能存在困难，因为修饰水平可能较低。可能需要调整评分阈值以识别更多标记肽段。若如此，则应通过人工检查 MS/MS 数据来验证低分肽段。DEPC 标记水解产物未包含在数据搜索中，因为水解后的 DEPC 不再对亲核性侧链具有反应活性。</li>
	<li>利用修饰与未修饰肽段的色谱峰面积，确定残基水平的修饰百分比。 
	注意：必须考虑所有包含目标修饰残基的肽段，并且所有测量样品中均需包含所有电荷态。由于不同肽段的电离效率不同且洗脱时间不同，该数值反映的是特定位点修饰程度的相对值而非绝对值。 
	<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/61983/61983eq01.jpg" /> 
	其中 Ai,z 表示任何含有目标残基的特定肽段（i）的峰面积，并包含所有检测到的电荷态（z）。</li>
	<li>通过统计学评估，判断对照样本与实验样本之间的标记变化是否具有显著性。每个样本通常进行三次重复测量，最常用 t 检验，并采用 95% 或 99% 的置信区间。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键步骤 
在实验设计中，有几个方面需要考虑，以确保获得可靠的标记结果。首先，为最大程度实现蛋白质标记，应避免使用含有强亲核基团的缓冲液（例如 Tris），因为这些缓冲液可能与 DEPC 发生反应，从而降低标记程度。此外，这类缓冲液还可能与已标记的残基发生反应，导致标记物脱落，进而造成结构信息的丢失。我们推荐使用 MOPS 作为缓冲液，但磷酸盐缓冲盐水（PBS）也可适用。其次，应避免使用二硫苏糖醇（dithiothreitol）来还原二硫键，因为该试剂中的游离巯基可与已标记的残基反应，移除 DEPC 修饰。正是由于这一化学原理，必须对还原后的二硫键进行烷基化处理，因为游离的半胱氨酸可能导致蛋白质内标记发生混乱33。第三，使用咪唑进行淬灭的步骤（方案步骤 2.4）对于终止标记反应至关重要，以确保剩余的 DEPC 无法继续与蛋白质发生反应。
同样重要的是要认识到，DEPC标记反应是2nd 顺序，意味着改变蛋白质或DEPC的浓度都会影响标记程度。我们通过实验发现，当蛋白质浓度在数十微摩尔每升...

蛋白质几乎是所有生理过程中必不可少的生物分子。蛋白质能够执行多种功能，这得益于它们所采用的结构以及与其他生物分子之间的相互作用。为了更深入地理解蛋白质功能，需要借助生物化学和生物物理工具来阐明这些重要的结构特征和相互作用。传统上，X射线晶体学、低温电子显微镜以及核磁共振（NMR）波谱学能够提供所需的原子级细节，以揭示蛋白质结构。然而，许多蛋白质体系由于结晶性能差、蛋白质获取受限、样品异质性过高或分子量限制，无法通过这些技术进行研究。因此，一些新的分析方法应运而生，以克服上述局限性。其中，质谱法是一种新兴的技术，可提供蛋白质结构信息。
质谱法（MS）通过测量分子的质荷比（m/z）来分析物质，因此必须将蛋白质的高级结构信息编码到蛋白质的质量中，才能获得所需的结构信息。目前已开发出多种编码方法，包括氢-氘交换（HDX）1,2,3,4、化学交联（XL）5,6和共价标记（CL）7,8,9,10。在HDX中，主链酰胺氢会以依赖溶剂可及性和氢键程度的速率被稍重的氘原子取代。通过在质谱分析前迅速将蛋白质酶解为肽段片段，再对这些片段进行分离和质谱检测，或在自上而下的实验中解离蛋白质，即可定位HDX发生的位点。测定交换速率可进一步揭示蛋白质的动态特性。尽管HDX存在回交换问题以及需要专用设备以提高重复性的挑战，但它已被证明是表征蛋白质结构的有力工具。在XL-MS中，蛋白质与双功能试剂反应，共价连接同一蛋白质内或两个蛋白质之间的邻近残基侧链。因此，XL-MS可提供距离约束信息，用于解析蛋白质结构。通过蛋白酶消化后结合液相色谱（LC）-质谱分析，可以鉴定出蛋白质中发生交联的区域。虽然XL-MS是一种多功能工具，已被用于研究多种蛋白质复合物（包括细胞内的复合物），但交联产物的鉴定较为困难，且需要专用软件支持。
交联质谱（CL-MS）近年来作为一种补充甚至在某些情况下可替代的基于质谱的技术，被用于研究蛋白质结构及其相互作用。在CL-MS中，蛋白质或蛋白质复合物通过单功能试剂共价修饰，该试剂可与溶剂暴露的侧链发生反应（图1）。通过比较蛋白质或蛋白质复合物在不同条件下的修饰程度，可揭示其构象变化、结合位点以及蛋白质-蛋白质相互作用界面。在完成交联反应后，通常可通过典型的自下而上蛋白质组学工作流程获得位点特异性信息，该流程包括：蛋白质经蛋白酶消化产生肽段片段，肽段通过液相色谱（LC）分离，并利用串联质谱（MS/MS）鉴定修饰位点。得益于生物偶联化学的长期发展，目前已有大量可用于CL-MS实验的试剂。交联试剂通常分为两类：（i）特异性试剂和（ii）非特异性试剂。特异性试剂仅与单一功能基团反应（例如游离胺基）8,10，操作简便，但通常提供的结构信息有限。非特异性试剂可与多种侧链发生反应，但往往需要激光器或同步辐射源等专用设备来产生活性极高的反应物种。羟基自由基是最常用的非特异性试剂，已被广泛应用于羟基自由基足迹分析（HRF）7,11,12,13实验中，用于在多种条件下研究各类蛋白质及蛋白质复合物。
我们的研究团队已成功使用另一种相对非特异性的试剂——焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate, DEPC），在交联质谱（CL-MS）实验中研究蛋白质结构及相互作用14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25。DEPC 具有特异性标记试剂的简便性（即进行反应无需特殊设备），同时可与普通蛋白质中多达30%的氨基酸发生反应。作为一种高亲电性试剂，DEPC 能够与蛋白质的N端以及半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的亲核侧链发生反应。通常，这些反应仅生成一种产物，导致分子量增加72.02 Da。这种单一类型的产物与蛋白质与羟基自由基反应时可能产生的多达55种不同产物形成鲜明对比7。此类简单的化学反应有助于标记位点的鉴定。
本文提供了利用基于DEPC的交联质谱法（CL-MS）研究蛋白质结构与相互作用的实验方案。详细描述了试剂制备、DEPC与蛋白质反应、蛋白质消化条件、液相色谱-质谱（LC-MS）和串联质谱（MS/MS）参数以及数据分析等步骤。我们还通过金属-蛋白质、配体-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用，以及蛋白质在加热过程中发生结构变化的研究实例，展示了DEPC标记技术的应用价值。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3448</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-吗啉代)丙磺酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-吗啉代)丙磺酸钠盐</td><td>Millipore Sigma</td><td>M9381</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap RSLC C18 色谱柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>164537</td><td>300 &amp;mu;m x 15 cm, C18, 2 &amp;mu;m, 100 A</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-1</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>固定化胰凝乳蛋白酶</td><td>ProteoChem</td><td>g4105</td><td></td></tr><tr><td>固定化胰蛋白酶（TPCK 处理）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20230</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4706</td><td></td></tr></tbody></table>

通过质谱法研究蛋白质高级结构的二乙基焦碳酸酯共价标记

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

表征蛋白质的高级结构对于理解其功能至关重要。质谱法（MS）已成为实现这一目标的有力工具，尤其适用于难以通过传统方法研究的蛋白质体系。为了利用质谱法研究蛋白质结构，需在溶液中进行特定的化学反应，将蛋白质的结构信息编码至其质量中。其中一种特别有效的方法是使用共价修饰溶剂可及氨基酸侧链的试剂。这些反应会导致质量增加，当结合蛋白酶解和串联质谱分析时，可实现残基水平的定位。本文介绍了将二乙基焦碳酸酯（DEPC）作为共价标记试剂与质谱检测联用的相关实验方案。DEPC 是一种高亲电性分子，能够标记普通蛋白质中多达 30% 的残基，从而提供优异的结构分辨率。DEPC 已成功与质谱联用，获得了从小型单结构域蛋白质（如 β2-微球蛋白）到大型多结构域蛋白质（如单克隆抗体）的结构信息。

鉴定DEPC修饰位点及修饰百分比 
由于共价标记导致的质量增加可在（a）完整蛋白质和（b）肽段水平上进行测量8,9。在完整蛋白水平，可通过直接分析或对标记后的蛋白质样品进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析，获得带有不同数量标记的蛋白质物种分布。为了获得更高分辨率的结构信息（即位点特异性标记数据），必须在肽段水平上进行测量。在完成标记和淬灭步骤后，标记的蛋白质需进行自下而上的蛋白质组学分析（即二硫键还原、烷基化、蛋白酶解消化以及液相色谱-串联质谱LC-MS/MS）。图3展示了在β-2-微球蛋白（β2m）蛋白上进行DEPC化学交联质谱（DEPC CL-MS）实验时，如何鉴定DEPC标记位点并计算其修饰水平21。通过MS/MS对标记肽段进行测序，从而精确定位其DEPC修饰位点，而修饰百分比则通过提取离子色谱图中的相对峰面积计算得出（见图3A</stro...

本文描述了基于焦碳酸二乙酯的共价标记实验步骤，并结合质谱检测方法。焦碳酸二乙酯可直接与目标蛋白质或蛋白质复合物混合，从而修饰溶剂可及的氨基酸残基。经过蛋白酶消化及液相色谱-质谱分析后，即可鉴定出被修饰的残基。

表征蛋白质的高级结构对于理解其功能至关重要。质谱法（MS）已成为一种强大的工具……

表征蛋白质结构对于理解其功能至关重要。质谱技术已成为实现这一目标的有力工具，尤其适用于难以通过传统方法研究的蛋白质体系。为了通过质谱研究蛋白质结构，需在溶液中进行特定的化学反应，将蛋白质的结构信息编码至其质量中。一种特别有效的方法是使用共价修饰可及氨基酸侧链的试剂。这些反应会导致质量增加，当与蛋白酶解消化和串联质谱联用时，可实现残基水平定位。本文中，我们描述了使用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）作为共价标记试剂并结合质谱检测的相关实验方案。DEPC 是一种高亲电性分子，能够标记平均蛋白质中多达 30% 的残基，从而提供优异的结构分辨率。DEPC 已成功与质谱联用，用于获取多种不同蛋白质的结构信息。首先配制目标蛋白质的缓冲溶液，浓度范围为数十微摩尔。我们通常使用 10 毫摩尔、pH 7.4 的 MOPS 缓冲液。或者，如果原始样品中含有具有亲核功能基团的缓冲液，则可将现有蛋白质溶液置换到 MOPS 或其他缓冲液中。缓冲液中必须不含亲核功能基团，因为它们会干扰 DEPC 与蛋白质的反应。在另一个微量离心管中，用无水乙腈配制 100 毫摩尔的 DEPC 储存液。使用无水乙腈配制储存液是为了防止 DEPC 发生水解。在新的微量离心管中，用 HPLC 级水配制 1 摩尔的咪唑溶液。在新的微量离心管中，混合 MOPS 缓冲液与蛋白质溶液。向蛋白质和缓冲液中加入一份 DEPC 储存液，确保充分混匀，然后将反应混合物置于 37 摄氏度水浴中孵育一分钟。所用 DEPC 储存液的体积应根据所需的最终 DEPC 与蛋白质浓度比例来确定。并不存在一套适用于所有蛋白质的DEPC和蛋白质浓度组合，尽管可以根据蛋白质中溶剂可及的组氨酸和赖氨酸残基的数量来估算最佳DEPC浓度。需要注意的是，所加入乙腈的体积（即相当于加入的DEPC溶液的体积）不应超过总体积的1%，以避免在反应过程中干扰蛋白质结构。反应时间最终由使用者决定，但在示例条件下进行一分钟反应可最大程度减少蛋白质的过度标记以及DEPC的水解。一分钟后，加入咪唑以淬灭反应，清除未反应的DEPC。确保咪唑的终浓度为DEPC浓度的50倍。为了鉴定被DEPC修饰的残基，必须将蛋白质通过蛋白酶解消化成肽段片段。进行消化时，应选择适合目标蛋白的条件。此处描述的常见步骤包括使蛋白变性，然后还原并烷基化二硫键，以提高消化效率。根据我们的经验，在消化前使用变性剂并加热使蛋白解折叠，可提高消化效率。在蛋白质变性过程中，应在适当的消化缓冲液中比较TCEP和碘乙酰胺溶液。应使用TCEP作为还原剂，而非二硫苏糖醇（dithiothreitol）或DTT，因为DTT可与DEPC修饰的残基发生反应。还原后对生成的巯基进行烷基化至关重要，以避免发生标签混杂，即游离巯基与蛋白质和修饰氨基酸发生反应。变性步骤完成后，向反应体系中加入TCEP以还原二硫键，并在室温下反应3分钟。还原后，向反应体系中加入碘乙酰胺，在室温下避光反应30分钟。可通过将反应体系置于盒子中来实现避光。碘乙酰胺的终浓度应为TCEP使用浓度的两倍，或蛋白质浓度或二硫键浓度的80倍。根据制造商的说明，配制所需的酶（通常为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶）。配制好所选酶后，开始消化反应，并将反应混合物在37摄氏度下孵育。对于DEPC标记的蛋白质，通常选择10:1的蛋白质与酶比例，并使用固定化酶进行3小时消化，效果较佳。消化完成后，样品应立即进行LC-MS/MS分析，或用液氮速冻，以尽量减少样品降解和标记丢失。可采用自下而上蛋白质组学（bottom up proteomics）的标准LC-MS/MS参数，用于鉴定蛋白水解肽段上的标记位点。应使用反相 C18 固定相以实现肽段的最佳分离。根据我们的经验，由于使用了更高的样品量，毛细管液相色谱（capillary LC）比纳米液相色谱（nano LC）在修饰水平的定量分析方面提供更可靠的信息。用于分离 DEPC 标记肽段的典型液相色谱流动相由两种溶剂组成。溶剂A为含有0.1%甲酸的水，溶剂B为含有0.1%甲酸的乙腈。采用梯度洗脱，分离时间可根据样品复杂程度进行优化。需要使用能够进行在线LC-MS和MS/MS的质谱仪，以鉴定肽段上的DEPC修饰位点。在我们的实验中，已成功使用了多种类型的质谱仪。我们发现，Thermo Orbitrap Fusion 能够提供优异的结果，但任何能够在 LC-MS 分析过程中自动对多个肽段进行 MS/MS 分析的质谱仪均适用。在测量前，应正确设置高效液相色谱条件和质谱参数。如果样品经过速冻，应在分析前立即解冻。尽量缩短样品制备与高效液相色谱（HPLC）进样之间的时间间隔。将消化后的标记蛋白质样品加载并注入液相色谱（LC）系统，启动液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）采集，或进行DEPC标记位点鉴定与峰面积定量，目前存在多种方法。在 Thermo Fisher 仪器上，可使用 Excalibur 或 Proteome Discoverer。在程序中设置合适的肽段鉴定参数。DEPC 加成和羧氨甲基化作为可变修饰，用于辅助残基或分配。通过测定肽段修饰与未修饰形式的色谱峰面积，可确定残基水平的修饰百分比。DEPC标记结合质谱检测也是表征蛋白质高级结构变化的有力工具。根据我们的研究，DEPC共价标记能够识别蛋白质在热应激和氧化应激条件下发生结构变化的特定区域。在图中，修饰百分比显著降低的区域以蓝色显示，显著增加的区域以红色显示，而无显著标记变化的残基则以浅绿色表示。例如，β-2微球蛋白在受到热应激后，许多标记程度显著降低的残基（如N端、丝氨酸28、组氨酸31、丝氨酸33、丝氨酸55、丝氨酸57和赖氨酸58）位于蛋白质的一侧，表明该区域发生了构象变化，或可能介导了聚集。当蛋白质受到氧化应激后，标记程度降低的残基（如丝氨酸11、组氨酸13、赖氨酸19、赖氨酸41和赖氨酸94）则在蛋白质的另一区域形成簇状分布，表明氧化诱导的构象变化发生在其他位置。本研究对蛋白质治疗药物具有重要意义，目前蛋白质治疗药物是制药市场中增长最快的领域。我们课题组的其他工作也表明，DEPC共价标记质谱技术能够检测并鉴定在压力条件下单克隆抗体治疗药物中构象变化的位点。如您所见，DEPC共价标记在实验操作上简便易行，却能为蛋白质提供有价值的结构信息。与X射线晶体学和核磁共振（NMR）等技术相比，DEPC标记质谱所提供的结构分辨率较为有限，但它几乎适用于任何蛋白质，无论其分子大小或是否能够结晶。DEPC共价标记质谱还可用于蛋白质混合物，并能处理极为复杂的样品类型，例如细胞裂解液和haCat细胞。观看本视频后，我们相信您会发现DEPC标记是表征蛋白质结构的一种有用工具。

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化学

通过质谱学研究蛋白质高阶结构，与二乙基碳酸酯共价标签

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蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。...

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

本文介绍了一种基于毛细管电泳的氢/氘交换（HDX）方法，并结合自上而下的质谱技术。该方法通过同时进行差异化的HDX反应和电泳分离，表征不同蛋白质种类（包括处于不同状态的蛋白质和不同的蛋白质异构体）在高级结构上的差异。...

基于毛细管电泳的氢/氘交换结合自上而下质谱法用于蛋白质构象表征

学习使用二乙基焦碳酸酯（DEPC）共价标记结合质谱技术解析蛋白质高阶结构的方法。该技术通过修饰溶剂可及氨基酸残基，经蛋白酶解和液相色谱-串联质谱分析，实现残基水平的结构信息定位，为研究蛋白质动态变化提供有效工具。

通过质谱法研究蛋白质高级结构的二乙基焦碳酸酯共价标记

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