Name: 胎儿和成体神经干细胞衍生少突胶质细胞前体细胞培养物的高内涵筛选分化与成熟分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 了解利用高内涵筛选技术分析神经干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞分化与成熟的方法。该方案结合细胞培养与药物筛选技术，为研究髓鞘形成和脱髓鞘疾病治疗提供可靠工具。

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由意大利大学与研究部（MIUR）国家技术集群项目IRMI（CTN01_00177_888744）以及艾米利亚-罗马涅大区Mat2Rep项目（POR-FESR 2014-2020）资助。
特别感谢 IRET 基金会为本实验工作提供的支持。

本文所述所有动物实验方案均依照欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）实施，并符合已发布的指南要求 实验动物护理和使用指南（NIH）.
1. 溶液与试剂
<ol>
	<li>配制标准培养基：DMEM/F12 GlutaMAX 1x；8 mmol/L HEPES；100 U/100 μg 青霉素/链霉素（1% P/S）；1x B27；1x N-2。</li>
	<li>配制神经球培养基：在标准培养基中加入 10 ng/mL bFGF 和 10 ng/mL EGF。</li>
	<li>配制少突球/少突前体细胞（OPC）培养基：在标准培养基中加入 10 ng/mL bFGF 和 10 ng/mL PDGF-AA。</li>
	<li>配制少突胶质细胞分化培养基：在标准培养基中加入 50 nM T3、10 ng/mL CNTF 和 1x N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）。</li>
	<li>配制非酶解离缓冲液：向非酶解离缓冲液中加入 1% P/S，并保持冰上低温。</li>
	<li>配制蔗糖溶液：HBSS，含 0.3 g/mL 蔗糖。</li>
	<li>配制 BSA 洗涤液：EBSS，含 40 mg/mL BSA 和 0.02 mL/L HEPES。</li>
	<li>配制酶解离缓冲液：HBSS，含 5.4 mg/mL D-葡萄糖、15 mmol/L HEPES、1.33 mg/mL 胰蛋白酶、0.7 mg/mL 透明质酸酶和 80 U/mL DNase。</li>
	<li>配制细胞因子混合物：TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17 和 IFN-γ（各 20 ng/mL）。</li>
	<li>配制细胞因子混合物溶剂：使用储存液的 0.04%（10% 甘油/100 nM 甘氨酸/25 nM Tris，pH 7.3）。</li>
	<li>配制缺氧-缺糖培养基：使用无葡萄糖的 DMEM 配制标准培养基。&#160;根据所需缺糖条件的严格程度，可从培养基中去除 B27 和/或 N2，以避免葡萄糖相关化合物（例如 B27 中的 D-半乳糖）。</li>
</ol>
2. 解剖与神经干细胞分离
注意：胎鼠和成年小鼠的神经干细胞（NSCs）分别从 E13.5 胎鼠前脑或 2.5 月龄成年小鼠侧脑室下区（SVZ）分离获得，具体操作参照 Ahlenius 和 Kokaia 方案9并进行了修改。
<ol>
	<li>胎鼠NSC培养 
	注意：开始解剖前，准备若干1.5 mL离心管，每管加入150 µL非酶解离缓冲液；清洗培养皿并加入冰冷的HBSS。
	<ol>
		<li>从定时妊娠的小鼠中收集E13.5–14.5天的胚胎，置于含有冷HBSS的培养皿中。</li>
		<li>使用镊子将胚胎头部剪下。</li>
		<li>将胚胎头部转移至另一洁净的培养皿中，其中含有冰冷的PBS，使用镊子在放大镜或体视显微镜下剥离颅骨表面的皮肤。</li>
		<li>当脑组织暴露且去净皮肤后，用镊子从两侧施加压力，将脑组织挤出。</li>
		<li>去除小脑，仅保留前脑，并用镊子去除脑膜。</li>
		<li>将分离的组织放入非酶解离缓冲液中，并对其他胚胎重复上述解剖步骤。每管缓冲液中放入2–3只动物的组织。</li>
		<li>在37 °C下持续振荡孵育15分钟。</li>
		<li>孵育结束后，加入850 µL标准培养基，通过移液吹打混匀，直至悬液中无明显团块。</li>
		<li>若仍有未完全解离的组织，于室温静置2分钟，使其沉降至管底。</li>
		<li>当组织完全解离后，计数细胞，并以10–50个细胞/µL的密度将细胞悬液接种至含有10–30 mL神经球培养基的T-25或T-45培养瓶中，培养瓶保持垂直放置，以防止细胞贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年小鼠NSC培养
	<ol>
		<li>通过颈椎脱臼法处死实验动物。</li>
		<li>从4–5只小鼠中取出脑组织，放入一个含有冰冷HBSS的50 mL离心管中。</li>
		<li>将脑组织置于冰冷且无菌的表面上。可使用一个装有水的T-25培养瓶，于-20 °C过夜冷冻，实验时用无菌铝箔覆盖其表面作为操作平台。</li>
		<li>将脑组织腹面朝下，沿头尾方向放置，使用刀片切除嗅球。</li>
		<li>使用刀片从前脑皮层至视交叉区域切取2–3片厚度为1 mm的冠状切片。</li>
		<li>将切片腹面朝上置于冷表面上，辨认胼胝体及两个侧脑室。</li>
		<li>在放大镜或体视显微镜下，小心分离侧脑室壁组织，注意避免带入胼胝体组织碎片。</li>
		<li>将分离的组织放入酶解离缓冲液（5–10 mL）中，在37 °C孵育15分钟。</li>
		<li>反复吹打混匀溶液多次（至少50次），再次于37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>加入5 mL标准培养基以中和胰蛋白酶活性，并使用70 µm滤网过滤细胞悬液。</li>
		<li>将滤过的溶液在400 × g 条件下离心5分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于蔗糖溶液中，在500 × g 条件下离心10分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于BSA洗涤液中，在400 × g 条件下离心7分钟。</li>
		<li>将最终沉淀重悬于标准培养基中，计数细胞后，按照上述步骤（2.1.10）进行接种培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原代神经球
<ol>
	<li>每2天添加一次生长因子（bFGF/EGF）。</li>
	<li>每4–6天（根据细胞密度而定），更换一半培养基，步骤如下：
	<ol>
		<li>将整个细胞悬液转移至15 mL或50 mL离心管中。</li>
		<li>在400 × g 条件下离心5分钟。</li>
		<li>移除一半体积的培养基。</li>
		<li>加入等量的新鲜培养基，轻轻吹打混匀，并添加生长因子。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 寡球体
注意：少突胶质细胞分化按照 Chen 方案10 进行，并稍作修改。
<ol>
	<li>当神经球直径达到 100–150 µm 时，即可进行传代。操作时，将整个细胞悬液转移至 15 或 50 mL 离心管中，在 400 x g 条件下离心 5 分钟。
	<ol>
		<li>使用倒置透射光显微镜拍摄神经球图像，并通过 ImageJ 软件打开图像，快速评估其直径。</li>
		<li>点击 分析 菜单，在 工具 窗口中选择 标尺。</li>
		<li>将 微米宽度 设置为 150 µm，并将标尺与神经球进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过倒置方式完全去除上清液，将沉淀重悬于 180 µL 新鲜的标准培养基中。用移液器吹打 50 次，使神经球充分解聚。</li>
	<li>加入 810 µL 新鲜的标准培养基，计数细胞，并按照神经球的接种方法重新接种。</li>
	<li>每隔 2 天添加 10 ng/mL 的 bFGF/PDGF-AA。</li>
	<li>每 4–6 天（根据细胞密度而定），更换一半培养基，步骤如下：</li>
	<li>将整个细胞悬液转移至 15 或 50 mL 离心管中。</li>
	<li>在 400 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>去除一半体积的上清液。</li>
	<li>加入等量的新鲜培养基，轻轻吹打混匀，然后添加生长因子。</li>
</ol>
5. 包被平板
<ol>
	<li>多聚-D,L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被：在接种少突胶质前体细胞（OPCs）前至少两天，将溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的多聚-D,L-鸟氨酸溶液（50 µg/mL）加入每孔中（96孔板每孔40 µL），于室温孵育过夜。</li>
	<li>次日，吸去液体，并用无菌蒸馏水洗涤三次。</li>
	<li>让培养板在室温下干燥过夜。次日，加入溶于PBS的层粘连蛋白溶液（5 µg/mL；96孔板每孔40 µL），于37 °C孵育2小时。</li>
</ol>
6. 细胞接种
<ol>
	<li>当寡球体直径达到 100–150 µm 时，即可进行解离，并接种至多聚-D,L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养板上。操作时，将全部细胞悬液转移至 15 或 50 mL 离心管中，在 400 x g 条件下离心 5 分钟（如步骤 4.1 所述）。</li>
	<li>通过倒置完全去除上清液，将沉淀重悬于 180 µL 新鲜的标准培养基中，用移液器吹打 50 次，使球体充分解离。</li>
	<li>加入 810 µL 新鲜的标准培养基，混匀后进行细胞计数。</li>
	<li>从孔中移除层粘连蛋白溶液，以 3,000 个细胞/cm2 的密度接种细胞（96 孔板每孔 100 µL）。</li>
</ol>
7. OPC 分化诱导
<ol>
	<li>3天后，移除全部培养基，并加入等体积的少突胶质细胞分化培养基。</li>
	<li>每4天更换一半培养基，并每2天添加新鲜分化混合物（T3/CNTF/NAC）。</li>
</ol>
8. 诱导炎症介导的分化阻滞
<ol>
	<li>神经球解离并形成少突球（第4节）后，向培养基中加入细胞因子混合物，并在整个球体形成阶段使少突球持续暴露于细胞因子中。 
	注意：体积取决于细胞数量，因为成球细胞的接种密度为10–50个细胞/µL。</li>
	<li>如果需要更换培养基，请更换全部体积，并再次加入细胞因子混合物。</li>
</ol>
9. 诱导氧糖剥夺性细胞死亡
<ol>
	<li>在接种细胞后第 -1 天（即细胞接种至多孔板后的第 2 天），移除培养基，并将其保存至新的多孔板中。</li>
	<li>向各孔加入半量体积的无糖培养基（OGD 组）或新鲜培养基（对照组）（对于 96 孔板，每孔加入 50 µL）。使用半量体积的目的是减少液体与空气之间的氧气交换。</li>
	<li>将 OGD 组的培养物置于密闭的低氧培养箱中，箱内充入 95% N2 和 5% CO2 并达到饱和状态。为实现箱内气体饱和，在关闭培养箱管道前，以 25 L/min 的流速通入混合气体 6 分钟。</li>
	<li>将低氧培养箱放入培养箱中孵育 3 小时。对照组以及在步骤 9.1 中已移除并保存培养基的多孔板也应同时置于培养箱中。</li>
	<li>移除无糖培养基（OGD 组）或新培养基（对照组），并重新加入在步骤 9.1 中移除并保存的原培养基。</li>
</ol>
10. 免疫细胞化学
<ol>
	<li>在预定时间点，用预冷的4%多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤两次（每次在室温下孵育10分钟）。</li>
	<li>在室温下用封闭液&#160;（含1% BSA和1%驴/山羊正常血清的0.3% PBS-Triton）孵育1小时。</li>
	<li>加入一抗混合液（表1），用0.3% PBS-Triton稀释，于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用PBS洗涤两次（每次在室温下孵育10分钟）。</li>
	<li>加入二抗（表1）溶液，用0.3% PBS-Triton稀释，并加入Hoechst 33258，在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤两次（每次在室温下孵育10分钟）。</li>
</ol>
11. 细胞活力、谱系组成及谱系特异性细胞死亡的高内涵筛选分析
注意：高内涵筛选的代表性图像和工作流程见图2A,B。
<ol>
	<li>在软件主菜单（HCS Studio v 6.6.0）中选择Compartmental Analysis算法，然后在主菜单Develop Assay/Scan Plate中选择Scan。</li>
	<li>在iDev窗口中，选择New，然后从Develop Assay模板中选择General intensity Measurement Tool。</li>
	<li>在菜单右侧点击Create，并选择10倍物镜。</li>
	<li>这将打开Configure Acquisition菜单。在此窗口中选择以下参数：(a) 通道数量：第一个用于Hoechst核染色（BGRFR_386），其余每个用于反应中使用的谱系特异性标记；(b) 选择软件对通道1进行对焦，并将自动对焦间隔设为1；(c) 从列表中选择培养板型号。</li>
	<li>在采集菜单中，查看不同孔和不同视野中染色的质量，并通过在菜单中选择Fixed Exposure Time手动设置曝光时间。</li>
	<li>设置好采集参数后，在菜单顶部选择Mini Scan，并在每种实验条件下选择两个孔，每个孔选取十个视野。这将允许在整块板的子集视野中设置所有分析参数。</li>
	<li>当迷你扫描完成后，点击Configure Assay Parameter以配置分析算法。</li>
	<li>在窗口右侧点击Configure Groups，拖放迷你扫描的孔位。在Groups子部分中点击Add按钮，以配置不同的组别。</li>
	<li>按照窗口左侧的工作流程逐步进行，以开发完整的算法。首先为每个通道选择Process Image，然后点击Background Removal并选择所需的去除水平。</li>
	<li>首先通过核染色识别并选择细胞核。点击Identify Primary Object – Channel 1以选择真实的细胞核，避免对伪影和碎片进行分析。为此，请放大核染色的代表性图像，检查细胞核是否被软件生成的边界良好包围。可以调整阈值，并应用分割算法以更准确地识别单个细胞核。</li>
	<li>当细胞核被正确定义后，进入下一步：Validate Primary Object。选择Object.BorderObject.Ch1以避免分析每个视野图像边缘的细胞核。选择Object.Area.Ch1，并通过移动直方图上的“low”和“high”滑块，去除所有被识别为碎片或对应于聚集体或伪影的大物体。</li>
	<li>检查所有实验条件下的迷你扫描代表性图像，确保所选参数适用于所有情况。</li>
	<li>对每个对应于特定谱系标记的通道点击Identify Spots，并选择环形参数：宽度（Width）= 3，距离（Distance）= 0。这将有助于识别细胞质荧光。根据细胞密度，这些值可适当调整。软件将自动避免相邻环之间的重叠。</li>
	<li>在工作流程中选择Reference Levels以构建分析。设置参考水平将允许自动计数浓缩细胞核（基于核大小和核染色强度）以及特定标记阳性细胞（基于环识别的细胞质荧光）。</li>
	<li>首先点击Object.Area.Ch1。在迷你扫描图像中选择一个浓缩细胞核，并移动直方图上的“LOW”滑块，将小于该尺寸的所有细胞核标记为“浓缩”。</li>
	<li>点击Object.AvgIntensity.Ch1。在迷你扫描图像中选择一个浓缩细胞核，并移动直方图上的“HIGH”滑块，将荧光强度高于该值的所有细胞核标记为“浓缩”。</li>
	<li>对每个谱系特异性标记通道点击Object.RingAvgIntensity。在迷你扫描图像中选择一个阳性细胞，并移动直方图上的“HIGH”滑块，将荧光强度高于该值的所有细胞标记为“阳性”。</li>
	<li>检查所有实验条件下的迷你扫描代表性图像，确保所选参数适用于所有情况。</li>
	<li>在顶部菜单中选择Population Characterization，然后选择Event Subpopulation。</li>
	<li>作为Type 1事件，从左侧列表中选择ObjectAreaCh1，然后点击AND &#62;按钮，最后选择ObjectAvgIntensityCh1。这将通过面积小且强度高的组合来识别浓缩细胞核。</li>
	<li>在同一窗口中，取消选择所有扫描限制（Scan Limits）。</li>
	<li>在顶部菜单中点击Select Features to Store，以选择分析中需要保留的参数。</li>
	<li>选择Well Features，仅将以下所需参数从左侧列表移至右侧：(a) SelectedObjectCountPErValidField；(b) %EventType1ObjectCount；(c) %High_RingAvgIntensity（针对每个特定谱系标记的通道）。 
	注：该分析将输出总细胞数、浓缩细胞核百分比，以及每种分析标记的谱系特异性阳性细胞占总细胞数的百分比。如果仅需在活细胞中计算不同谱系的百分比，可保留特定通道的“High_RingAvgIntensity”值（阳性细胞绝对数量），并在减去死细胞百分比后重新计算占总细胞数的比例。
	<ol>
		<li>或者，也可通过在细胞核验证步骤（步骤11.11）中使用识别浓缩细胞核的相同参数（步骤11.14–11.15）将死细胞从分析中排除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从顶部主菜单中选择Scan Plate，然后在顶部区域的Scan Setting子菜单中点击培养板图标，以确定待分析的孔位。</li>
	<li>输入实验名称和描述，完成所有设置后，按下play符号开始运行。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

髓鞘形成/再髓鞘化过程及脱髓鞘事件的复杂性使得建立可预测的体外系统极具挑战性。目前最常用的体外药物筛选系统主要是人类细胞系或原代纯少突胶质细胞（OL）培养，而更复杂的共培养或器官型系统正逐渐得到更多应用15。即使结合高内涵技术，纯少突胶质细胞培养在筛选平台开发中仍是首选方法16。
本文所述的自发性混合培养体系是一种有用的体外系统，能够综合考虑所有主要变量：生理性的T3介导的少突胶质前体细胞分化、对该过程产生干扰的病理因素、其他细胞组分以及与年龄相关的差异。该实验流程包含多个变量，这些变量来源于细胞的来源（动物年龄）以及类球体的形成与操作过程。事实上，一个关键步骤是在组织分离后神经干细胞（NSCs）接种时的细胞密度，因为在理想条件下，单个类球体应由单个增殖细胞产生。我们观察到分离后的NSCs倾向于聚集，并且需要依赖自身分泌的旁分泌因子，因此在t25或t75培养瓶中以10–50个细胞/µL的密度接种，是在避免细胞聚集的同时仍允许细胞通过分泌因子进行相互交流的最佳折中方案。
<p cl...

在中枢神经系统（CNS）中，形成髓鞘的细胞（少突胶质细胞，OLs）及其前体细胞（少突胶质前体细胞，OPCs）负责发育期的髓鞘形成过程，该过程发生在围产期和出生后时期，同时也负责成年期的髓鞘更新与修复（再髓鞘化）1。这些细胞具有高度特化性，在解剖结构和功能上与所有其他胶质细胞及神经元成分相互作用，使其成为中枢神经系统结构与功能的基本组成部分。
脱髓鞘事件参与多种中枢神经系统损伤和疾病2，在发育期和成年期主要通过多因素机制作用于少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞（OLs）。未分化的前体细胞在分化因子（主要是甲状腺激素（TH））的驱动下，经历一个同步化的过程3，使OPC能够识别并响应特定刺激，从而诱导其增殖、迁移至无髓鞘轴突，并进一步分化为成熟的OLs，后者继而形成髓鞘4。所有这些过程均受到精细调控，并发生于复杂的环境中。
由于髓鞘形成、再髓鞘化和脱髓鞘过程具有复杂的特性，迫切需要一种简化且可靠的体外方法来研究其潜在机制，并针对主要的细胞参与者——少突胶质前体细胞（OPC）5，开发新的治疗策略。
为了使体外系统具有可靠性，需要考虑多个因素：细胞环境的复杂性、与年龄相关的细胞内在差异、甲状腺激素介导的生理性分化、病理机制以及数据的稳健性6。事实上，该领域尚未满足的需求是建立一种能够模拟体内条件复杂性的模型，而使用分离的纯少突胶质前体细胞（OPC）培养体系尚未成功实现这一目标。此外，脱髓鞘事件的两个主要因素——炎症和缺氧/缺血（HI）——直接涉及其他细胞成分，这些成分可能间接影响OPC的生理性分化与成熟，而这一方面无法在过于简化的体外模型中进行研究。
从一个具有高度预测性的培养体系出发，接下来更普遍的挑战是获得稳健且可靠的数据。在此背景下，基于细胞的高内涵筛选（HCS）是最合适的技术7，因为我们的目标首先是通过自动化工作流程分析整个培养样本，避免人为选择代表性视野所带来的偏差；其次，实现基于成像的高内涵数据的自动且同步生成8。
鉴于主要需求是在体外简化与模拟体内复杂性之间实现最佳平衡，本文介绍了一种高度可重复的方法，用于获取由胎儿前脑和成年脑室下区（SVZ）分离的神经干细胞（NSCs）所衍生的少突胶质前体细胞（OPCs）。该体外模型以生理性的甲状腺激素（TH）依赖方式，涵盖了从多能性NSC到成熟/髓鞘形成少突胶质细胞（OL）的整个OPC分化过程。所获得的培养体系是一个动态分化/成熟系统，可自发形成共培养环境，主要包含正在分化的OPCs和星形胶质细胞，并含有少量神经元。这种原代培养更接近复杂的体内环境，同时由于其来源于干细胞，便于进行简单操作以实现所需细胞谱系的富集。
与使用细胞系或原代少突胶质前体细胞（OPC）纯培养物的其他药物筛选策略相反，本文所述方法能够在复杂的环境中研究病理干扰因素或治疗分子的作用，同时仍聚焦于目标细胞类型。所描述的高内涵筛选（HCS）工作流程可实现对细胞活力和细胞谱系特化、谱系特异性细胞死亡以及形态学参数的分析。

<table><tbody><tr><td>96孔板 - 未处理</td><td>NUNC</td><td>267313</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（100倍浓缩）</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>GIBCO</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>睫状神经营养因子（CNTF）</td><td>GIBCO</td><td>PHC7015</td><td></td></tr><tr><td>无葡萄糖DMEM</td><td>GIBCO</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>GIBCO</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>GIBCO</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Origene</td><td>TP721239</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Origene</td><td>TP723199</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>Origene</td><td>TP723210</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Origene</td><td>TP723240</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>GIBCO</td><td>23017-051</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂（50倍浓缩）</td><td>GIBCO</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>非酶解离缓冲液</td><td>GIBCO</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>血小板源性生长因子（PDGF-AA）</td><td>GIBCO</td><td>PHG0035</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D,L-鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>Origene</td><td>TP720760</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Origene</td><td>TP723451</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752-1G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr></tbody></table>

高内涵筛选分析胎儿与成体神经干细胞来源的少突胶质前体细胞培养物的分化与成熟

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

开发用于评估复杂疾病治疗策略有效性的药物筛选技术时，主要障碍在于如何在体外简化模型与重现复杂的体内环境之间取得平衡，同时实现所有筛选策略共同的主要目标，即获得稳健且可靠的数据，以高度预测体内转化效果。
在脱髓鞘疾病领域，大多数药物筛选策略依赖于永生化细胞系或从新生动物中分离的原代少突胶质前体细胞（OPCs）的纯培养，由于缺乏与年龄相关的差异以及真实的病理状态或复杂性，导致结果存在显著偏差。
本文介绍了一种体外系统的建立方法，旨在模拟神经干细胞（NSC）来源的少突胶质前体细胞（OPC）的生理性分化与成熟过程，并可方便地进行操作以模拟脱髓鞘疾病中典型的病理条件。此外，该方法包括从胎脑和成年脑中分离细胞，构建一个包含星形胶质细胞的自发共培养系统，其中OPC可动态分化为成熟的少突胶质细胞（OL）。该模型在生理上类似于甲状腺激素介导的髓鞘形成及髓鞘修复过程，同时允许引入模拟疾病机制的病理干扰因素。我们展示了如何模拟脱髓鞘疾病的两个主要病理组分（即缺氧/缺血和炎症），重现这些因素对发育期髓鞘形成及成年期髓鞘修复的影响，并在全程中综合考虑系统内所有细胞成分的作用，重点关注OPC的分化过程。
这种自发性混合模型结合基于细胞的高内涵筛选技术，能够为针对脱髓鞘病理过程并促进再髓鞘化的治疗策略，开发出一种稳健且可靠的药物筛选系统。

培养的第一阶段持续时间可能有所不同，具体取决于接种密度以及球体来源于胎儿还是成体。此外，寡球体的群体倍增能力较神经球有所降低。图1B此外，成年组织形成球状体的速度较慢，生成寡球体可能需要2–3周，而胎儿组织可能仅需1–2周，具体时间取决于接种密度。
接种后，可使用谱系特异性抗体监测整个培养物的分化阶段。由于本实验方案的目的是研究分化的最终阶段，因此未展示0 DIV时的培养物组成。然而，在第一阶段培养中，细胞仍呈巢蛋白（nestin）阳性，代表神经前体细胞，且大多数细胞也呈NG2阳性（少突胶质前体细胞，OPCs）11。在T3介导的分化诱导后3–6天可检测到CNPase阳性细胞，对应于前少突胶质细胞（preOL）阶段；而MBP阳性细胞则在6至12 DIV之间出现（成熟少突胶质细胞，OLs；参见图2C中分化阶段结束时的培养物组成）。
HCS 分析通过细胞核染色以及对其...

我们描述了由胎儿或成体神经干细胞分化而来的星形胶质细胞与少突胶质前体细胞的混合培养体系，以及体外模拟有害刺激的方法。结合基于细胞的高内涵筛选技术，可构建一个可靠且稳健的药物筛选系统。

开发用于评估复杂疾病治疗策略有效性的药物筛选技术时，主要障碍在于如何在……之间取得平衡

该方案结合了特定年龄阶段的神经干细胞分离技术，培养出包含正在分化的少突胶质前体细胞和星形胶质细胞的自发性混合细胞体系，模拟病理条件的检测方法，以及稳定且高通量的检测读数。这些特点使得研究人员能够在生理和病理条件下，在充分考虑星形胶质细胞贡献的微环境中，分别研究发育期髓鞘形成和成年期髓鞘再生过程。从胚胎第13.5至14.5天的胎鼠前脑中分离神经干细胞时，将胚胎头部置于盛有冰上预冷PBS的洁净培养皿中，并在显微镜下使用镊子去除颅骨表面的皮肤组织。当脑组织暴露并清除皮肤后，用镊子将脑组织从颅骨中挤出，并去除小脑。用镊子去除脑膜，将分离的组织放入非酶解离缓冲液中。当所有脑组织均分离完毕后，每1.5毫升离心管中加入150微升非酶解离缓冲液，含两到三个样品，并在37摄氏度下持续振荡孵育15分钟。孵育结束后，向每根试管中加入850微升标准培养基，用移液器吹打混匀，直至悬液中无团块。如果仍可见未解离的组织，将样品静置2分钟，使组织沉降到试管底部。当解离完成后，将细胞以每微升10至50个细胞的密度接种于含10至30毫升神经球培养基的T25或T45培养瓶中，并将培养瓶垂直放入细胞培养箱中，以防止细胞贴壁。取自2.5个月大的成年小鼠，将4至5只成年小鼠的脑组织放入盛有冰冻HBSS的50毫升离心管中，取出一只脑组织，腹面朝下，沿头尾方向置于覆盖无菌铝箔的烧瓶上，烧瓶内装有经-20摄氏度过夜预冷的水。用剃刀片切除嗅球，并从大脑皮层至视交叉处切出2至3片厚度为1毫米的冠状切片。将切片腹面朝上置于冷表面上，辨认胼胝体和两个侧脑室。利用放大观察，分离侧脑室的室壁，注意避免包含胼胝体组织碎片，并将分离的组织置于 5 至 10 毫升酶解消化缓冲液中，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育结束后，用移液器反复吹打组织至少 50 次，随后将样品在 37 摄氏度下继续孵育 10 分钟。孵育结束后，加入 5 毫升标准培养基以中和胰蛋白酶活性，并将组织悬液通过 70 微米滤网过滤。将过滤后的溶液在400 × g 条件下离心5分钟，然后将沉淀重悬于蔗糖溶液中进行第二次离心。离心结束后，将沉淀重悬于牛血清白蛋白洗涤液中进行另一次离心，随后将沉淀重悬于标准培养基中进行细胞计数，并将细胞接种至直立式T-25或T-45培养瓶中。对于原代神经球分化，每隔两天向神经干细胞培养物中添加碱性成纤维细胞生长因子和内皮细胞生长因子。当神经球直径达到100至500微米时，根据标准操作规程通过机械解离方法传代细胞。对于少突球分化，每隔两天使用碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子-AA处理细胞。当少突球直径达到100至150微米时，根据标准操作规程通过机械解离法将球体解离，并将细胞悬液以每平方厘米3000个细胞的密度接种至多聚-DL-鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养板上。三天后，将每种培养物的上清液更换为相同体积的少突胶质细胞分化培养基。为了诱导炎症介导的分化阻断，在神经球解离及少突球形成过程中，向培养基中加入感兴趣的细胞因子混合物。为了诱导氧糖剥夺性细胞死亡，在接种至多孔板两天后，将每种培养物的上清液转移至多孔板的各个独立孔中。向孔中加入半量的OGD培养基，将培养物转移至充满95%氮气和5%二氧化碳的密闭低氧培养箱中。将培养箱放入细胞培养孵育器内。3小时后，用先前从多孔培养板中留出的培养基替换培养箱中的培养基。在检查细胞染色质量后，在高内涵筛选软件的“采集”菜单中选择“固定曝光时间”和“快速扫描”，每孔选择10个视野，每种实验条件选择两个孔，以便为整块板设置子集视野的分析参数。按照工作流程逐步操作，建立完整的算法。为每个通道选择“处理图像”，然后单击“背景去除”以选择所需的信号水平。为了通过细胞核染色识别并选择细胞核，请点击“识别初级对象”，调整阈值以识别单个细胞核，然后点击“验证初级对象”，根据对象的面积和位置设定阈值。针对每个对应特定谱系标记物的通道，点击“识别斑点”，并将环宽设为3、距离设为0，以便识别细胞质中的荧光信号。在工作流程中选择“参考水平”以建立分析，从而自动计数基于细胞核大小和细胞核染色强度的浓缩细胞核，以及基于环状区域识别的细胞质荧光来确定的特定标记物阳性细胞，然后点击“运行”。在培养的第一阶段，神经干细胞维持其巢蛋白（nestin）的表达。大多数细胞也呈NG2阳性。在T3介导的分化诱导后3至6天，可检测到对应于前少突胶质细胞阶段的CNP酶（CNPase）阳性细胞，而在体外培养6至12天后，成熟的小麦胚芽凝集素结合蛋白（MBP）阳性少突胶质细胞以显著比例出现。高内涵筛选分析可通过细胞核染色和荧光强度分析，实现对培养物中单个细胞的检测。在分化阶段结束时，培养物的组成因来源为胎儿或成体而有所不同：来源于胎儿的培养物对T3介导的分化反应更敏感，并能达到更高比例的成熟少突胶质细胞。需要注意的是，当由神经干细胞衍生的少突胶质前体细胞以高密度接种时，细胞会发生聚集，同时星形胶质细胞迅速增殖形成融合的细胞层，从而阻碍对成熟少突胶质细胞特征性蛛网状结构的观察。炎症介导的分化阻滞导致前体及成熟少突胶质细胞数量显著减少，这通过胎儿和成年培养物中CNPase和MBP染色结果得以证实。在细胞因子处理的成年培养物中，少突胶质细胞前体细胞的数量增加。尽管胎儿和成年来源的少突胶质细胞前体细胞对炎性细胞因子的暴露表现出相似的反应，但仅胎儿来源的培养物对氧糖剥夺毒性敏感。该方法可与任何类型的少突胶质细胞前体细胞、分化及成熟干扰过程联用，以测试旨在对抗影响髓鞘形成或再髓鞘化疾病的新策略

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

胎儿和成体神经干细胞衍生少突胶质细胞前体细胞培养物的高内涵筛选分化与成熟分析

我们介绍一种基于小分子的方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为少突胶质前体细胞（OPCs）。该方案可在30天内高效地生成Olig2+NG2+的OPCs。我们还描述了一种生成“可放电”OPCs的方法，这类细胞能够产生动作电位。...

胚胎干细胞向少突胶质细胞前体的分化

本文介绍了在原代培养中获得富集的小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的方法，这些细胞可分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）。此外，本文还描述了一种通过将小鼠OPCs接种于小鼠背根神经节神经元（DRGNs）的神经突网络上，以建立小鼠髓鞘形成共培养体系的技术。...

从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

原代人胎儿脑来源的多能性前体细胞增殖 体外...

人胎儿脑来源的前体细胞衍生少突胶质细胞培养体系

本视频演示了从成年小鼠脑组织中分离侧脑室壁并进行酶解组织解离以获得单细胞的详细实验方案。随后，这些细胞在特定培养条件下进行培养，可选择性地促进神经干细胞的增殖，并诱导其分化为少突胶质细胞与星形胶质细胞的共培养体系。...

从成年小鼠神经干细胞获得少突胶质细胞与星形胶质细胞混合培养物

本视频展示了如何从人类胚胎干细胞生成少突胶质细胞前体细胞（OPCs），随后将OPCs成熟为少突胶质细胞。该少突胶质细胞生成过程为改善包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病的研究与治疗开辟了众多途径。...

将人类胚胎干细胞分化为少突胶质细胞

本视频展示了人源诱导神经元（iNs）与诱导少突胶质前体细胞（iOPCs）共培养体系的建立。将iNs与iOPCs混合后进行共培养，并孵育以促进iNs向神经元、iOPCs向少突胶质细胞的成熟。神经元与其他神经元及少突胶质细胞形成突触连接，而少突胶质细胞则在神经元轴突周围发育出髓鞘结构。...

一种用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用的共培养方法

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞。本方案描述了一种从大鼠大脑皮层分离和培养其前体细胞——少突胶质前体细胞的方法，以及一种快速、可靠的定量评估少突胶质细胞生成的方法 体外...

大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外...

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

由于缺乏足够的工具和方法，神经退行性疾病中神经元与胶质细胞之间的相互作用尚未被充分理解。在此，我们描述了从人多能干细胞获得诱导神经元、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞的优化方案，并举例说明这些方法在理解阿尔茨海默病中细胞类型特异性贡献方面的应用价值。...

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

了解利用高内涵筛选技术分析神经干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞分化与成熟的方法。该方案结合细胞培养与药物筛选技术，为研究髓鞘形成和脱髓鞘疾病治疗提供可靠工具。

高内涵筛选分析胎儿与成体神经干细胞来源的少突胶质前体细胞培养物的分化与成熟

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