高内涵筛选分析胎儿与成体神经干细胞来源的少突胶质前体细胞培养物的分化与成熟

该方案结合了特定年龄阶段的神经干细胞分离技术，培养出包含正在分化的少突胶质前体细胞和星形胶质细胞的自发性混合细胞体系，模拟病理条件的检测方法，以及稳定且高通量的检测读数。这些特点使得研究人员能够在生理和病理条件下，在充分考虑星形胶质细胞贡献的微环境中，分别研究发育期髓鞘形成和成年期髓鞘再生过程。从胚胎第13.5至14.5天的胎鼠前脑中分离神经干细胞时，将胚胎头部置于盛有冰上预冷PBS的洁净培养皿中，并在显微镜下使用镊子去除颅骨表面的皮肤组织。

当脑组织暴露并清除皮肤后，用镊子将脑组织从颅骨中挤出，并去除小脑。用镊子去除脑膜，将分离的组织放入非酶解离缓冲液中。当所有脑组织均分离完毕后，每1.5毫升离心管中加入150微升非酶解离缓冲液，含两到三个样品，并在37摄氏度下持续振荡孵育15分钟。

孵育结束后，向每根试管中加入850微升标准培养基，用移液器吹打混匀，直至悬液中无团块。如果仍可见未解离的组织，将样品静置2分钟，使组织沉降到试管底部。当解离完成后，将细胞以每微升10至50个细胞的密度接种于含10至30毫升神经球培养基的T25或T45培养瓶中，并将培养瓶垂直放入细胞培养箱中，以防止细胞贴壁。

取自2.5个月大的成年小鼠，将4至5只成年小鼠的脑组织放入盛有冰冻HBSS的50毫升离心管中，取出一只脑组织，腹面朝下，沿头尾方向置于覆盖无菌铝箔的烧瓶上，烧瓶内装有经-20摄氏度过夜预冷的水。用剃刀片切除嗅球，并从大脑皮层至视交叉处切出2至3片厚度为1毫米的冠状切片。将切片腹面朝上置于冷表面上，辨认胼胝体和两个侧脑室。

利用放大观察，分离侧脑室的室壁，注意避免包含胼胝体组织碎片，并将分离的组织置于 5 至 10 毫升酶解消化缓冲液中，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育结束后，用移液器反复吹打组织至少 50 次，随后将样品在 37 摄氏度下继续孵育 10 分钟。孵育结束后，加入 5 毫升标准培养基以中和胰蛋白酶活性，并将组织悬液通过 70 微米滤网过滤。

将过滤后的溶液在400 × g 条件下离心5分钟，然后将沉淀重悬于蔗糖溶液中进行第二次离心。离心结束后，将沉淀重悬于牛血清白蛋白洗涤液中进行另一次离心，随后将沉淀重悬于标准培养基中进行细胞计数，并将细胞接种至直立式T-25或T-45培养瓶中。对于原代神经球分化，每隔两天向神经干细胞培养物中添加碱性成纤维细胞生长因子和内皮细胞生长因子。

当神经球直径达到100至500微米时，根据标准操作规程通过机械解离方法传代细胞。对于少突球分化，每隔两天使用碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子-AA处理细胞。当少突球直径达到100至150微米时，根据标准操作规程通过机械解离法将球体解离，并将细胞悬液以每平方厘米3000个细胞的密度接种至多聚-DL-鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养板上。

三天后，将每种培养物的上清液更换为相同体积的少突胶质细胞分化培养基。为了诱导炎症介导的分化阻断，在神经球解离及少突球形成过程中，向培养基中加入感兴趣的细胞因子混合物。为了诱导氧糖剥夺性细胞死亡，在接种至多孔板两天后，将每种培养物的上清液转移至多孔板的各个独立孔中。

向孔中加入半量的OGD培养基，将培养物转移至充满95%氮气和5%二氧化碳的密闭低氧培养箱中。将培养箱放入细胞培养孵育器内。3小时后，用先前从多孔培养板中留出的培养基替换培养箱中的培养基。

在检查细胞染色质量后，在高内涵筛选软件的“采集”菜单中选择“固定曝光时间”和“快速扫描”，每孔选择10个视野，每种实验条件选择两个孔，以便为整块板设置子集视野的分析参数。按照工作流程逐步操作，建立完整的算法。为每个通道选择“处理图像”，然后单击“背景去除”以选择所需的信号水平。

为了通过细胞核染色识别并选择细胞核，请点击“识别初级对象”，调整阈值以识别单个细胞核，然后点击“验证初级对象”，根据对象的面积和位置设定阈值。针对每个对应特定谱系标记物的通道，点击“识别斑点”，并将环宽设为3、距离设为0，以便识别细胞质中的荧光信号。在工作流程中选择“参考水平”以建立分析，从而自动计数基于细胞核大小和细胞核染色强度的浓缩细胞核，以及基于环状区域识别的细胞质荧光来确定的特定标记物阳性细胞，然后点击“运行”。

在培养的第一阶段，神经干细胞维持其巢蛋白（nestin）的表达。大多数细胞也呈NG2阳性。在T3介导的分化诱导后3至6天，可检测到对应于前少突胶质细胞阶段的CNP酶（CNPase）阳性细胞，而在体外培养6至12天后，成熟的小麦胚芽凝集素结合蛋白（MBP）阳性少突胶质细胞以显著比例出现。

高内涵筛选分析可通过细胞核染色和荧光强度分析，实现对培养物中单个细胞的检测。在分化阶段结束时，培养物的组成因来源为胎儿或成体而有所不同：来源于胎儿的培养物对T3介导的分化反应更敏感，并能达到更高比例的成熟少突胶质细胞。需要注意的是，当由神经干细胞衍生的少突胶质前体细胞以高密度接种时，细胞会发生聚集，同时星形胶质细胞迅速增殖形成融合的细胞层，从而阻碍对成熟少突胶质细胞特征性蛛网状结构的观察。

炎症介导的分化阻滞导致前体及成熟少突胶质细胞数量显著减少，这通过胎儿和成年培养物中CNPase和MBP染色结果得以证实。在细胞因子处理的成年培养物中，少突胶质细胞前体细胞的数量增加。尽管胎儿和成年来源的少突胶质细胞前体细胞对炎性细胞因子的暴露表现出相似的反应，但仅胎儿来源的培养物对氧糖剥夺毒性敏感。

该方法可与任何类型的少突胶质细胞前体细胞、分化及成熟干扰过程联用，以测试旨在对抗影响髓鞘形成或再髓鞘化疾病的新策略