Name: 研究屈化强化疗法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 了解空化增强疗法的实时监测技术，用于研究药物递送和细胞生物效应。该方法通过被动空化检测器建立空化活动与生物学效应之间的稳健关系。

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作者感谢工程与物理科学研究理事会通过资助项目 EP/L024012/1 对本工作的支持。VB 还获得工程与物理科学研究理事会（EPSRC）和医学研究理事会（MRC）（资助项目 EP/L016052/1）的支持。VB 和 AV 感谢克拉伦登基金会提供的研究生奖学金。AV 还感谢埃克塞特学院提供的桑坦德奖学金。作者对 James Fisk 和 David Salisbury 在仪器制造过程中提供的宝贵帮助深表感谢。作者 также衷心感谢 Dario Carugo 博士和 Joshua Owen 博士在早期 SAT 原型开发中的贡献。

作者无任何利益冲突需要披露。

Apfel 在 1981 年总结了任何声学测量中的关键步骤76，即“了解你的液体，了解你的声场，了解何时发生某些变化”。在本实验方案的背景下，这些要点包括换能器的校准与对准，以及水的制备和气泡处理步骤。首先，用于校准驱动换能器和/或被动空化检测（PCD）系统的水听器本身必须通过定期的外部校准或与参考标准进行内部比对，以确保其校准准确。同样，驱动换能器和 PCD 的响应也需要定期表征，以检查输出是否发生变化和/或灵敏度是否下降。如果系统的驱动条件和接收灵敏度未知，则无法推断出暴露条件、生物效应与声学发射之间的任何有意义的关系。与此直接相关的是，必须仔细检查换能器之间以及换能器与样品腔之间的对准情况，以确保腔内暴露条件符合预期，并且 PCD 的采样体积对应于目标区域。如前所述，悬浮介质的温度和气体含量会显著影响最终结果，因此在这一方面保持一致性极为重要77,78。同样，空化剂悬液的制备、表征和操作也需要高度关注，以确保样品中存在预期的粒径分布和颗粒浓度。例如，如果气泡浓度过高，样品体积将有效屏蔽入射超声场。微泡（MB）试剂特别容易发生破坏和融合，有关其操作的进一步指导可参见 Mulvana 等人（2012）的研究79。
检测空化信号时一个非常常见的问题是难以获得足够的信噪比。这在一定程度上是由于信号本身的特性所致，如前所述，但也可能源于实验装置内部的电噪声源。检查系统各组件之间的连接，特别是涉及同轴电缆的连接，有助于消除部分噪声。必要时应更换或修理同轴电缆。识别并移除或关闭实验室中可能产生电噪声的其他设备（如泵）也有帮助。系统组件之间不良的电学阻抗匹配可能是信噪比差的另一个原因，甚至可能造成设备损坏，因此应仔细检查。同样，应检查信号发生器和示波器的触发设置，以确认其已针对实验正确配置，而非仍处于制造商的默认设置。如果在操作过程中出现气泡严重破坏的情况（例如在使用SAT2时），可在出口端口连接第二个注射器，并用其轻轻抽出液体，从而将悬液吸入腔室。如果需要，这种方法还可帮助消除大尺寸气泡或在超声暴露期间实现液体流动。
无法完全消除样品室内的声学反射，因此入射声场在整个区域内不会完全均匀&#160;样品体积。如步骤1.3.2和1.3.3所述，声学窗口的透射率具有频率依赖性，因此在进行声发射测量时应仔细考虑所需的带宽。特别是高频成分可能会产生显著的多次反射。这也是为什么在完整组装系统内对声场进行校准对于降低入射压力的不确定性极为重要。还应适当考虑对记录信号进行门控处理，以尽量减少多次反射的影响。出于使用便捷性以及对声学透明性的要求，常采用商用装置，但这意味着需牺牲一定程度的光学透明性。这可能会影响后续成像质量，例如对细胞活力或药物摄取的评估。部分商用装置所使用的膜材料还具有多孔性，从而导致样品腔室与周围水浴之间无法完全隔离。与前述情况类似，可通过使用一个较小的子腔室并定期更换其内容物，以降低相应的污染风险。文中提及的细胞培养装置 材料表 主要适用于细胞单层，而此类模型在所有超声/空化介导的生物效应方面可能无法代表真实组织。细胞与固体表面的接近程度也会影响微泡的动力学行为，其影响方式可能无法反映体内实际情况，例如如引言中所述，会促进微流和微射流的产生。然而，通过简单替换为其他组织模型，可克服这些局限性。
提出声学测试系统（SATs）的目的是提供一种改进超声介导生物效应研究中声学暴露条件和声发射可重复性的方法，从而有望促进对潜在机制的更好理解，并推动治疗监测技术的发展，以提高安全性和有效性。该系统设计为与市售的细胞培养装置兼容，可根据具体应用开展多种生物学检测，并支持高通量实验，避免了每次实验之间耗时的对准操作。通过标准化暴露条件表征和声发射采集的实验方案，有望降低因系统差异带来的变异性。针对特定实验所需探索的参数范围将取决于具体应用（期望的生物效应、细胞类型、体内实验中靶组织的深度等）以及所用空化剂的性质。鉴于变量众多（超声频率、压力幅值、脉冲长度、脉冲重复频率等），全面探索整个参数空间通常难以实现。本方案的一个优势在于能够快速确定该参数空间的边界范围。例如，可确定产生空化信号所需的最低压力、导致细胞脱落或死亡前可使用的最大压力或脉冲长度，以及产生分数谐波或宽带噪声的压力阈值。建议在任何研究的初始阶段均应首先进行此类范围探索性测量。
如上所述，SAT 装置旨在实时监测声学发射，而生物学检测则在实验之外进行。然而，对 SAT 稍作改造即可通过显微物镜直接光学观察样品腔。该改造可进一步与荧光和/或高速显微系统耦合，从而实现对药物摄取和气泡动力学等过程的观察。目前以电压形式呈现的 PCD 输出信号表明：i）空化行为的类型及其相对比例；ii）这些空化行为持续的时间；iii）观察到的时间累积暴露特性是否与特定生物效应相关；iv）相对强度及时间依赖性行为是否与暴露系统先前实验的结果一致。尽管可以量化 PCD 的接收灵敏度，但若要可靠地以绝对能量表征声学发射，还需额外的空间信息。这可通过用阵列探头替代 PCD 来实现被动声学映射（PAM）80。然而，这种方法将增加信号处理的复杂性以及所需的计算时间和计算资源。
也可整合其他用于测量膜电导率或实施物理靶向方法（例如磁场）的仪器。此外，可使用三维组织结构（如肿瘤球状体、类器官，甚至离体组织样本）替代细胞单层，将其置于声学“软”凝胶基底上，以在更接近真实的组织环境中研究超声及空化介导的效应。

超声（US）因其安全性高、无创、可在患者床旁便捷实施以及成本效益良好，已被广泛用作诊断成像技术1。除了其诊断和监测能力外，超声在治疗应用方面也具有巨大潜力。早期研究探索了其在溶栓、DNA转染和药物递送中的应用2,3,4，目前治疗性超声已成为一个非常活跃的研究领域，应用包括肿瘤治疗5,6,7、免疫治疗8,9、血脑屏障（BBB）破坏10,11,12、溶栓13,14,15以及细菌感染治疗16,17。支撑这些应用的一个关键现象是空化效应：由于流体压力变化引起的气体空腔的成核、生长和振荡18,19。
空化产生生物学效应的机制多种多样。例如，在外加超声场作用下，气泡振荡具有高度非线性特征，可在周围液体中引发微流，从而增强药物对流20，并对气泡附近组织施加剪切应力。当气泡靠近边界时，这种现象尤为显著，会导致气泡非球形振荡，可能通过剪切力诱导的通透性增加促进药物摄取21,22,23,24。在较高声压下，气泡出现更大振幅的振荡并迅速崩塌，产生直接的机械应力25，常伴随激波的生成以及随之而来的大压力梯度&#160;，可破坏组织并提高其通透性26,27。靠近表面的气泡崩塌还可能形成高速液体微射流28,29,30。这些微射流可穿透组织，可能形成孔隙或引发二次应力波31,32。生物膜在组织和细胞水平上的通透性增加，通常被称为“声促渗透”（sonophoresis），主要用于描述超声诱导的皮肤通透性增强33,34；或称为“声孔效应”（sonoporation），主要用于描述因细胞膜上形成孔隙而导致的细胞膜可逆性通透35,36。
振荡气泡周围液体中的黏性吸收可产生显著的加热效应37。此外，高度非线性的振荡会产生高于驱动超声&#160;场频率的声辐射，导致周围组织吸收增强，从而进一步加热38。气泡塌陷还可能伴随化学效应，这是由于气泡核心内瞬时的高温和高压所致，例如产生活性极强的物质以及电磁辐射，后者被称为声致发光32。这些效应已被研究用于评估对相关细胞通路在递送过程中可能造成的损伤和/或激活作用39，并被应用于一种称为声动力疗法的方法中，以实现对光敏药物的局部激活40,41,42,43。
许多超声介导的生物效应可能仅通过调控超声场参数（压力振幅、频率、脉冲长度和重复频率以及暴露时间）即可引发，但在生物组织中可靠地产生&#160;空化效应通常需要较高的输入能量，因而带来更高的损伤风险。引入外源性或人工的空化核可显著降低产生上述广泛效应所需的输入能量，并进一步引入仅使用超声难以实现的额外效应。空化核包括气体微泡26,44、液体液滴45,46,47以及固体颗粒48,49,50，其中纳米尺度的空化核因其在延长血液循环时间、改善血管外渗及延长空化活性方面的优势，正成为一个新兴的研究领域49,51,52,53。
最常用的成核剂是气体微泡（MBs），最初被用作诊断成像中的对比剂。它们的直径通常为1-2微米，核心由一种分子量较高、在周围介质中水溶性较低的气体组成。核心外部包裹着一层保护性的脂质、蛋白质或聚合物外壳，最常见的是由以下成分构成&#160;磷脂54当暴露于超声场时，微泡的可压缩性使其发生体积振荡，从而产生&#160;强烈的声学散射，这是微泡作为对比剂成功应用的原因。如前所述，这些振荡还会产生上述机械、热和化学效应，可在治疗应用中加以利用。微泡的包覆过程还提供了一种将药物包裹于微泡结构内部，以及将药物和（或）靶向分子连接到微泡表面的机制。该技术有助于实现药物的触发释放，从而降低全身毒性55最近还发现，微泡表面的物质可能转移到生物结构上，通过所谓的“声学印迹”（sonoprinting）增强药物递送。56,57,58.
监测超声介导的空化活性可以深入了解其在体外和体内的生物学效应，并有望实现对这些效应的调节与优化。目前应用最广泛的两种空化活性监测方法为：i）光学方法，采用超高速视频显微技术；以及 ii）&#160;在体内通常不可行; 以及 ii) 声学方法，用于记录&#160;振荡和/或溃灭气泡所产生的二次辐射声场。声学信号的幅度和频率成分均包含有关气泡行为的信息。研究表明，在较低的超声入射振幅下，低浓度气泡主要产生谐波发射（驱动频率的整数倍）。59随着驱动压力的增加，气泡发射谱中还可能包含被称为次谐波和超谐波的分数成分。60 表明更强的非线性行为以及宽带噪声，这&#160;表明存在惯性空化。整数谐波是主要指标&#160;气泡振荡的非线性效应可能源于实验系统中任何部位的非线性，例如由非线性传播引起；相比之下，分数谐波和宽带噪声与气泡动力学具有极强的相关性。
气泡行为与检测到的声学发射之间的关系可能受到多种因素的影响，包括入射超声场、成核环境以及检测通路的特性60。尽管如此，通过分析声学频谱中频率和能量的变化趋势，仍可获得有关气泡行为及其与细胞相互作用的重要信息。这些数据还可提供有价值的信息，用于建立临床治疗监测技术的基础。为了充分挖掘这些信息，需要开发出可靠、可转化且可重复的实验方法。
目前，在设计系统和开展研究以支持空化辅助治疗技术开发的报道方案中，存在显著差异。在装置方面，已采用多种不同的设计方法。一些研究团队使用了平行板腔室56,61,62,63，这些腔室或是定制制造，或是商业可得（例如 OptiCell，ThermoFisher Scientific）。Hu 等人&#160;(2013) 开发了一种与超声辐照模块耦合并支持实时共聚焦成像的细胞腔室64；Carogo 等人 (2015) 使用了一套系统，该系统包含一个商用细胞培养皿和一个定制的聚二甲基硅氧烷（PDMS）盖子，以便在超声暴露期间将装置浸入水浴中65；Pereno 等人 (2018) 则使用了一种由多层声流体谐振器构成的装置，可同时对气泡动力学及气泡-细胞相互作用进行光学和声学表征66。由于广泛采用定制化和特定应用的设计，导致超声场及其他环境暴露条件的表征变得复杂，使得不同研究之间的比较十分困难。例如，在实现有效声孔效应（sonoporation）所确定的超声参数方面存在较大差异，包括中心频率范围从 0.02 至 15 MHz，占空比从 1% 到连续波，以及负压相压力范围从 0.1 至 20 MPa23,64,67,68,69,70（表 1）。同样，在已被识别为与特定生物效应相关的频谱成分（如谐波、次谐波等）方面也存在显著差异。
因此，本研究的目的是提供一个易于重复的系统设计与实施框架，用于体外研究空化效应诱导的细胞生物效应，并特别包含空化监测功能。

<table><tbody><tr><td>吸收体</td><td>Precision Acoustics</td><td>APTFlex F28 panel</td><td>1.0 cm 标准厚度</td></tr><tr><td>功率放大器</td><td>E&amp;I Ltd.</td><td>1040L</td><td>400W 功率放大器，用于驱动超声波源</td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR445A</td><td>固定增益多级前置放大器，用于 PCD 信号</td></tr><tr><td>水族箱加热器</td><td>Aquael</td><td>Ultra 50W</td><td>不同型号适用于不同尺寸的水族箱</td></tr><tr><td>数字化仪</td><td>TiePie Engineering</td><td>HS5-110-XM</td><td>扩展内存选项：每通道 32M 点</td></tr><tr><td>水听器</td><td>Precision Acoustics</td><td>FOH</td><td>敏感区域直径为 0.01 mm，可最大程度减少指向性效应</td></tr><tr><td>微泡造影剂</td><td>Bracco</td><td>SonoVue</td><td>经 FDA 批准的微泡</td></tr><tr><td>PCD 反射镜（SAT3）</td><td>Olympus NDT</td><td>F-102</td><td>90 度光束反射</td></tr><tr><td>PCD 换能器</td><td>Olympus NDT</td><td>V320-SU</td><td>浸入式换能器，7.5MHz</td></tr><tr><td>PCD 防水电缆</td><td>Olympus NDT</td><td>BCU-58-1 W</td><td></td></tr><tr><td>PDMS（SAT2 腔室盖）</td><td>Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>制备方法参见 Carugo 等（2015）</td></tr><tr><td>聚合物棒（SAT2 密封件）</td><td>Zeus</td><td>PTFE 单丝</td><td></td></tr><tr><td>橡胶塞（SAT3 盖/密封）</td><td>VWR</td><td>391-2101</td><td>底部直径 6mm，顶部直径 8mm，红色</td></tr><tr><td>信号发生器</td><td>Agilent</td><td>33250</td><td>用于超声波源的波形发生器</td></tr><tr><td>细胞暴露腔室基底，SAT2</td><td>Ibidi</td><td>&amp;micro;-Dish 35mm</td><td></td></tr><tr><td>细胞暴露腔室基底，SAT3</td><td>Corning</td><td>Transwell 6.5mm</td><td></td></tr><tr><td>超声波源（SAT3）</td><td>Sonic Concepts</td><td>H107 带中心孔</td><td>使用具备 HIFU 能力的声源，可在焦点及焦点前区域产生 &gt;1MPa 的压力，从而实现更广的空间覆盖范围</td></tr></tbody></table>

研究空化增强治疗

Studying Cavitation Enhanced Therapy

人们对超声波治疗应用的兴趣显著且持续增长，潜在的临床应用目标涵盖从癌症到阿尔茨海默病等多种疾病。空化——即在超声场中气泡的形成及其后续运动——是支撑许多此类治疗的关键现象。然而，关于空化促进治疗效应的具体作用机制仍存在较大不确定性，且亟需开发可在临床实施的可靠监测技术。特别是，不同研究之间在报告产生治疗效应的有效暴露参数及其相应声学发射特征方面存在显著差异。本文旨在提供一套使用广泛可获取组件进行空化介导生物效应研究的设计指南和实验方案，并&#160;包含实时声学监测。希望该方案能够推动声学监测更广泛地应用于治疗性超声实验中，并促进不同研究间暴露条件及其与相关生物效应关联性的更便捷比较。

图4展示了时间域和频率域PCD响应的示例，说明了三种不同的空化行为。所有数据均在SAT3上采集，使用SonoVue微泡以PBS稀释5倍，终浓度约为~2×107 个微泡/mL。本节所有示例的温度为19 ± 1 °C。超声源以0.5 MHz、2.0 ms脉冲驱动，以实现0.20（图4A和4B）、0.30（图4C和4D）和0.70 MPa（图4E和4F）的入射负压峰值。信号记录从超声脉冲t = 0开始前1.4 ms启动。插图显示了记录的信号（红色）以及2 MHz高通滤波后的信号（蓝色），时间窗口中心位于超声源到细胞暴露腔室再到PCD的飞行时间点。在此时间之前的低水平响应是由于PCD直接接收到来自超声源的辐射所致，这在PCD位于超声源后方的配置中较为常见。
在最低入射压力下，PCD响应完全由0.5 MHz基波超声频率的整数谐波组成。当压力从0.20 MPa增加到0.30 MPa时，频谱中除了进一步增强的整数谐波外，还出现明显的超谐波。在这两种压力下，时域波形看起来相似，但0.30 MPa条件下的结果在整个脉冲持续时间内表现出更大的波动性。在最高压力下，由于频谱中明显增强的宽带噪声，时域波形的幅度相对于较低压力呈非线性增长。这种噪声通常被认为是惯性空化所致，在本示例中对应微泡（MBs）的破坏。
为了更清楚地说明这一点，图5展示了随时间变化的PCD响应。在左侧面板（图5A）中，显示了在50秒曝光时间内获得的完整光谱，期间光源每0.20秒发射一次持续2.0毫秒的脉冲。相应的总功率、谐波功率和宽带功率如右侧面板（图5B）所示。超声（US）在t = 3.0 s时开启，此时观察到大幅值的宽带响应。初始尖峰被认为对应于悬浮液中最大气泡的破裂（SonoVue具有多分散性），这在包壳气泡的空化实验中是一种常见现象，甚至在未脱气介质（例如PBS）中也能观察到。
数秒后，宽带响应迅速减弱，显然是由于气泡破裂所致，此时信号主要由谐波组成。这表明释放出的气体和残留的微泡正在稳定地非惯性振动。在 t~50 s 时，宽带成分已下降至原始背景噪声的水平。因此，在研究不同气泡效应作用于腔室内细胞的时间尺度时，此类暴露实验至关重要。
气泡在超声辐射力的作用下可能发生移动，微泡进出PCD视野范围的运动可能导致监测到的空化信号变异性增加，尤其是在处理稀释悬液时。因此，PCD的敏感区域应尽可能覆盖更多的细胞暴露表面。对具有相同中心频率的聚焦与非聚焦PCD响应的比较（参见 图2) 如图所示 图6，使用正常PBS对MBs进行20:1稀释后检测SAT2。图中所示时间为样品平均光谱 图6A 表明非聚焦的 PCD 具有更强的宽带响应，同时在谐波中表现出降低的样品间变异性图 6B）以及超谐波功率（图6C).
需要注意的是，用于体外细胞实验的培养基通常未经脱气处理，可能会表现出增强的气泡背景信号。图7展示了供应商提供的磷酸盐缓冲液（PBS）在使用前及其经真空脱气两小时后的SAT2响应，脱气后通过光学传感器（PreSens，德国）测定其空气饱和度从92%降至46%。图7A中的光谱数据为五个独立样本在曝光时间和重复次数上的平均值，清楚地显示出常规PBS中存在显著升高的超谐波信号。在三个谐波范围内累加的功率值（图7B）均处于各实验结果的标准偏差范围内。相比之下，图7C中的超谐波累加结果显示，常规PBS的信号水平高出近一个数量级，且样本间的变异性显著更高。这些实例表明，一种常见的与细胞兼容的介质可能表现出类似微泡（MBs）存在的特征行为，从而可能导致误判。由于脱气处理通常不适用于培养基（因其可能对细胞或空化剂稳定性产生负面影响），因此在任何与空化相关的研究中，进行适当的对照实验至关重要。
<img alt="超声暴露室示意图；包括PCD、细胞腔室、吸收器、光学装置。" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：两种整合了空化监测功能的超声暴露系统设计示意图：SAT3（D-F）。（A）SAT2带注释的组件图，移除侧壁以增强可视性。（B）完整侧壁的SAT2。（C）SAT2细胞暴露腔室，已拆解。（D）SAT3带注释的组件图。（E）SAT3在正常（左）和聚焦（右）配置下的示意图，用于在不同频率下匹配声束宽度。（F）SAT3细胞暴露腔室，已拆解。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

<img alt="超声波束模式；非聚焦与球面聚焦，频率响应图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：直径为 12.7 mm 的非聚焦（左）和球面聚焦（右）换能器的半幅压力场等高线计算结果。在坐标原点（0,0）处的 PCD 元件上，2 MHz、4 MHz 和 8 MHz 的频率分别以红色、蓝色和绿色等高线表示。非聚焦器件的最外层等高线对频率相对不敏感，但内部结构具有频率依赖性。随着频率升高，球面聚焦场的等高线范围收缩，但在等高线内部，声场变化平滑。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="带有PCD、滤波器、前置放大器和波形发生器设置的超声信号处理示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：空化信号调理与记录（蓝色箭头）、超声源激励（红线）及数据采集触发的仪器装置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示电压随时间变化及频率谱的声学信号处理图，用于噪声分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用 PBS 稀释 5 倍的微泡（MBs）记录的时域（左）和频域（右）PCD 响应。入射峰值负压分别为 (A, B) 0.2 MPa、(C, D) 0.4 MPa、(E, F) 0.7 MPa，所有压力均在 0.5 MHz 下施加。信号记录从持续时间为 2.0 ms 的超声脉冲起始时间 t=0 前 1.4 ms 开始。(A, C, E) 时域信号（红色）以固定的垂直刻度显示，表明响应强度随入射压力的变化情况。插图显示了记录的信号（红色）以及在从声源到细胞暴露腔室再到 PCD 的飞行时间中心时间窗内应用 2 MHz 高通滤波后的信号（蓝色）。(B, D, F) 分别计算 t&lt;0 和 t&gt;0 时的噪声与信号功率谱密度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示频率随时间变化的频谱图和功率分析图；总功率、谐波功率和宽带功率数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：MBs 悬液在 PBS 中稀释5倍后，50秒暴露时间内的频谱变化。（A）全频谱，以及（B）总信号功率、谐波信号功率和宽带信号功率随时间的变化。驱动条件为：0.5 MHz，峰值负压0.7 MPa，脉冲持续时间2.0 ms，脉冲重复周期200 ms。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="聚焦与非聚焦超声分析；频率和时间图；功率谱密度，谐波。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：在正常PBS中以20:1稀释微泡时记录的PCD聚焦几何效应。驱动条件为：1.0 MHz，0.50 MPa峰值负压，3.0 ms脉冲持续时间，10 ms脉冲重复周期。（A）在暴露时间内及三次独立样本重复中取平均的全谱。（B）3、4和5 MHz谐波的功率，以及（C）2.5、3.5和4.5 MHz超谐波的功率。粗线表示样本均值，阴影区域表示±1个标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="功率谱密度与谐波功率分析图；PBS、脱气PBS、背景比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：使用PBS记录的脱气培养基的影响。（A）在曝光时间内及五次独立样本重复实验中取平均的全谱。（B）3、4 和 5 MHz 谐波的功率，以及（C）2.5、3.5 和 4.5 MHz 次谐波的功率。粗线表示样本均值，阴影区域表示±1个标准差。驱动条件为1.0 MHz、0.50 MPa 峰值负压、1.0 ms 脉冲持续时间、200 ms 脉冲重复周期。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>单位</td>
			<td>最小值</td>
			<td>最大值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>频率</td>
			<td>MHz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>压力（峰值负压）</td>
			<td>MPa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脉冲长度</td>
			<td>周期</td>
			<td>1</td>
			<td>CW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>占空比</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>CW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>暴露时间</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：促进声孔效应的已报道参数范围汇总 体外.

本实验方案可用于在细胞培养装置中实时测量空化活性，旨在探究实现成功药物递送和/或其他生物效应所需的条件。

人们对超声波治疗应用的兴趣显著且持续增长，其潜在的临床应用范围广泛，从癌症到……

这些台式系统的设计、数据采集与分析原理可作为体外研究空化增强治疗的合理基础。我们的技术能够在保持空化间歇监测、可重复的样品定位以及与常规细胞分析方法兼容等关键实验特性的同时，实现高通量检测。空化增强治疗具有多种潜在应用，包括癌症和中风等疾病的治疗。通过更深入地理解其基本机制，我们可以开发出更有效的治疗方法。本研究提供了一个易于重复的系统设计与实施框架，可用于研究多种由空化效应诱导的细胞生物效应，包括药物递送、声孔效应和声打印技术。获得有意义的结果需要确保实验的可重复性，并对所有变量进行控制。必须进行所有相关对照，并测量电噪声。在准备声学转染系统时，需将填充液体在100 kPa压力下脱气至少两小时，以最大限度降低声波传播路径中发生空化的可能性。建议使用溶解氧探头确认氧气分压低于10 kPa。缓慢填充测试腔，以最大限度减少空气重新进入脱气液体，并立即清除换能器和培养基容器表面残留的气泡。根据制造商的建议，使超声源功率放大器预热，以确保增益和输出随时间保持稳定。在轻轻且持续搅拌的同时稀释空化剂，以制成均匀的悬浮液，避免截留宏观气泡或破坏空化剂。处理微泡时，务必小心操作。在准备SAT2时，实验开始前，使用乙醇对PDMs盖子进行灭菌。将灭菌后的盖子压合到培养皿上，形成细胞培养腔室。取一支10毫升注射器，安装18号钝头针头，并吸入10毫升填充液。将针头插入PDM的其中一个填充孔，同时倾斜装置，使大尺寸气泡能从开放的填充孔中逸出，缓慢注入液体以填充腔室。当腔室充满后，将一根4至5毫米长的聚合物棒插入开放孔中，并将组件摆放至填充孔处于水平方向的位置。在注射额外液体的同时拔出针头，以防止空气被吸入腔室，然后用另一根聚合物棒封闭填充孔。目视检查腔室，确认是否存在截留的大气泡，并将细胞暴露室压入腔室支架中。在确定细胞暴露室的安装方向时，需考虑悬浮颗粒的浮力及其对颗粒与细胞接触的影响。然后以水平角度降低腔室盖，以防止大气泡停留在设备的浸没部分，将盖子安装到腔室顶部。在进行实验测量之前，使悬浮液与腔室温度达到热平衡。使用细针式热电偶确认腔室内的温度已稳定。为了在时间和频率域中实时监测实验，启动数据采集过程并打开超声源驱动信号。在整个实验过程中，使用高压探头监测驱动超声源的放大器输出信号，以确保暴露过程按预期进行。同时确保示波器已设置为补偿探头的衰减。被动空化检测器的时间域监测可揭示信号是否与当前仪器设置相匹配，以及空化信号是否早于预期出现。频域监测可实现对气泡行为类型的分析，并可根据需要调整驱动水平，以达到所需的细胞刺激效果。在本分析中，在最低入射压力下，被动空化检测器的响应完全由0.5 MHz超声基波频率的整数谐波组成。压力从 0.2 MPa 增加到 0.3 MPa 时，频谱中除进一步增强的整数谐波外，还出现了明显的超谐波。在这两个压力下，时域波形相似，但 0.3 MPa 的结果在脉冲持续时间内表现出更大的变异性。在最高压力下，由于明显增强的宽带噪声（可能由微泡破裂引起的惯性空化所致），时域波形的幅度相对于较低压力呈非线性增长。在此，展示了在50秒曝光时间内记录的完整光谱，期间光源每0.2秒发射两次毫秒级脉冲。如本图所示，对应总谐波和宽带功率的变化，初始尖峰伴随产生大幅值的宽带响应，该尖峰被认为与最大气泡的破裂相关。数秒后，宽带响应迅速减弱，这显然归因于气泡的破坏。在使用微气泡与正常PBS按20比1稀释的分析中，时间和样本平均谱显示，未聚焦的被动空化检测器比聚焦检测器具有更强的宽带响应，同时在谐波和超谐波功率方面表现出更低的样本间变异性。空化诱导的生物效应可通过荧光显微镜、流式细胞术或生物测定等技术进行评估。这使得空化活性与生物学效应之间的稳健关系得以建立。该技术帮助我们更深入地识别气泡行为与生物学效应之间的关联，揭示了空化介导药物递送背后的一些潜在新机制。

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研究屈化强化疗法

微泡的超声辐照是一种有前景的策略，可在降低的时间平均声功率下实现肿瘤消融，并实现治疗药物的靶向递送。本研究的目的是开发低占空比的超声脉冲策略和纳米载体，以最大程度地实现非热性微血管消融，并将载药递送至皮下C6胶质瘤。...

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超声靶向微泡破坏技术（UTMD）可用于将生物活性分子（包括治疗性基因）特异性递送至超声可及的靶器官，例如心脏和肝脏1-6。...

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通过一种新颖的方法，即在有或无化疗药物预处理白血病细胞和正常造血细胞的情况下应用低频超声，可实现对人类白血病细胞的选择性损伤。...

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一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

本方案通过同时使用近红外脉冲激光和高强度聚焦超声（HIFU）照射凝胶模型，实现了空化成核的可控诱导。所产生的空化效应可用于增强HIFU的成像效果和/或治疗应用。...

通过等离子体金纳米颗粒可控成核空化以增强高强度聚焦超声应用

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一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

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使用高速相机和图像分析对快速移动微泡区域进行成像与量化

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利用等离激元与光子晶体纳米结构增强微米和纳米粒子操控

了解空化增强疗法的实时监测技术，用于研究药物递送和细胞生物效应。该方法通过被动空化检测器建立空化活动与生物学效应之间的稳健关系。

研究空化增强治疗

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