Name: 将人类成纤维细胞直接重新编程到肌细胞中，以研究神经肌肉疾病的治疗方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解将皮肤成纤维细胞直接重编程为肌母细胞并分化为肌管的方法，用于研究神经肌肉疾病的病理机制和测试治疗策略。该技术比iPSC技术更快速高效。

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我们感谢 Vincent Mouly 博士此前在该模型方面分享的知识。本研究得到了美国国立卫生研究院神经疾病和中风研究所（R01 NS043264（K.M.F. 和 R.B.W.））以及美国国立卫生研究院关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）（P50 AR070604-01（K.M.F.、K.M.、R.N. 和 N.W.））的资助。N.W. 获得了俄亥俄州立大学/全美儿童医院肌肉研究组和 Philippe 基金会的博士后资助。本研究还得到了机构内部自主资金的支持，其中部分外显子2跳跃研究工作也获得了 CureDuchenne（K.M.F.）和法国肌病协会的资助。IRB 编号：IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 和 IBCSC#: IBS00000123。

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<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+Validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+duchen%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen.</a> Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).</li>
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<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Skipping+of+Single+Exon+Duplications+in+DMD+Patient-Derived+Cell+Lines+Using+an+Antisense+Oligonucleotide+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).</li>
<li>De Angelis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+snRNA+molecules+carrying+antisense+sequences+against+the+splice+junctions+of+exon+51+of+the+dystrophin+pre-mRNA+induce+exon+skipping+and+restoration+of+a+dystrophin+synthesis+in+%CE%9448-50+DMD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).</li>
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<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
</ol>

Nationwide Children's Hospital 已将本文所述的外显子2跳跃项目授权给 Audentes Therapeutics。K.M.F. 和 N.W. 因此项授权获得了特许权使用费。

为了获得高质量的FM细胞系，某些步骤至关重要。皮肤活检样本的处理越及时，获得健康成纤维细胞的可能性就越大。成纤维细胞培养的传代次数也很重要。原代细胞的增殖能力有限，经过多次传代后会进入复制性衰老状态。因此，最好储备低传代次数的成纤维细胞，并尽可能在最早传代阶段进行细胞转化。
另一个重要步骤是获得具有最高纯度和准确定量的病毒制备物。例如，使用qPCR进行病毒基因组定量可提供合理的测量结果，但采用ddPCR（数字滴定PCR）定量更为准确。
此外，成纤维细胞达到适当的汇合度对于成肌细胞转化至关重要。如果细胞汇合度低于70%或高于80%，成肌分化可能会受到影响。若细胞过于密集，肌管将出现多层叠加，干扰染色与成像。多西环素的浓度对于Myod基因的正确激活和持续表达极为关键。每次更换培养基时，必须立即加入多西环素，因其在培养基中稀释后于4 °C保存会迅速降解。多西环素储存液应以1000倍浓度保存于-20 °C，并避免光照。解冻后的分装样品不得再次冷冻。严格遵循这些操作细节，对于确保实验的可重复性、并区分因基因突变导致的分...

直接从人体组织获取的细胞模型可用于模拟多种人类遗传性疾病，其优势在于保留了原始的基因组背景，并且在许多情况下能够重现患者中观察到的相同分子和细胞特征。在神经肌肉疾病领域，肌肉活检一直是获取人源成肌细胞的重要来源，并有助于阐明疾病的病理机制。此外，它们也是研究中的重要工具，用于 体内 药物和基因治疗的测试。一方面，从肌肉组织碎片中分离成肌细胞相对容易；另一方面，由于原代成肌细胞增殖能力有限且易发生复制性衰老，其培养与维持较为困难 体外1克服这些局限性的另一种方法是通过导入人端粒酶（human telomerase）使成肌细胞永生化。hTERT）和/或细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4基因2,3，同时保留骨骼肌特征4然而，原代成肌细胞的获取仍然依赖于肌肉活检，这是一种对患者具有不利影响的外科手术，而在许多情况下，患者的肌肉已处于严重的退变状态。因此，这些患者的肌肉组织中含有较大量纤维化和/或脂肪组织，所能获得的肌肉细胞数量较少，故在永生化之前需对细胞进行预先纯化。
与肌肉活检相比，皮肤活检更易于获取，且对患者的伤害更小。可在体外（in vitro）从皮肤组织碎片中分离获得原代成纤维细胞。尽管成纤维细胞并非神经肌肉疾病相关突变的主要受累细胞，但其可被转分化为成肌细胞。这一过程可通过导入Myod基因实现，该基因编码一种成肌调节转录因子5。在本论文中，我们描述了从建立成纤维细胞培养到获得分化后的肌管细胞的完整转分化成肌细胞实验方案（该方法的代表性流程图如图1所示）。
治疗策略的临床前测试依赖于携带与人类患者相似突变的细胞和动物模型。尽管随着CRISPR/Cas96等基因编辑技术的发展，动物模型的构建已变得更加可行，但仍具有挑战性且成本较高。因此，来源于患者的细胞系成为一种易于获取的模型选择，可用于涵盖杜氏肌营养不良症（DMD）等疾病中广泛存在的各类突变。获取和建立细胞模型对于此类疾病的个体化治疗研发至关重要。
在已研究的个性化治疗策略中，外显子跳跃技术是针对不同类型肌营养不良症的有前景的方法之一7,8。该策略旨在产生一种长度较短但具有功能的蛋白质，其原理是通过掩盖突变外显子在剪接体中的识别信号，使其在最终的信使RNA中被排除。这一技术极具前景，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）对杜氏肌营养不良症（DMD）治疗的批准。因此，本实验方案还描述了使用两种不同的外显子跳跃相关技术转染成肌细胞的方法：反义寡核苷酸（AON）和U7小核RNA-腺相关病毒（AAV）。AON转染是初步筛选多种设计用于促进外显子跳跃序列的有效工具9。然而，AON的作用是短暂的。为了实现反义序列的持续表达，我们还探索了将小核RNA（snRNA）与AAV相结合的方法，从而实现核内定位并整合入剪接机制10。U7是一种参与组蛋白mRNA加工的小核RNA，可通过基因工程改造使其结合特定蛋白，从而被重新定向至剪接体并递送反义序列11。将修饰后的U7 snRNA与AAV载体联合使用，可克服AON的局限性，实现反义序列的长期表达，并提高对目标组织的转导效率12。本方案采用来源于DMD患者的细胞，以展示外显子跳跃策略的应用。

<table><tbody><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X 转膜缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-乙酸 SDS 电泳缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8% Tris-乙酸凝胶</td><td>Thermo Fisher</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>75 cm² 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>抗肌球蛋白重链（肌节）抗体</td><td>Developmental Studies Hybridome Bank</td><td>MF20 上清液</td><td>稀释比例 1:50</td></tr><tr><td>抗氧化剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3571</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Millipore Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX 添加剂和丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 试剂盒 (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 人源引物</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG&lt;br/&gt; TTTCTC 3'</td><td>Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC&lt;br/&gt; CTGT 3'</td><td></td></tr><tr><td>抗肌营养不良蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 标记二抗</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶抑制剂混合液 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>Thermo Fisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II CC2 培养腔室载玻片系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR 基底膜基质</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>Thermo Fisher</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜 0.45 &amp;micro;m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清对照</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 封闭缓冲液 (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>Western 印迹封闭缓冲液</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PCR 预混液</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 双色蛋白标准品</td><td>Bio Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 总蛋白染色试剂（用于 Western 印迹归一化）</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid 逆转录试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Aspen Surgical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>骨骼肌细胞分化培养基</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>骨骼肌细胞生长培养基</td><td>Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

对肌营养不良症的病理生理学及治疗靶点的研究，因人类成肌细胞增殖能力有限而受到阻碍。尽管已建立多种小鼠模型，但这些模型要么不能真实反映人类疾病的病理生理特征，要么无法代表人类中广泛存在的突变谱。永生化人原代成肌细胞是克服这一局限性的替代方案；然而，该方法仍依赖肌肉活检，而肌肉活检具有侵入性且不易获取。相比之下，皮肤活检更容易获得，对患者的侵入性也更小。来源于皮肤活检的成纤维细胞可被永生化并转分化为成肌细胞，从而提供一种具有优良成肌潜能的细胞来源。本文中，我们描述了一种快速且直接的成纤维细胞向成肌细胞系重编程的方法。成纤维细胞通过两种慢病毒进行转导：一种为hTERT，用于永生化原代培养细胞；另一种为四环素诱导型MYOD，在添加多西环素后可诱导成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步形成表达晚期分化标志物的成熟肌管。这一快速转分化方案为研究神经肌肉疾病的病理机制，以及探索基于基因或药理学的创新生物疗法提供了有力工具。

本方案展示了如何建立人皮肤来源的成纤维细胞培养物，并将其转化为成肌细胞，进而分化为肌管细胞。此类细胞系对于神经肌肉疾病的研究极为有用， 体外 潜在疗法的测试
成纤维细胞转化过程的示意图见图1。图2A显示了一段皮肤组织及其迁移出的成纤维细胞。当成纤维细胞达到汇合状态时，应将其传代至新的培养皿中（图2B）。在更换为含多西环素的成肌细胞生长培养基之前，成纤维细胞的理想汇合度如图3A所示。细胞汇合度应约为70%，因为在转化过程中细胞仍会继续增殖。若细胞汇合度超过80%，则可能影响分化效果。成纤维细胞向成肌细胞的转化过程需要两到四天，可通过细胞形态学观察来确认。转化后的细胞会变得细长并呈平行排列，如图3B所示。加入分化培养基后，成肌细胞停止分裂，并开始融合形成多核的肌管（<str...

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。

对肌营养不良症的病理生理学及治疗靶点的研究，因肌细胞增殖能力有限而受到阻碍……

大家好，我叫Nicolas Wein，是位于俄亥俄州哥伦布市的全美儿童医院的一名首席研究员。今天，我们将向您展示一段关于如何进行皮肤活检并将其转化为成肌细胞和肌管的视频。这是一种研究神经肌肉疾病非常有用的工具。此外，与诱导多能干细胞（IPSC）技术相比，这种方法速度更快，因为我们使用了两种不同的病毒直接转化这类细胞。本视频展示了建立人皮肤来源成纤维细胞培养物、将其转化为成肌细胞，进而分化为肌管细胞的实验方案。通过将皮肤活检组织转移至细胞培养环境以获取真皮成纤维细胞，随后利用携带hTERT和MYOD基因的慢病毒对这些成纤维细胞进行转导。加入含有强力霉素的成肌细胞生长培养基后，MYOD 基因得以表达，诱导成纤维细胞转化为成肌细胞。随后，更换为同样添加了强力霉素的分化培养基，成肌细胞相互融合，形成多核的肌管细胞。从离心管中吸弃液体，并用10毫升室温的1×PBS缓冲液冲洗活检组织，重复三次。第三次洗涤后，将PBS保留在管中。将PBS和皮肤活检组织一同倒入10厘米²的培养皿中。使用无菌手术刀将活检组织切成尽可能小的碎片。用移液器将单个皮肤组织碎片转移至无菌的 10 厘米² 培养皿中。吸除每个组织碎片周围的多余 PBS。注意不要吸出组织块本身。将培养皿的盖子部分盖上，使皮肤活检组织块干燥5到20分钟。切勿使组织块干燥过久。待组织块干燥后，将培养皿倾斜至45度角，缓慢向培养皿的角落加入12毫升成纤维细胞培养基。然后缓慢放低培养皿，小心地分布培养基，避免培养基将组织块冲起。将培养皿放入培养箱中。每五到七天更换一次培养基，之后每周更换一次。将原代成纤维细胞以约30%的融合度接种至12孔板中的两个孔，每孔约20,000个细胞，以确保次日细胞融合度达到约50%。进行慢病毒转导时，加入2至50亿个hTERP嘌呤霉素慢病毒基因组以及400微升成纤维细胞培养基。将慢病毒混合液加入一个孔中。向第二个孔中仅加入400微升成纤维细胞培养基。次日，加入1毫升培养基。一两天后，将细胞转移至六孔板中培养，直至细胞融合度达到60%至70%。在成纤维细胞培养基中加入浓度为1微克/毫升的嘌呤霉素，并向每孔加入2毫升。持续进行筛选，直至对照孔中的所有细胞均死亡且至少维持12天，每2至3天更换一次培养基。在12孔板的三个孔中接种成纤维细胞，使初始汇合度为30%，以保证次日达到约50%的汇合度。进行慢病毒转导时，将2至50亿个拷贝的MYOD Hygromycin B慢病毒基因组与400微升成纤维细胞培养基混合，加入其中两个孔中。次日添加1毫升培养基。一到两天后，将细胞转移至六孔板中培养，直至细胞融合度达到60%至70%。在生长培养基中添加400 µg/mL的潮霉素B，每孔加入2 mL。持续在筛选条件下培养细胞，直至对照孔中的所有细胞均死亡，通常至少需要12天，每两到三天更换一次培养基。诱导成肌细胞时，将成纤维细胞培养至70%融合度。在成肌细胞生长培养基中加入8 µg/mL的多西环素。务必使用新鲜分装的多西环素和培养基。应在每次更换培养基前立即配制培养基。此外，多西环素不应再次冻存。吸除成纤维细胞培养基，并用 PBS 清洗细胞。加入10毫升添加了补剂的成肌细胞培养基。两到三天后，细胞融合度达到90%至95%，其形态将发生变化。吸除成肌细胞生长培养基，并用PBS冲洗细胞表面。加入10毫升已添加8微克/毫升新鲜多西环素的分化培养基。每两到三天更换一次培养基，直至形成肌管。肌管分化开始后7至10天，细胞应完全分化，但具体时间因细胞系不同而有所差异。皮肤组织块培养约五天后，可能开始出现成纤维细胞。图B中，成纤维细胞已达到汇合状态，可转移至75平方厘米的培养瓶中进行进一步扩增。由于原代细胞会进入复制性衰老阶段，因此重要的是在较低传代次数时冻存多管成纤维细胞。一旦建立了可将成纤维细胞转化为成肌管的FM细胞系，成纤维细胞需增殖至70%融合度，如图A所示。必须注意不要超过80%融合度，因为过高的密度可能影响细胞分化。在培养基中加入多西环素后，2至4天内细胞将转变为成肌细胞，表现为细长的形态并呈平行排列，如图B所示。分化的肌管细胞如图C所示。肌管融合与分化所需时间因细胞基因型不同而异，可能需要7至21天。细胞必须在脱落之前进行收集或固定。通过图中箭头所指的肌管边缘的颜色和亮度变化，可以观察到脱离过程的开始。通过免疫荧光检测，成熟肌肉特异性蛋白的表达证实了成纤维细胞成功转化为肌管。在这些图片中，展示了三种不同的细胞。分化程度因细胞而异，可能受也可能不受主要突变的影响，如图B和图C中的细胞所示。该模型的进一步验证通过RNA测序完成。如本图所示，与骨骼肌相比，在FM成肌细胞中检测到超过12,000个差异表达基因。两种转录组之间存在显著相关性，表明FM细胞具有肌肉特异性的表达谱，证明其可作为肌肉来源细胞系的一种有效且可靠的替代模型。为了说明该体外模型的实用性，我们采用了一种在 DMD 基因中最常见的外显子重复突变。外显子2的重复会导致 DMD 基因阅读框的破坏，而跳过该外显子则可能恢复阅读框，或利用内部核糖体进入位点。该疗法已在体内研究中得到验证。在图A中，我们通过RT-PCR分析了这一特定突变细胞系在有无外显子跳过治疗条件下的表现，从而验证了该概念。图B中的蛋白质印迹结果显示，经处理的细胞中表达了有功能的抗肌萎缩蛋白。将该疗法的效率与体内模型进行比较时，结果支持细胞分化技术的可靠性，并支持其用于测试各种突变特异性的基因疗法。在开展临床研究以验证针对神经肌肉疾病的正式疗法的有效性之前，需依赖动物和细胞模型的能力。尽管如今动物模型的构建已相对容易，但针对每一种特定突变都建立动物模型并不可行。通过来源于皮肤成纤维细胞的诱导多能干细胞（iPS细胞）生成成肌细胞是一种替代方法，但该技术耗时较长。因此，本方案提供了一种比iPS细胞生成更为简便的替代方法，可实现成纤维细胞向成肌细胞的直接转化。它通过避免更具侵入性的肌肉活检方法，促进了获取人类细胞模型的途径。总之，这种将成纤维细胞直接转化为成肌细胞的方法，是在特定限制条件下测试神经肌肉疾病疗法的一种有力工具。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

将人类成纤维细胞直接重新编程到肌细胞中，以研究神经肌肉疾病的治疗方法

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

本文描述了一种评估成肌细胞移植效果的非侵入性方法。该方法利用一种统一的融合报告基因，该基因由可通过不同成像方式检测其表达的基因组成。在此，我们采用fluc报告基因序列，通过生物发光成像技术对靶细胞进行示踪。...

分子成像技术用于靶向移植的肌肉前体细胞

本方案包含从肌营养不良症患者尿液中分离尿源细胞的详细步骤，以及通过仙台病毒转导实现这些细胞高效快速重编程的方法。...

由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

本方案描述了从肌肉或皮肤组织中分离活细胞并建立成肌细胞和成纤维细胞原代培养体系的技术。同时介绍了一种使这些细胞系永生化的方法。总体而言，这些方案为获取和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。...

从肌肉活检中分离并永生化患者来源的细胞系用于疾病建模

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。...

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。...

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

本文介绍了一种优化的黑色素细胞直接重编程系统，以及一种高效、高浓度的病毒包装系统，可确保直接重编程过程顺利进行。...

小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞

了解将皮肤成纤维细胞直接重编程为肌母细胞并分化为肌管的方法，用于研究神经肌肉疾病的病理机制和测试治疗策略。该技术比iPSC技术更快速高效。

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

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