使用模块化金门克隆的多基因结构快速组装
2021年2月5日
该协议的目标是提供一个详细的，分步指南，以组装多基因结构使用模块化克隆系统的基础上，金门克隆。它还根据我们的经验就确保最佳装配的关键步骤提出了建议。
这是使用酵母 MoClo 套件组装多基因质粒的详细协议。这种方法使各种多基因同学的克隆方便。它是生成相关部件的大库的理想之选。
首先建立金门反应组合。添加每个 PCR 产品和入口矢量的 20 个女性托盘、1 个 10X T4 升气缓冲器的微升、0.5 微升 Esp3I 和 0.5 微升 T4 连体。加入双蒸馏水，使总体积达到10微升。
然后，运行克隆反应。通过热冲击将整个反应组合转化为DH5α菌株或等效的大肠杆菌化学能力细胞。将细胞分散在磅板上，每毫升氯霉素35微克。
然后在37摄氏度的温度下连夜孵化盘子。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出，在摄氏 4 度下保留约 5 小时，让超级折叠绿色荧光蛋白或 sfGFP 形成更强烈的绿色。要筛选板，将其放置在紫外线或蓝光透光器上。
含有菌落的sfGFP会在紫外线下荧光。绿色殖民地是负面的，因为它们含有未切割的部分质粒。白人殖民地可能是积极的。
克隆是成功的，如果有30至100%的白色殖民地。用左连接器、sfGFP 辍学、右连接器、酵母选择标记、复制酵母源以及带有 mRFP1、大肠杆菌原产地和抗安培林基因的部分质粒组装中间载体。执行文本手稿中描述的克隆反应。
将整个反应组合转换为DH5α菌株，然后以每毫升碳水化合物或安皮西林50微克的磅板上展开细胞。在37摄氏度的夜间孵化。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出。
盘子里将同时包含淡红色和淡绿色的殖民地。将其保持在摄氏四度约五小时，让 mRFP1 和 sfGFP 成熟。使用紫外线或蓝光透光器识别包含潜在正确中间载体的绿色菌落。
在磅卡苯甲酸酯板上划出绿色殖民地，并在37摄氏度的夜间孵化。第二天，在氯霉素板上再次划出它们，并在37摄氏度的夜间孵化。生长在氯霉素板上的菌落含有组装不当的质粒。
中间向量成功组装后，继续组装转录单元。此四件式装配包含中间矢量、发起人、CDS 和决定因素。净化质粒，记录其浓度，并将每个质粒稀释到每微升20个女性DNA。
执行克隆反应后，将整个克隆反应组合转换为DH5α或等效大肠杆菌称职细胞，并将其镀在LBN苯基林上。然后在37摄氏度的温度下连夜孵化盘子。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出，将其保持在摄氏 4 度左右，持续约 5 小时，让 sfGFP 成熟。
使用紫外线或蓝光半透明灯来识别包含潜在正确转录单元的非荧光白色菌落。为文本手稿中描述的多基因质粒组装中间载体。然后将整个克隆反应混合物转换为DH5阿尔法细胞，用每毫升卡那霉素50微克将其镀在磅上。
在37摄氏度的夜间孵化板。执行基于红色和绿色的筛选，然后在 lb kanamycin 板上条纹并生长绿色菌落，以筛选之前演示的误组装。接下来，通过设置文本手稿中描述的克隆反应来组装多基因质粒。
将整个克隆反应混合物转换为DH5阿尔法细胞，并将它们镀在磅卡那霉素上。在37摄氏度的夜间孵化板。然后执行先前描述的绿色和白色筛选。
此协议用于构建一个集成的多基因质粒，用于破坏ADE2轨迹。组装了四个复制和一个综合多基因质粒。中等向量克隆的潜在正确菌落比例为1.83%，中间质粒克隆后，从中间体组装多基因质粒的成功率为93.77%， 正白菌群数量微不足道，显示出多基因质粒的次优组装。
在转化为酵母后，生产β-胡萝卜素和番茄红素的菌落在第三天生长。每个盘子里有四个菌落被划到新鲜的盘子上，再长两天。类胡萝卜素通过紫外线-维斯光谱光谱测量提取和量化。
BTS1/ERG20 可使β-胡萝卜素的产量比仅 ERG20 的菌株高出 35 倍。同样，与ERG20相比，与BTS1/ERG20相比，番茄红素的产量大约高出16.5倍。多基因整合质粒用于破坏ADE2轨迹，无论是与gRNA和没有帮手DNA或与gRNA和多基因整合质粒作为帮助者DNA。
三到四天后，在YPD板块上观察到带有努尔索西林的红色菌落，表明ADE2已被成功破坏。在尝试这种方法时，要记住的最重要的事情是在设置这种反应组合时仔细测量DNA浓度和移液器。这项技术使酵母代谢工程领域的研究人员能够调查大量的基因和促进者，以最大限度地提高产品产量。
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概述
该协议提供了一种详细的、逐步指南，用于使用基于Golden Gate克隆的模块化克隆系统组装多基因构建体。它旨在有效地促进各种多基因质粒的克隆。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 分子生物学
背景
- 多基因构建体对于各种生物学应用至关重要。
- Yeast MoClo套件简化了这些构建体的组装。
- Golden Gate克隆是一种广泛使用的模块化克隆方法。
- 最佳组装需要对关键步骤进行仔细关注。
研究目的
- 提供一个全面的多基因构建体组装协议。
- 分享基于实际经验的建议。
- 使研究人员能够生成大量相关部分的库。
使用的方法
- 设置Golden Gate反应混合物。
- 加入PCR产物和入口载体。
- 使用T4连接酶和Esp3I进行组装。
- 调整反应体积以获得最佳条件。
主要结果
- 成功组装多基因质粒。
- 提高组装效率的关键步骤建议。
- 生成多样化的构建体库。
- 通过实际应用验证协议。
结论
- 该协议为多基因组装提供了一种可靠的方法。
- 它强调遵循关键步骤的重要性。
- 研究人员可以利用这种方法进行各种遗传学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, modular assembly of multi-gene constructs using Golden Gate cloning accelerates the design-build-test cycle in synthetic biology and metabolic engineering. This hierarchical, scar-less workflow enables scalable construction of complex plasmids, supporting high-throughput pathway optimization and functional genomics in yeast and other systems. The approach enhances predictive confidence and portfolio flexibility at key discovery and engineering inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene combinations and regulatory elements for pathway elucidation.
- Supports functional validation of synthetic constructs in disease-relevant or production strains.
- Facilitates rapid prototyping for mechanistic de-risking and target prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, modular parts for reproducible assay development and screening workflows.
- Enables high-throughput generation of variant libraries for quantitative phenotype assessment.
- Streamlines preparation of validated constructs for downstream functional or screening assays.
Translational & Preclinical Research
- Supports metabolic pathway engineering for production strain optimization and biomarker discovery.
- Enables continuity from construct design through preclinical validation in engineered yeast models.
- Reduces risk by allowing parallel testing of multiple genetic configurations.
Pipeline & Workflow Integration
This modular cloning system integrates from early discovery through lead optimization and preclinical engineering, enabling iterative design and rapid construct validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway mapping by enabling combinatorial gene assembly.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for construct performance comparison.
- Analytics: Facilitates visual and spectrophotometric readouts for rapid colony screening and product quantification.
- Translational Research: Bridges construct design with functional validation in production-relevant yeast systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for multi-gene assembly across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathway engineering.
- Operational Value: Delivers high-throughput, standardized, and scalable construct assembly.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and efficient resource allocation in R&D pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and rapid advancement of engineered strains or pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning and quantitative DNA handling.
- Needs access to type IIS restriction enzymes, ligases, and fluorescence screening infrastructure.
- Demands rigorous standardization of DNA concentrations and pipetting accuracy for reproducibility.
- Adaptable to various model systems but may require optimization for non-yeast hosts.
- Success rates depend on careful assembly and screening; suboptimal conditions reduce efficiency.
