Name: 使用模块化金门克隆的多基因结构快速组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学习使用模块化金门克隆技术快速组装多基因结构的方法。本方案详细介绍Yeast MoClo试剂盒的操作步骤，包括T4连接酶和Esp3I酶的应用，以及通过荧光筛选验证组装效率的关键技术要点。

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本工作由纽约州立大学研究基金会（资助号：71272）和布法罗大学IMPACT奖（资助号：000077）资助。

注意：本工具包提供的分级克隆方案可分为三个主要步骤：1. 克隆片段质粒；2. 克隆转录单元（TUs）；3. 克隆多基因质粒（图1）。本方案从引物设计开始，到克隆所得多基因质粒的应用结束。
1. 克隆片段质粒（pYTK001）的引物设计：
<ol>
	<li>设计正向和反向引物，其5'端包含侧翼核苷酸TTT、一个带有额外核苷酸（CGTCTCN）的BsmBI识别位点、一个与入门载体互补的4核苷酸（nt）突出端（TCGG）、一个带有额外核苷酸（GGTCTCN）的BsaI识别位点，以及一个4 nt的片段特异性突出端，此外还包括模板特异性序列（图2A）。GoldenBraid 4.037 和 GoldenMutagenesis38 是可用于Golden Gate特异性引物设计的一些在线软件。</li>
	<li>如果任何片段中存在BsaI或BsmBI识别位点，则在进行Golden Gate组装之前，需通过“驯化”步骤突变这些位点39。对于整合型质粒（见步骤4），还需驯化任何NotI识别位点。若要对含有一个不期望识别位点的片段进行驯化，应将该片段在不期望位点附近划分为两个子片段（图2A）：
	<ol>
		<li>第一个子片段的正向引物设计方式与步骤1.1相同；反向引物则仅包含BsmBI位点和一个4 nt的基因特异性突出端。</li>
		<li>第二个子片段的正向引物仅包含BsmBI位点和一个4 nt的基因特异性突出端，该突出端需与第一个子片段反向引物的序列重叠；第二个子片段的反向引物设计方式与步骤1.1相同。</li>
		<li>在反向引物（步骤1.2.1）或正向引物（步骤1.2.2）的基因特异性区域引入所需的突变。 
		注意：也可选择商业合成不含BsmBI和BsaI识别位点且经过密码子优化的片段。对于编码序列（CDS），可在氨基酸密码子的第三个核苷酸处引入同义突变。然而，对于启动子和终止子，建议通过报告基因检测验证突变后启动子或终止子的活性39。如果在序列末端附近存在不期望的限制性位点，可使用较长的反向引物进行突变。若存在多个不期望的位点，可采用可同时突变多个位点的定点突变技术40。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>有时希望将两个蛋白质融合为一个包含中间连接肽的单一片段（图2A）。连接肽有助于维持两个独立蛋白质的结构完整性41。
	<ol>
		<li>第一个基因的正向引物设计方式与步骤1.1相同；在反向引物中包含BsmBI位点、一个4 nt的基因特异性突出端以及一段连接肽序列。该4 nt突出端可以是连接肽序列本身，也可以是第二个基因的前几个核苷酸。</li>
		<li>对于第二个基因，设计其正向引物，使其包含BsmBI识别位点，以及一个与第一个基因反向引物互补的4 nt突出端；第二个基因的反向引物设计方式与步骤1.1相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为通过聚合酶链式反应（PCR）42扩增各片段，应使用高保真DNA聚合酶从基因组DNA、cDNA或质粒中扩增目标片段。在1%琼脂糖凝胶上检测PCR产物，随后进行凝胶纯化。强烈建议使用纯化的DNA；若凝胶纯化操作繁琐，至少应使用离心柱对PCR产物进行纯化。</li>
</ol>
2. 将片段克隆至入门载体（pYTK001）以构建片段质粒（图2B）
<ol>
	<li>配制Golden Gate反应体系：加入每种PCR产物和入门载体（pYTK001）各20 fmol、1 μL 10X T4连接酶缓冲液、0.5 μL Esp3I（BsmBI的高效同裂酶）以及0.5 μL T4连接酶，再加入ddH2O补足总体积至10 μL。</li>
	<li>进行克隆反应时，在PCR仪中运行以下程序：37 °C孵育5分钟（消化）和16 °C孵育5分钟（连接）进行25–35个循环，随后在50 °C进行最终消化10分钟，最后在80 °C灭活酶10分钟。 
	注意：当同时将多个DNA片段克隆入入门载体时（例如构建融合基因或对基因进行标准化改造），建议采用35个消化/连接循环。</li>
	<li>通过热激法将全部反应产物转化至DH5α菌株或同等的大肠杆菌（Escherichia coli）化学感受态细胞中。建议将10 μL的全部克隆产物加入35 μL化学感受态E. coli细胞中（转化效率为2 × 105 cfu/mL；cfu数值基于将5 ng pYTK001转化至100 μL感受态细胞所得结果计算）。将转化产物涂布于含35 μg/mL氯霉素（Cm）的LB（Lysogeny Broth）平板上，37 °C过夜培养。</li>
	<li>培养16–18小时后，从培养箱中取出平板，置于4 °C冷藏约5小时，以促进超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）充分表达，使绿色荧光更加明显。</li>
	<li>为便于筛选，将平板置于紫外光（UV）或蓝光透射仪上观察。含有sfGFP的菌落将在紫外光下发出荧光。</li>
	<li>绿色菌落为阴性，因其仍含有未被切割的pYTK001载体；白色菌落可能为阳性克隆。若白色菌落占比约为30–100%，则通常表明克隆成功。建议进一步通过菌落PCR或限制性酶切（推荐酶：BsaI-HFv2）对若干白色菌落进行验证。</li>
	<li>从数个可能正确的菌落中提取质粒DNA，并通过Sanger测序确认插入序列的正确性。</li>
</ol>
3. 将片段质粒组装成&#34;cassette&#34;质粒
注意：表达盒质粒包含一个由用户定义的转录单元（TU），该单元由启动子、编码序列（CDS）和终止子组成。表达盒质粒可用于表达单个基因。如果要将多个表达盒质粒组装成一个多基因质粒，则第一步是确定多基因质粒中转录单元的数量及其排列顺序。这将决定表达盒质粒中应使用的连接子类型，因为连接子在多基因质粒中用于连接各个转录单元。第一个转录单元左侧的连接子应为ConLS，最后一个转录单元右侧的连接子应为ConRE，它们将分别与多基因质粒上的ConLS'和ConRE'区域重叠。其余连接子应按数值递增顺序排列。例如，若多基因质粒包含四个转录单元，则连接子组合应为ConLS-TU1-ConR1、ConL1-TU2-ConR2、ConL2-TU3-ConR3 和 ConL3-TU4-ConRE（图1）。
<ol>
	<li>在组装转录单元之前，建议先构建一个包含以下六个部分的中间载体：左侧连接子、sfGFP剔除片段（pYTK047）、右侧连接子、酵母筛选标记、酵母复制起点以及含有&#160;mRFP1、E. coli复制起点和氨苄青霉素抗性基因的片段质粒（pYTK083）（图3）。
	<ol>
		<li>纯化上述六种质粒。使用紫外-可见分光光度计或基于荧光的检测方法测定其浓度，并用ddH2O稀释每种质粒，使1 μL含有20 fmol DNA。使用在线计算器计算DNA的摩尔浓度。 
		&#8203;注意：准确测定DNA浓度并精确移液对组装成功至关重要，尤其是对于包含五到七个组分的质粒组装。每个质粒DNA浓度的微小误差都可能导致克隆效率显著下降。</li>
		<li>加入每种质粒各1 μL、1 μL 10× T4连接酶缓冲液、0.5 μL BsaI-HFv2（BsaI的高效版本）和0.5 μL T4 DNA连接酶，再用ddH2O补足至总体积10 μL。</li>
		<li>设置克隆反应程序，在PCR仪中运行以下循环：37 °C孵育5分钟（消化）和16 °C孵育5分钟（连接），重复25–35个循环。省略最终的消化和热失活步骤，因为中间载体中需要保留BsaI位点（图3）。</li>
		<li>将整个反应混合物转化至DH5α菌株或其他E. coli感受态细胞中，涂布于含50 μg/mL羧苄青霉素（Cb）或氨苄青霉素的LB平板上，37 °C过夜培养。 
		&#8203;注意：羧苄青霉素是氨苄青霉素的一种稳定类似物。</li>
		<li>培养16–18小时后，从培养箱中取出平板。平板上将出现淡红色和淡绿色菌落（图&#160;6C和6D）。将平板置于4 °C约5小时，以使mRFP1和sfGFP充分成熟。使用紫外灯或蓝光透射仪识别绿色菌落，这些菌落可能含有正确组装的中间载体。</li>
		<li>将绿色菌落划线接种至LB + Cb平板，37 °C过夜培养。次日，再次划线接种至LB + Cm平板，37 °C过夜培养。能在LB + Cm平板上生长的菌落含有错误组装的质粒，因为保留了氯霉素抗性片段载体。</li>
		<li>挑选在LB + Cm平板上不生长的菌落，进行限制性酶切分析（推荐酶：BsaI-HFv2、Esp3I），以确认正确组装的质粒。也可采用菌落PCR进行筛选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当中间载体成功构建后，下一步是组装转录单元。这是一个四片段组装，包含以下组分：中间载体、启动子、编码序列（CDS）和终止子。
	<ol>
		<li>纯化四个片段质粒，记录其浓度，并稀释每种质粒，使1 μL含有20 fmol DNA。</li>
		<li>配制反应体系时，请参照步骤3.1.2。</li>
		<li>设置克隆反应时，请参照步骤2.2。</li>
		<li>将整个克隆反应混合物转化至DH5α或同等感受态E. coli细胞中，涂布于LB + Cb平板，37 °C过夜培养。</li>
		<li>培养16–18小时后，从培养箱中取出平板。将出现白色和淡绿色菌落（图6E和6F）。将平板置于4 °C约5小时，使sfGFP充分成熟。使用紫外灯或蓝光透射仪识别无荧光的白色菌落，这些菌落可能含有正确组装的转录单元。</li>
		<li>挑取8–10个白色菌落进行划线培养，并进行菌落PCR。对菌落PCR呈阳性的菌落提取质粒，进一步通过限制性酶切（推荐酶：Esp3I）验证组装结果。 
		&#8203;注意：通常无需对转录单元进行测序，因为该克隆过程仅涉及限制性酶切和连接，所有目标序列已在片段质粒水平得到确认。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将盒式质粒组装成&#34;多基因&#34;质粒：
注意：多基因质粒可实现多个基因的表达。根据下游应用的不同，多基因质粒可以是复制型或整合型。复制型质粒含有酵母复制起点，因此在酵母细胞分裂时能够稳定维持。整合型质粒不含酵母复制起点，而是具有5'和3'同源臂，可通过同源重组将多个基因整合到基因组的特定位点。
<ol>
	<li>对于多基因质粒，应先构建中间载体。
	<ol>
		<li>组装复制中间体载体（图 4A），组装以下六个部分：左连接子（ConLS'-pYTK008）、sfGFP缺失片段（pYTK047）、右连接子（ConRE'-pYTK072）、酵母筛选标记、酵母复制起点以及含有目标片段的质粒&#160;mRFP1 一个 E. coli 复制起点和卡那霉素抗性基因（pYTK084）。
		<ol>
			<li>组装时，请按照3.1.1至3.1.3步骤进行。</li>
			<li>将整个克隆反应体系转化至DH5α或同等感受态细胞中 E. coli 感受态细胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Km）的LB平板。37 °C过夜培养。</li>
			<li>对于基于红/绿颜色的筛选，遵循步骤 3.1.5。</li>
			<li>为筛选错误组装子，将绿色菌落划线接种于LB + Km平板上培养。随后进行步骤3.1.6。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于整合型多基因载体（图4B），首先确定目标基因组位点，然后设计约500个碱基对的5'和3'同源臂，用于整合至该位点。
		<ol>
			<li>从酵母基因组DNA中克隆5'和3'同源臂至入门载体pYTK001。执行步骤1和步骤2。</li>
			<li>组装以下七个质粒：左侧连接子（ConLS'-pYTK008）、sfGFP缺失质粒（pYTK047）、右侧连接子（ConRE'-pYTK072）、酵母筛选标记、3'同源臂、含有目标片段的质粒以及&#160;mRFP1，大肠杆菌 复制起点、卡那霉素抗性基因（pYTK090）以及5'同源臂。</li>
			<li>组装与筛选步骤请参见4.1.1。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多基因质粒的构建
	<ol>
		<li>纯化步骤4.1中获得的中间载体质粒以及步骤3中获得的盒式质粒，使用紫外-可见分光光度计或基于荧光的检测方法测定其浓度，并用ddH₂O将每种质粒稀释至所需浓度。2使每1 μL含有20 fmol DNA。</li>
		<li>加入1 μL中间载体、1 μL各转录单元、1 μL 10x T4连接酶缓冲液、0.5 μL Esp3I和0.5 μL T4连接酶，用ddH₂O补至10 μL。2O.</li>
		<li>按照步骤 2.2 设置克隆反应。</li>
		<li>将整个克隆反应体系转化至DH5α或同类感受态细胞中 大肠杆菌 感受态细胞，涂布于 LB + Km 平板。37 °C 过夜培养。</li>
		<li>按照步骤 3.2.5 进行绿色/白色筛选。</li>
		<li>从几个白色菌落中纯化质粒，并进行限制性酶切消化。建议使用 NotI-HF 酶，因为存在两个 NotI 酶切位点位于 E. coli 起始位点和 Km 抗性筛选标记部分，分别（图4B如果组装的质粒非常大，可选择另一个限制性酶切位点进行进一步验证。或者，在进行限制性酶切之前，先通过菌落PCR筛选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 应用多基因质粒进行染色体或质粒介导的基因表达
<ol>
	<li>将多基因质粒整合到酵母基因组中以实现染色体基因表达（图5）
	<ol>
		<li>为靶向位点设计引导RNA（gRNA）。建议使用多种在线资源（如Benchling、CRISPRdirect43和CHOPCHOP44）来确定最高的靶向特异性。</li>
		<li>通过Gibson克隆法将合成的20-nt gRNA克隆至pCAS质粒45中。使用一对反向引物通过PCR线性化pCAS质粒，该引物分别结合于HDV核酶的3'端和tracrRNA的5'端（图5）。或者，可将gRNA克隆至sgRNA缺失质粒（pYTK050）中，并将该缺失质粒与连接子一起组装成盒式质粒。随后，将Cas9转录单元（TU）与Cas9部分质粒（pYTK036）组装。最后，将Cas9 TU与sgRNA TU共同组装至一个复制型多基因质粒中。</li>
		<li>使用1 μL NotI-HF酶在过夜反应中线性化5–15 μg整合型多基因质粒。将1 μg pCAS-gRNA和线性化的整合型多基因质粒共转化至S. cerevisiae中。可通过市售酵母转化试剂盒或参照Geitz和Schiestl（2007）46的方法制备感受态细胞。 
		&#8203;注意：NotI消化后的多基因质粒无需纯化。</li>
		<li>恢复培养后离心收集细胞，弃去上清液，并用等体积水洗涤。根据酵母选择性标记，将酵母细胞涂布于完全合成培养基（CSM）缺失平板或含抗生素的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基（YPD）平板上。在37 °C培养两天以形成菌落。若未观察到菌落，可在30 °C继续培养额外一至两天。</li>
		<li>通过菌落PCR47筛选发生整合的酵母菌落。</li>
		<li>为消除pCAS质粒，将正确整合的菌落划线接种至非选择性的YPD平板上，在30 °C过夜培养。从YPD平板上挑取单个菌落划线至新的YPD平板，再次于30 °C过夜培养。从第二个YPD平板上挑取菌落划线至含100 μg/mL诺尔斯硫霉素（nourseothricin）的YPD平板（pCAS的选择标记）。若酵母细胞在选择性平板上无法生长，则表明pCAS质粒已成功消除。 
		&#8203;注意：若经过两轮非选择性YPD培养后pCAS质粒仍未被消除，需再次在新鲜YPD平板上划线培养1–2轮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化复制型多基因质粒以实现质粒介导的基因表达
	<ol>
		<li>将100 ng–1 μg纯化的多基因质粒转化至S. cerevisiae感受态细胞中。</li>
		<li>转化后立即根据所用酵母选择标记，将酵母细胞涂布于CSM缺失平板或含抗生素的YPD平板上。在30 °C培养2–3天以形成菌落。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Lee 等人开发的基于 MoClo 的克隆试剂盒为将一个至五个转录单元快速组装到多基因质粒中提供了优良的资源，该质粒可用于在酵母基因组中进行复制或整合。使用该试剂盒可消除在酵母中表达多个基因时经常遇到的耗时克隆瓶颈。
我们测试了五种不同的条件，用于T4 DNA连接酶介导的Golden Gate克隆中的消化/连接循环。结果发现，在4片段组装中，进行30个循环（37 °C消化5分钟，16 °C连接5分钟），随后在50 °C进行最终消化10分钟，并在80 °C进行蛋白质失活10分钟，可获得99.5%潜在正确的克隆（补充图S1和表S3）。16 °C下的连接可确保连接酶活性和黏性末端的充分退火；50 °C的最终消化步骤可防止已消化产物发生重新连接。除非另有说明，所有组装反应均采用此循环程序。
我们还发现了一些需要特别注意的关键步骤，以获得最佳结果。我们强烈建议在组装转录单元之前，先使用 sfGFP 筛选标记构建中间载体。理论上，所有七个片段均可克隆至含有 mRFP1 的 E. coli...

合成生物学旨在构建具有新功能的生物系统，以服务于制药、农业和化工产业。以高通量方式组装大量DNA片段是合成生物学中的一项基础技术。这一复杂过程可借鉴基础工程科学的概念1,2，分解为多个复杂度逐级降低的层级。在合成生物学中，DNA片段通常根据功能进行分层组装：（i）元件（Part）层级：&#34;元件&#34;指具有特定功能的DNA片段，例如启动子、编码序列、终止子、复制起点；（ii）转录单元（Transcription Unit, TU）层级：一个转录单元由一个启动子、一个编码序列和一个终止子组成，能够转录单个基因；（iii）多基因层级：一个多基因质粒包含多个转录单元，通常构成完整的代谢通路。这种由BioBrick社区开创的分层组装方法，是合成生物学中大规模DNA组装的基础概念3。
在过去的十年中4,5,6,7，金门克隆技术已显著促进层级式DNA组装2许多其他多片段克隆方法，例如 Gibson 克隆8无缝克隆（SLIC）9，基于尿嘧啶切除的克隆（USER）10，连接酶循环反应（LCR）11，以及 体内 重组（DNA组装器）12,13，迄今为止也已开发出多种此类技术。但黄金门克隆（Golden Gate cloning）是一种理想的DNA组装方法，因其不依赖于基因特异性序列，可在单管反应中实现无痕、定向且模块化的组装。黄金门克隆利用IIS型限制性内切酶，该酶可识别非回文序列，并在识别位点之外产生交错的黏性末端2连接酶随后将退火的DNA片段连接，从而获得多片段组装产物。将这种克隆策略应用于模块化克隆（MoClo）系统，可实现多达10个DNA片段的组装，经筛选的转化子中超过90%含有正确组装的构建体。4.
MoClo 系统具有显著优势，已加速了合成生物学的设计-构建-测试循环。首先，其可互换的元件能够实现组合式克隆，从而快速测试大量参数空间。例如，优化代谢通路通常需要为每个基因筛选多种启动子，以平衡通路中的代谢流。MoClo 系统可轻松应对此类复杂的克隆任务。其次，通常只需对元件质粒进行测序，而无需对转录单元（TU）或多基因质粒进行测序。在大多数情况下，通过菌落 PCR 或限制性酶切筛选即可完成对 TU 和多基因质粒水平的验证。这是因为只有元件质粒的克隆步骤需要进行 PCR，而 PCR 过程容易引入突变。第三，MoClo 系统非常适合构建多基因的复杂代谢通路。最后，由于采用了通用的黏性末端，元件质粒可被重复使用，并与整个生物工程领域共享。目前，已有适用于植物14,15,5,16,17、真菌6,18,19,20,21,22、细菌7,23,24,25,26,27和动物28,29的 MoClo 试剂盒。最近还推出了跨多界生物的 MoClo 平台30。
对于Saccharomyces cerevisiae，Lee 等人6开发了一套多功能的 MoClo 工具包，为酵母合成生物学领域提供了宝贵的资源。该工具包采用便捷的96孔板格式，定义了八种可互换的DNA元件类型，包含一系列经过充分表征的启动子、荧光蛋白、终止子、肽标签、筛选标记、复制起点以及基因组编辑工具。该工具包可将最多五个转录单元组装到一个多基因质粒中。这些特性在酵母代谢工程中具有重要价值，常用于过表达部分或完整的代谢通路以生产目标化学品。利用该工具包，研究人员已成功优化了香叶醇、芳樟醇31、青霉素32、粘康酸33、靛蓝34和甜菜碱35在酵母中的产量。
本文提供了一个详细的分步实验方案，用于指导如何使用MoClo工具包构建用于附加体质粒表达或基因组整合表达的多基因通路。通过大量使用该试剂盒，我们发现准确测定DNA浓度是确保Golden Gate反应中各组分等摩尔比分布的关键。我们还推荐使用T4 DNA连接酶而非T7 DNA连接酶，因为前者在处理较多黏性末端时表现更优36。最后，所有BsmBI和BsaI的内部识别位点必须在组装前被移除或“驯化”。或者，也可考虑通过合成片段的方式去除多个内部酶切位点，同时实现密码子优化。我们以在酿酒酵母（S. cerevisiae）中表达包含五个基因的β-胡萝卜素和番茄红素合成通路为例，演示该工具包的使用方法。进一步，我们展示了如何利用该试剂盒中的基因组编辑工具敲除ADE2位点。这些基于颜色变化的实验便于直观观察。此外，我们还演示了如何利用Golden Gate克隆技术构建融合蛋白以及引入氨基酸突变。

<table><tbody><tr><td>0.5 mm 玻璃珠</td><td>RPI research products</td><td>9831</td><td>用于裂解酵母细胞</td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD &amp;amp; Company</td><td>214010</td><td>酵母完全合成培养基（CSM）的组分</td></tr><tr><td>Bacto 胰蛋白胨</td><td>BD&amp;amp; Company</td><td>211677</td><td>酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）的组分</td></tr><tr><td>BsaI-HFv2</td><td>New England Biolabs</td><td>R3733S</td><td>BsaI 限制性内切酶的高效版本</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>4800-94-6</td><td>用于转录单元水平的筛选抗生素</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>56-75-7</td><td>用于入门载体水平的筛选抗生素</td></tr><tr><td>CSM-His</td><td>Sunrise Sciences</td><td>1006-010</td><td>酵母完全合成培养基（CSM）的氨基酸补充剂</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>酵母完全合成培养基（CSM）的碳源</td></tr><tr><td>Difco 酵母氮源基础（不含氨基酸）</td><td>BD &amp;amp; Company</td><td>291940</td><td>酵母完全合成培养基（CSM）的氮源</td></tr><tr><td>dNTP 混合液</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>用于 PCR 的 dNTPs</td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0734S</td><td>BsmBI 的一种高效同裂酶</td></tr><tr><td>Frozen-EZ 酵母转化 II 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td>用于酵母转化</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher Chemical</td><td>H302-1</td><td>用于从酵母细胞中提取类胡萝卜素</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>25389-94-0</td><td>用于多基因质粒水平的筛选抗生素</td></tr><tr><td>LB 琼脂，Miller</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1425-2</td><td>用于 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 培养的溶原性琼脂培养基</td></tr><tr><td>LB 肉汤，Miller</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1426-2</td><td>用于 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 培养的溶原性液体培养基</td></tr><tr><td>番茄红素</td><td>Cayman chemicals</td><td>NC1142173</td><td>用于番茄红素定量分析</td></tr><tr><td>MoClo YTK</td><td>Addgene</td><td>1000000061</td><td>存放实验室：John Deuber</td></tr><tr><td>Monarch 质粒小提试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>T1010L</td><td>用于从 &lt;em&gt;E.coli&lt;/em&gt; 中纯化质粒</td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000c</td><td>用于精确测定 DNA 浓度</td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>用于整合型多基因质粒线性化的限制性内切酶</td></tr><tr><td>诺尔斯曲星硫酸盐</td><td>Goldbio</td><td>N-500-100</td><td>本研究中使用的 pCAS 质粒的抗生素筛选标记</td></tr><tr><td>Phusion HF 反应缓冲液（5X）</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td>使用 Phusion 聚合酶进行 PCR 的缓冲液</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>用于所有 PCR 反应的高保真聚合酶</td></tr><tr><td>pLM494</td><td>Addgene</td><td>100539</td><td>用于扩增本研究中使用的 crtI、crtYB 和 crtE 基因的质粒</td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Thermo Electron</td><td>10050801</td><td>用于类胡萝卜素定量分析</td></tr><tr><td>T4 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>用于 Golden Gate 克隆的连接酶</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>BIO-RAD</td><td>1851148</td><td>用于进行所有 PCR 和克隆反应</td></tr><tr><td>组织匀浆器</td><td>Bullet Blender</td><td>型号：BBX24</td><td>用于酵母细胞的匀浆处理</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Genesys 150</td><td>用于类胡萝卜素定量分析</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1422-500</td><td>酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）的组分</td></tr><tr><td>&amp;beta;-胡萝卜素</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAH6010603</td><td>用于 &amp;beta;-胡萝卜素定量分析</td></tr></tbody></table>

使用模块化golden gate克隆技术快速组装多基因结构

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Golden Gate 克隆方法能够快速组装多个基因，并可按照用户自定义的顺序进行排列。该方法利用 IIS 型限制性内切酶，此类酶在识别位点之外进行切割，产生短的黏性末端。这种模块化克隆（MoClo）系统采用分级工作流程：首先将不同的 DNA 元件（如启动子、编码序列（CDS）和终止子）克隆至入门载体中；随后多个入门载体组装成转录单元；多个转录单元进一步连接形成多基因质粒。Golden Gate 克隆策略具有显著优势，可在单管反应中实现无痕、定向且模块化的组装。该分级工作流程通常可轻松构建多种多基因结构，且除入门载体外无需对后续构建体进行测序验证。利用荧光蛋白缺失元件可实现简便的可视化筛选。本文提供了一套使用酵母模块化克隆（MoClo）试剂盒组装多基因质粒的详细分步操作方案。我们展示了多基因质粒组装的最优与次优结果，并提供了菌落筛选指南。该克隆策略在酵母代谢工程及其他需要多基因质粒克隆的场景中具有广泛应用前景。

此处展示了四种用于生产β-胡萝卜素（黄色）和番茄红素（红色）的复制型多基因质粒的结果。构建了一种用于破坏ADE2位点的整合型多基因质粒，其菌落呈红色。
将CDS克隆至入门载体（pYTK001） 
ERG20 从酵母基因组中扩增出三个类胡萝卜素基因 crtE, crtYB, crtI 来自质粒 pLM49448 进入载体 pYTK001，具体方法如前所述。酵母启动子 pENO2、pTIP1、pPYK1 和 pPDC1 和终止子 tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 作为部分质粒进行克隆。在 CrtYB 中引入点突变（G247A）以产生番茄红素，并且一个 BTS1-ERG20 融合构建体被设计...

本实验方案旨在提供一份详细的分步指南，用于基于Golden Gate克隆的模块化克隆系统组装多基因结构。同时，根据我们的实践经验，提供了确保高效组装关键步骤的建议。

使用模块化Golden Gate克隆技术快速组装多基因结构

Golden Gate 克隆方法能够实现多个基因在任何用户自定义排列方式下的快速组装。该方法利用 IIS 型限制性内切酶，其……

本方案详细介绍了使用酵母 MoClo 试剂盒组装多基因质粒的方法。该方法可便捷地克隆多种多基因组合，适用于构建大量相关元件的文库。首先配制 Golden Gate 反应体系。加入每种 PCR 产物及入门载体各 20 飞摩尔，10X T4 连接酶缓冲液 1 微升，Esp3I 0.5 微升，T4 连接酶 0.5 微升，再加入重蒸水至总体积为 10 微升。然后，进行克隆反应。通过热激法将整个反应混合物转化至DH5 alpha菌株或同等的大肠杆菌化学感受态细胞中。将细胞涂布于含有35 µg/mL氯霉素的LB平板上。然后将培养板在37摄氏度下孵育过夜。16至18小时后，将培养板从培养箱中取出，并置于4摄氏度下约五小时，以使超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）充分发育，产生更强烈的绿色荧光。筛选培养板时，将其放置在紫外光或蓝光透射仪上观察。含有 sfGFP 的菌落将在紫外光下发出荧光。绿色菌落为阴性，因为它们含有未被切割的质粒片段。白色菌落可能为阳性。如果出现30%至100%的白色菌落，则表明克隆成功。构建一个中间载体，包含左侧连接子、sfGFP脱落片段、右侧连接子、酵母筛选标记、酵母复制起点，以及含有mRFP1、大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因的片段质粒。按照文本稿件中所述进行克隆反应。将整个反应体系转化至DH5 alpha菌株，然后将细胞涂布于含有50微克/毫升羧苄青霉素或氨苄青霉素的LB平板上。在37摄氏度下过夜培养。16至18小时后，从培养箱中取出平板。培养皿中将同时含有淡红色和淡绿色的菌落。在 4 摄氏度下保存约五小时，以使 mRFP1 和 sfGFP 成熟。使用紫外光或蓝光透射仪识别含有潜在正确中间载体的绿色菌落。将绿色菌落在含有羧苄青霉素的 LB 琼脂平板上划线，并于 37 摄氏度过夜培养。次日，将菌落再次在氯霉素平板上划线，并于 37 摄氏度过夜培养。在氯霉素平板上生长的菌落含有错误组装的质粒。当中间载体成功构建后，继续进行转录单元的组装。这一四片段组装包含中间载体、启动子、CDS 和终止子。纯化质粒，记录其浓度，并将每种质粒稀释至每微升含 20 飞摩尔 DNA。完成克隆反应后，将整个克隆反应体系转化至DH5 alpha或同等感受态大肠杆菌细胞中，并涂布于含羧苄青霉素的LBN琼脂平板上。随后在37摄氏度下培养过夜。16至18小时后，从培养箱中取出平板，置于4摄氏度环境中约五小时，以促进sfGFP的成熟。使用紫外光或蓝光透射仪识别不发荧光的白色菌落，这些菌落含有潜在正确的转录单元。按照文本稿件中的描述构建多基因质粒的中间载体。然后将整个克隆反应混合物转化至DH5 alpha细胞中，并涂布于含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基上。将培养板在37摄氏度下孵育过夜。进行基于红色和绿色的颜色筛选，然后将绿色菌落划线接种并在LB卡那霉素培养板上培养，以筛选如前所述的错误组装体。接下来，按照文本手稿中所述设置克隆反应，组装多基因质粒。将整个连接反应体系转化至DH5 alpha细胞中，并涂布于LB卡那霉素平板上。在37摄氏度下过夜培养。随后按照先前所述方法进行蓝白斑筛选。本方案用于构建一个整合型多基因质粒，以破坏 ADE2 位点。共组装了四个复制型和一个整合型多基因质粒。中间载体克隆中潜在正确菌落的比例为 1.83%。一旦中间质粒克隆完成，从该中间体组装多基因质粒的成功率为 93.77%。阳性白色菌落数量极少，表明多基因质粒的组装效果不理想。转化酵母后，产生β-胡萝卜素和番茄红素的菌落在第3天长出。从每个平板上挑取4个菌落，划线接种至新鲜平板，再培养两天。通过紫外-可见光分光光度法提取并定量类胡萝卜素。BTS1/ERG20 与仅含 ERG20 的菌株相比，可使β-胡萝卜素的产量提高35倍。同样，与仅含 ERG20 的菌株相比，含有 BTS1/ERG20 的菌株番茄红素的产量大约提高16.5倍。多基因整合型质粒用于破坏 ADE2 位点，可单独使用 gRNA 而不加辅助DNA，也可将多基因整合型质粒作为辅助DNA与 gRNA 一同使用。经过三到四天后，在含有Nourseothricin的YPD平板上观察到红色菌落，表明ADE2基因已成功被破坏。在尝试该方法时，最重要的是在配制反应体系时准确测量DNA浓度，并仔细进行移液操作。该技术可使酵母代谢工程领域的研究人员对大量基因和启动子进行筛选，以实现产物产量的最大化。

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