使用模块化金门克隆的多基因结构快速组装

这是使用酵母 MoClo 套件组装多基因质粒的详细协议。这种方法使各种多基因同学的克隆方便。它是生成相关部件的大库的理想之选。

首先建立金门反应组合。添加每个 PCR 产品和入口矢量的 20 个女性托盘、1 个 10X T4 升气缓冲器的微升、0.5 微升 Esp3I 和 0.5 微升 T4 连体。加入双蒸馏水，使总体积达到10微升。

然后，运行克隆反应。通过热冲击将整个反应组合转化为DH5α菌株或等效的大肠杆菌化学能力细胞。将细胞分散在磅板上，每毫升氯霉素35微克。

然后在37摄氏度的温度下连夜孵化盘子。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出，在摄氏 4 度下保留约 5 小时，让超级折叠绿色荧光蛋白或 sfGFP 形成更强烈的绿色。要筛选板，将其放置在紫外线或蓝光透光器上。

含有菌落的sfGFP会在紫外线下荧光。绿色殖民地是负面的，因为它们含有未切割的部分质粒。白人殖民地可能是积极的。

克隆是成功的，如果有30至100%的白色殖民地。用左连接器、sfGFP 辍学、右连接器、酵母选择标记、复制酵母源以及带有 mRFP1、大肠杆菌原产地和抗安培林基因的部分质粒组装中间载体。执行文本手稿中描述的克隆反应。

将整个反应组合转换为DH5α菌株，然后以每毫升碳水化合物或安皮西林50微克的磅板上展开细胞。在37摄氏度的夜间孵化。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出。

盘子里将同时包含淡红色和淡绿色的殖民地。将其保持在摄氏四度约五小时，让 mRFP1 和 sfGFP 成熟。使用紫外线或蓝光透光器识别包含潜在正确中间载体的绿色菌落。

在磅卡苯甲酸酯板上划出绿色殖民地，并在37摄氏度的夜间孵化。第二天，在氯霉素板上再次划出它们，并在37摄氏度的夜间孵化。生长在氯霉素板上的菌落含有组装不当的质粒。

中间向量成功组装后，继续组装转录单元。此四件式装配包含中间矢量、发起人、CDS 和决定因素。净化质粒，记录其浓度，并将每个质粒稀释到每微升20个女性DNA。

执行克隆反应后，将整个克隆反应组合转换为DH5α或等效大肠杆菌称职细胞，并将其镀在LBN苯基林上。然后在37摄氏度的温度下连夜孵化盘子。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出，将其保持在摄氏 4 度左右，持续约 5 小时，让 sfGFP 成熟。

使用紫外线或蓝光半透明灯来识别包含潜在正确转录单元的非荧光白色菌落。为文本手稿中描述的多基因质粒组装中间载体。然后将整个克隆反应混合物转换为DH5阿尔法细胞，用每毫升卡那霉素50微克将其镀在磅上。

在37摄氏度的夜间孵化板。执行基于红色和绿色的筛选，然后在 lb kanamycin 板上条纹并生长绿色菌落，以筛选之前演示的误组装。接下来，通过设置文本手稿中描述的克隆反应来组装多基因质粒。

将整个克隆反应混合物转换为DH5阿尔法细胞，并将它们镀在磅卡那霉素上。在37摄氏度的夜间孵化板。然后执行先前描述的绿色和白色筛选。

此协议用于构建一个集成的多基因质粒，用于破坏ADE2轨迹。组装了四个复制和一个综合多基因质粒。中等向量克隆的潜在正确菌落比例为1.83%，中间质粒克隆后，从中间体组装多基因质粒的成功率为93.77%， 正白菌群数量微不足道，显示出多基因质粒的次优组装。

在转化为酵母后，生产β-胡萝卜素和番茄红素的菌落在第三天生长。每个盘子里有四个菌落被划到新鲜的盘子上，再长两天。类胡萝卜素通过紫外线-维斯光谱光谱测量提取和量化。

BTS1/ERG20 可使β-胡萝卜素的产量比仅 ERG20 的菌株高出 35 倍。同样，与ERG20相比，与BTS1/ERG20相比，番茄红素的产量大约高出16.5倍。多基因整合质粒用于破坏ADE2轨迹，无论是与gRNA和没有帮手DNA或与gRNA和多基因整合质粒作为帮助者DNA。

三到四天后，在YPD板块上观察到带有努尔索西林的红色菌落，表明ADE2已被成功破坏。在尝试这种方法时，要记住的最重要的事情是在设置这种反应组合时仔细测量DNA浓度和移液器。这项技术使酵母代谢工程领域的研究人员能够调查大量的基因和促进者，以最大限度地提高产品产量。