Name: 格拉菲克斯用于检测 糖精 的瞬态相互作用器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 了解梯度固定法用于研究剪接因子与剪接体复合物的瞬时相互作用。该方法利用甘油梯度离心和交联剂稳定松散蛋白结合，避免沉淀形成，适用于酵母总提取物制备及分子生物学研究。

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本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP）资助（项目编号：15/06477-9）。

1. 酵母总提取物的制备
<ol>
	<li>培养表达与TAP标签融合的剪接因子之一的酵母细胞9 在1 L YNB-葡萄糖培养基（酵母氮源基础培养基添加2% m/v葡萄糖）中，加入适当的氨基酸或核苷酸碱基，本实验中为腺嘌呤（20 µg/mL）、亮氨酸（30 µg/mL）、色氨酸（30 µg/mL），培养至OD600 = 1.0.</li>
	<li>通过在三个500 mL离心瓶中以17,000 x g离心，收集1 L培养液中的细胞 g 4 °C下离心10分钟，用10 mL冷的无菌水洗涤两次。</li>
	<li>将收集的酵母细胞重悬于相当于细胞体积1/10的预冷缓冲液A（10 mmol L⁻¹ Tris-HCl，pH 7.4，含1 mmol L⁻¹ EDTA）中。-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L-1 MgCl₂2，50 mmol L-1 KCl，5% v/v 甘油，0.5 mmol L-1 DTT，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</li>
	<li>将细胞悬液用移液器吸取后，直接滴加50 µL至液氮中，形成小液滴并迅速冷冻。 
	警告：液氮接触皮肤或眼睛可造成损伤。操作时应使用适当的防护设备。 
	注意：此处可暂停实验流程。细胞悬液的冷冻液滴可保存于 -80 °C。</li>
	<li>使用球磨仪通过六个循环以20 Hz/s频率研磨3分钟制备酵母细胞裂解液。 
	注意：每个循环后，将装有冷冻细胞的容器浸入液氮中，以防止融化。此步骤可暂停。冷冻提取物可在 -80 °C 下保存。也可使用匀浆器裂解原生质体来制备酵母剪接提取物。10，或使用研钵和研杵11,12.</li>
	<li>将装有提取物的试管置于室温水中，偶尔摇动，使其融化。</li>
	<li>在 45,000 x g 条件下离心提取物 g 4 °C下孵育1小时。</li>
	<li>采用BCA法测定澄清上清液中的蛋白质含量13.</li>
	<li>制备提取物的等分试样，用液氮速冻后于 -80 °C 保存。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
</ol>
2. 甘油梯度制备
<ol>
	<li>在缓冲液A中配制两种甘油溶液，一种含10% v/v甘油，另一种含30% v/v甘油。</li>
	<li>向30% v/v甘油溶液中加入交联剂戊二醛，使其终浓度为0.1% v/v，混匀至均匀。 
	注意：操作戊二醛时应在通风橱内进行，并使用适当的个人防护装备。</li>
	<li>在12 mL离心管（14 x 89 mm）底部加入6 mL预冷的10% v/v甘油溶液。</li>
	<li>使用连接长针头的注射器（针头为Gradient Master装置配套提供），将6 mL预冷的含戊二醛的30% v/v甘油溶液加至离心管底部，紧接在10% v/v甘油溶液下方。 
	备注：也可将10% v/v甘油溶液小心地铺加在30% v/v甘油/戊二醛溶液的上层。</li>
	<li>使用Gradient Master装置生成连续密度梯度。 
	备注：在Gradient Master装置中，将离心管放入合适的支架中，按照制造商推荐的参数（时间/角度/转速）进行短暂旋转。本实验中使用的参数为：2分25秒/81.5°/11 rpm。</li>
	<li>在加入细胞提取物前，小心地在梯度上层加入200 μL的7% v/v甘油/缓冲液A缓冲层。 
	备注：缓冲层的甘油浓度必须低于用于构建线性梯度的最低甘油溶液浓度。</li>
</ol>
3. 提取物离心
<ol>
	<li>在每个含垫层的12 mL线性10%–30%甘油梯度戊二醛离心管顶部上样约2 mg总蛋白。</li>
	<li>将离心管放入预冷的摆桶转子中。 
	注意：在超速离心前应轻柔操作离心管，避免梯度混合。</li>
	<li>在4 °C条件下，以194,000 × g 离心16小时。</li>
	<li>使用改良的EconoSystem或小心移液，将每根12 mL离心管中的样品分装为24个500 μL的组分。 
	注意：改良的EconoSystem由蠕动泵、紫外检测器和连接穿孔装置的组分收集器组成。可通过检测280 nm处的吸光度监测沉降谱型。</li>
	<li>通过蠕动泵使用40%（v/v）甘油溶液，将10%–30%甘油梯度从离心管推入组分收集器中。 
	注意：此步骤可暂停。将各组分储存于-80 °C，直至使用。</li>
	<li>将每组分50 μL直接上样至点印迹或槽印迹装置中的硝酸纤维素膜上。使用CBP抗体（1:6,000，用于检测TAP标签中的CBP部分）进行免疫印迹检测，并以辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体（1:15,000）作为二抗。</li>
</ol>

<ol><li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409(2019).</li>
<li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li>
<li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GraFix%3A+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li>
<li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafix%3A+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li>
<li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p%2FCef1p%2C+novel+pre-mRNA+splicing+factors%2C+and+snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li>
<li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9, 855-868 (1995).</li>
<li>Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+EA+%22Spliceosomal+Pre-mRNA+Splicing%3A+Methods+and+Protocols.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology</a>. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).</li>
<li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Analalytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li>
<li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li>
<li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mRNA+splicing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li>
</ol>

作者不存在利益冲突。

可使用交联剂来稳定蛋白质-蛋白质以及核糖核酸-蛋白质之间的相互作用。重要的是，所形成的复合物必须足够稳定，以耐受在甘油梯度中的超速离心。此外，缓冲条件应允许相互作用的发生，同时具有足够的严谨性以避免非特异性结合。在本实验中，我们采用了先前已建立的适用于体外剪接反应的缓冲液体系15。
离心速度和时间应根据所分析的复合物进行优化。我们测试了不同的沉降条件，在4 °C下以94,000 × g 和194,000 × g 离心16小时，结果相似。这些对照实验对于确定所分析复合物不发生沉淀的条件至关重要。
我们还测试了不同的印迹方法，包括直接将样品滴加到膜上、使用狭缝印迹或点印迹系统，结果表明点印迹具有更高的可重复性。
使用戊二醛作为交联剂的一个主要局限性在于其交联反应不可逆。因此，蛋白质在SDS-PAGE后无法通过免疫印迹进行分析，只能通过天然凝胶电泳或点印迹法检测。然而，可逆的交联剂（如甲醛）也具...

剪接是一个高度动态的过程，需要多种因子以协调的方式结合并释放。这些剪接因子包括RNA结合蛋白、ATP酶、解旋酶、蛋白激酶和磷酸酶、泛素连接酶等1,2,3；为了实现分子重排，其中一些因子仅短暂地结合到剪接体亚复合物上，这使得这些RNP中间复合物的分离与鉴定极具挑战性。
本文中，我们采用Grafix方法4,5，以稳定酵母剪接因子Cwc24与Bact复合物之间的相互作用6，从而鉴定同时结合该亚复合物的其他因子，并确定泛素连接酶Prp19是否在剪接激活及第一次转酯反应发生之前，参与Cwc24与Nineteen（NTC）复合物以及内含子5’端的结合或释放过程。在甘油梯度中沿浓度梯度逐步增加交联剂浓度的优势在于，可避免不同复合物之间的交联4,5，从而防止聚集体的形成。
该方法被用作蛋白质共免疫沉淀和拉下实验的补充，后者尽管能够分离较大的复合物，但在维持大型动态复合物中的瞬时相互作用方面可能并不可靠7,8。在甘油梯度中使用固定试剂可稳定这些因子的结合，从而确认特定蛋白质与剪接亚复合物之间的相互作用。由于所选用的交联剂在化学上是不可逆的，因此在梯度离心后，通过点印迹法对回收组分中的蛋白质进行分析。

<table><tbody><tr><td>抗钙调蛋白结合蛋白表位抗体</td><td>Millipore</td><td>07-482</td><td></td></tr><tr><td>兔IgG ECL检测抗体</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>EconoSystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1-800-424-6723</td><td>所使用的EconoSystem组件：蠕动泵、紫外检测器和组分收集器</td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>组分回收系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>270-331580</td><td>与EconoSystem组件连接的穿孔装置，用于收集离心管中的组分</td></tr><tr><td>梯度制备仪 Model 107ip</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>混合研磨仪 MM 200</td><td>Retsch</td><td>207460001</td><td>球磨仪设备</td></tr><tr><td>转子 F12-6x500Lex</td><td>Thermo Scientific</td><td>096-062375</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>摆桶式转子 P40ST</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 CP 80 NX</td><td>Hitachi</td><td>901069</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管（14 × 89 mm）</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr></tbody></table>

利用grafix技术检测瞬时相互作用蛋白 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae） 剪接体亚复合物

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

前体mRNA剪接是一个高度动态的过程，在剪接体亚复合物的组装、RNA加工以及复合物组分释放过程中涉及多种分子重排。甘油梯度离心法已被用于分离蛋白质或核糖核蛋白（RiboNucleoProtein, RNP）复合物，以进行功能与结构研究。本文中，我们描述了Grafix（梯度固定法）的应用，该方法最初开发用于纯化并稳定大分子复合物，以便进行单颗粒冷冻电子显微镜分析，可用于鉴定剪接因子与剪接体复合物之间短暂的相互作用。该方法基于将样品在固定剂浓度逐渐增加的条件下进行离心，从而稳定复合物。将酵母总提取物加样至甘油梯度后进行离心，回收的各组分通过点印迹（dot blot）分析，以鉴定剪接体亚复合物，并确定各个剪接因子的存在情况。

为了分析Cwc24-TAP的沉降特征，并确定Grafix方法是否能有效稳定其与剪接亚复合物的结合，我们对表达Cwc24-TAP的酵母细胞总提取物进行了甘油梯度离心分离，分离过程中分别在有或无戊二醛（作为交联剂）的条件下进行。随后，通过槽印迹法检测24个500 μL的组分样品，并使用针对TAP标签中CBP区域的抗体进行检测。结果显示，在无交联剂存在时，Cwc24主要集中于第5至第13组分（图1B），对应分子量约为80至200 MDa14的复合物。然而，在存在交联剂的情况下，Cwc24在梯度中的位置向梯度底部的组分偏移，对应更大分子量的复合物（图1）。这些结果表明，戊二醛能够稳定Cwc24与剪接复合物的结合。
为了确定保留 Cwc24 的复合物是否对应于由 snRNP U2、U5、U6 和 NTC 复合物组成的 Bact 复合物，我们将 Cwc24 的沉降行为与 U5 snRNP 亚基 Prp8 和 NTC 亚基 Prp...

本文介绍了Grafix（梯度固定）技术的应用，该技术是在交联剂存在下进行甘油梯度离心，用于鉴定剪接体复合物上短暂结合的剪接因子之间的相互作用。

利用Grafix技术检测瞬时相互作用蛋白 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 剪接体亚复合物

前体mRNA剪接是一个高度动态的过程，在剪接体亚复合物的组装、RNA加工等过程中涉及多种分子重排。

梯度固定法通过在交联剂存在下进行甘油梯度离心，有助于鉴定与多亚基复合物发生瞬时结合的蛋白质之间的相互作用。在甘油梯度中使用固定试剂可稳定松散因子的结合状态，且不会形成沉淀，从而能够鉴定特定蛋白质与剪接中间复合物之间的相互作用。本实验方案的最终流程演示可帮助初次使用者理解仅通过文字描述难以掌握的信息。为制备酵母总提取物，将表达剪接因子与TAP标签融合蛋白的酵母细胞在1升Y和B葡萄糖培养基中培养，培养基中添加适当的氨基酸或核酸碱基。当培养物在600纳米处的光密度达到1时，将酵母细胞分三次用500毫升离心管离心收集，并每次用10毫升冰冷无菌水洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于相当于细胞体积十分之一的冰冷缓冲液A中，然后将50微升的酵母细胞悬液滴加至液氮中速冻。冷冻后，将冷冻的细胞沉淀物置于球磨仪中，以20赫兹频率研磨六个循环，每个循环3分钟，每次循环结束后将装有冷冻细胞的容器浸入液氮中。最后一个循环结束后，将含有提取物的离心管放入室温水中，期间偶尔轻轻振荡。待完全融化后，离心以收集提取物。采用 BCA 法测定澄清上清液中的蛋白质含量。然后将提取物分装后在液氮中快速冷冻，于 -80 摄氏度保存。制备甘油梯度时，向 30% 甘油和缓冲液 A 的混合液中加入终浓度为 0.1% 的交联剂戊二醛，并混匀至均一状态。向一个12毫升离心管中加入6毫升冰冷的10%甘油缓冲液A溶液，使用配备长针头的梯度生成仪注射器，将30%甘油戊二醛溶液铺至管底。使用梯度生成仪，按照制造商的说明制备线性甘油梯度。在梯度顶部小心地加入200微升7%甘油缓冲液A垫层，然后在管顶部加入约2毫克的细胞提取物。在生成甘油梯度后，将样品置于预冷的摆桶转子中，通过离心收集提取物。将每个12毫升样品管中的样品分装为24份，每份500微升，并使用蠕动泵将40%甘油溶液从10%至30%梯度的管中推入组分收集器。然后直接取每份50微升加样至点印迹（dot blot）的硝酸纤维素膜上，随后加入封闭缓冲液，使用针对CBP的一抗在免疫印迹上检测该蛋白，并根据需要使用适当的二抗。在无交联剂的情况下，CWC 24 主要集中在第 5 至第 13 组分之间，对应于约 80 至 200 兆道尔顿的复合物。然而，在存在交联剂的情况下，CWC 24 在梯度中的位置向梯度底部移动，对应于更大的复合物。通过将 CWC 24 的沉降情况与 U5 snRNP 亚基 Prp8 和 NTC 亚基 Prp19 进行比较，发现 CWC 24 与它们集中在相同的组分中。但是，由于它与剪接体瞬时结合，因此也存在于较轻的组分中。有趣的是，Prp8 和 19 开始富集的组分是 11 和 12，这表明 B Act 复合物从该区域开始沉降。对第 11 和 12 组分进行的 Western 印迹分析显示，Prp8 和 19 的信号呈弥散条带，几乎无法进入 8% 丙烯酰胺凝胶，表明它们确实是大型复合物的组成部分。CWC 24 也存在于第 12 号组分中，但浓度要低得多，这与其短暂结合于 B Act 复合物的特性一致。综上所述，这些结果表明，戊二醛可作为交联剂，用于稳定瞬时因子与剪接亚复合物之间的结合。该方法可应用于研究任何动态的马达亚基复合物，这些复合物会短暂地与其部分组分发生关联，例如剪接体。

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格拉菲克斯用于检测 糖精 的瞬态相互作用器

在本视频中，我们展示了改良的酵母单杂交实验方法，该方法可用于检测多种蛋白质与靶DNA的相互作用。转化后的酵母细胞在报告基因上游含有靶DNA序列，同时表达转录因子蛋白。当这些蛋白形成复合物并结合到靶DNA上时，报告基因将被表达，并可通过酶学方法进行检测。...

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