格拉菲克斯用于检测 糖精 的瞬态相互作用器
2020年11月9日
在这里，我们描述了Grafix（梯度固定）的利用，这是一种在交行器面前的甘油梯度离心，用于识别暂时与拼接体复合物结合的拼接因子之间的相互作用。
梯度固定法在交联剂存在下进行甘油梯度离心，有助于鉴定瞬时结合到多亚基复合物的蛋白质之间的相互作用。在甘油梯度中使用固定试剂可稳定松散因子的结合，而不会形成沉淀物，从而可以鉴定特定蛋白质与剪接半复合物的相互作用。end 协议的演示可帮助初次使用的用户学习仅从书面文本中可能难以理解的信息。
对于酵母总提取物制备，培养表达与 tap 标签融合的剪接因子之一的酵母细胞，以及 1 升补充有适当氨基酸或核酸碱基的 Y 和 B 葡萄糖培养基。当培养物达到 600 纳米的光密度时，通过在三个 500 毫升离心瓶中离心收集酵母细胞，并在每次洗涤中用 10 毫升冷无菌水洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于细胞体积的十分之一的冷缓冲液 A 中，并在液氮中冷冻 50 微升酵母细胞悬液。
冷冻后，在球磨装置中以 20 赫兹的频率将冷冻细胞沉淀研磨 6 次循环 3 分钟，在每个循环结束时将冷冻细胞容器浸入液氮中。最后一次循环后，将含有提取物的试管放入室温的水中，偶尔摇晃。融化后，离心以收集提取物。
并通过 BCA 方法定量澄清的上清液的蛋白质。然后将提取物的等分试样在液氮中快速冷冻，在零下 80 摄氏度下储存。为了制备甘油梯度，将终浓度为 0.1% 的交联剂戊二醛添加到 30% 甘油和缓冲液 A 溶液中，并混合以均质化。
将 6 毫升冷的 10% 甘油和缓冲液 A 溶液添加到 12 毫升离心管中，并使用配备长针的梯度主装置注射器将 30% 甘油戊二醛溶液分层在管底部。使用梯度母版设备根据制造商的规格创建线性甘油梯度。小心地将 200 微升 7% 甘油和缓冲液 A 垫层叠到梯度的顶部，然后向试管顶部添加大约 2 毫克的细胞提取物。
生成甘油梯度后，将样品置于预冷的水平转子中，并通过离心收集提取物。将每个 12 mL 样品管中的样品分装成 24 500 μL 馏分，并使用蠕动泵将 40% 甘油溶液以 10% 至 30% 的梯度从试管推至馏分收集处。然后将 50 μL 每种组分直接加载到斑点印迹上的硝酸纤维素膜上，然后添加封闭缓冲液，并使用抗 CBP 的一抗检测免疫印迹上的蛋白质，并根据需要使用适当的二抗。
在没有交联剂的情况下，CWC 24 集中在馏分 5 和 13 之间，对应于约 80 至 200 兆道尔顿的复合物。然而，在存在交联剂的情况下，CWC 24 在梯度上的位置会转移到梯度底部对应于较大复合物的馏分。将 CWC 24 的沉降与 U5 snRNP 亚基、Prp8 和 NTC 亚基的沉降进行比较，Prp19 显示 CWC 24 集中在相同的馏分中。
但是，因为它与剪接体瞬时结合，所以它也存在于较轻的组分中。有趣的是，馏分 11 和 12 是 Prp8 和 19 开始浓缩的馏分，这表明这是梯度中 B Act 复合物开始沉淀的部分。馏分 11 和 12 的蛋白质印迹分析显示 Prp8 和 19 信号为弥散条带，几乎不会进入 8% 丙烯酰胺凝胶，表明它们确实是大型复合物的一部分。
CWC 24 也存在于馏分 12 中，但浓度要低得多，这与它与 B Act 复合物的瞬时结合一致。综上所述，这些结果表明，戊二醛可以用作交联剂，以稳定瞬时因子与剪接子复合物的结合。该方法可应用于研究与其某些成分（例如剪接体）瞬时结合的任何动态运动亚基复合物。
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概览
本文描述了梯度固定法，利用甘油梯度离心和交联剂来识别剪接因子与剪接体复合物之间的短暂相互作用。该方法可以在不形成沉淀的情况下稳定松散的蛋白质相互作用，从而便于研究特定的蛋白质相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 梯度固定是一种用于研究蛋白质相互作用的技术。
- 它有助于识别多亚基复合物内的短暂相互作用。
- 使用交联剂可以增强这些相互作用的稳定性。
- 这种方法对于研究剪接因子特别有用。
研究目的
- 展示用于识别蛋白质相互作用的梯度固定方法。
- 提供一个协议，帮助初次使用者理解该技术。
- 促进对酵母剪接因子的研究。
使用的方法
- 带交联剂的甘油梯度离心。
- 制备表达剪接因子的酵母总提取物。
- 酵母细胞的收集和洗涤。
- 冻结细胞悬液以进行进一步分析。
主要结果
- 该方法成功稳定了短暂的蛋白质相互作用。
- 识别了剪接因子和剪接体之间的特定相互作用。
- 该协议对新手研究人员来说是易于理解的。
- 最终协议的演示有助于实际理解。
结论
- 梯度固定是研究短暂蛋白质相互作用的有效方法。
- 这种技术可以增强我们对剪接机制的理解。
- 它为分子生物学研究人员提供了一个有价值的工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying transient protein interactions is critical for target validation in dynamic complexes like the spliceosome, where weak or short-lived associations can be missed by conventional methods. The Grafix (Gradient Fixation) method stabilizes these interactions using glycerol gradient centrifugation with a cross-linker, enabling detection without precipitate formation. This approach supports mechanistic de-risking by clarifying binding partners in disease-relevant systems, improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transient splicing factor interactions that may represent therapeutic targets in RNA-processing pathways.
- Operational Value: Stabilizes weak binders for detection, reducing false negatives in target validation assays.
- Scientific Value: Supports pathway clarification by mapping co-sedimentation of factors like CWC 24 with U5 snRNP and NTC subunits.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares fractionated complexes for downstream analysis via dot blot, enabling quantitative assessment of splicing factor presence.
- Operational Value: Generates reproducible sedimentation profiles that can be standardized across runs for assay consistency.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by isolating subcomplexes in defined gradient fractions for targeted probing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant insight into spliceosome dynamics, which are implicated in cancers and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by stabilizing transient interactions for functional follow-up.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing stable versus transient associations in macromolecular machines.
Pipeline & Workflow Integration
The Grafix method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing of transient interactions before progressing to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about transient splicing factor binding by stabilizing interactions for detection in gradient fractions.
- Screening: Produces assay-ready fractions with standardized glycerol gradients, enabling reproducible compound or factor screening.
- Analytics: Delivers quantitative sedimentation data and co-localization outputs (e.g., CWC 24 with Prp8/Prp19) to compare conditions and assess binding shifts.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying factors whose transient binding may be modulated in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any dynamic sub-unit complex with transient components, not limited to spliceosome.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing transient interactors otherwise lost in standard lysates.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized gradient generation and fractionation, reducing variability across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic ambiguity in multi-subunit target complexes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction networks in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast cell lysis, gradient preparation, and fractionation techniques.
- Depends on access to gradient master devices, swing bucket rotors, and fractionation equipment.
- Necessitates standardization of cross-linker concentration (e.g., glutaraldehyde) to avoid over-stabilization or precipitation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-yeast systems or alternative complexes.
- Includes practical limitations such as potential epitope masking by cross-linking, requiring validation of antibody accessibility post-fixation.
