Name: 逐步在泰瑟尔脚手架上播种，研究发芽血管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 了解在三维环境中利用内皮细胞和支持细胞创建有序血管网络的逐步播种方案。该方法可在受控环境中追踪血管形成，并可用于重建血管疾病以探索治疗方法。

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本研究得到了密歇根大学—以色列研究合作项目的资助。作者谨此感谢Uri Merdler、Lior Debbi&#160;和Galia Ben David提供的大力支持与协助，感谢密歇根大学Lurie纳米制造中心的Nadine Wang博士和Pilar Herrera-Fierro博士，以及Luis Solorio博士在光刻技术方面富有启发性的讨论。

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<li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li>
<li>Nguyen, D. -H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li>
<li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在工程化组织内部构建丰富的血管网络对于组织构建物的存活和正常功能至关重要1。尽管血管系统的构建已受到大量研究的关注，但仍有许多机制尚待探索和阐明24。特别是，在重建特定组织时，微血管系统应表现出相应的结构特征和组织方式12。目前生成微血管最常用的方法是将内皮细胞与支持细胞共接种于一种适合细胞黏附、增殖和血管形成的三维环境中25。然而，该方法通常形成高度无序的血管网络，难以对微血管行为进行系统研究22。本文所述方案提供了一种新工具，可在高通量系统中生成高度有序的血管网络，且血管结构可随时间被方便地追踪和监测，从而用于研究其发育过程与行为特征。 内皮细胞（ECs）的逐步接种（步骤2-3），随后接种支持细胞（SCs）（步骤4），是实现此类有序网络的关键步骤22。此外，该技术为血管模型提供了真正的三维环境，使血管可在三个维度中迁...

组织工程领域正在迅速发展，致力于构建工程化结构以替代缺失或受损的器官和组织1。然而，由于尚无法有效构建用于组织营养供给的功能性血管网络，目前仍未实现完全功能化的组织结构。缺乏适当的血管化会导致工程化组织仅依赖被动扩散来运输氧气和营养物质，从而将组织最大可存活厚度限制在扩散极限范围内，约为 200 µm2。此类厚度不足以修复大面积组织缺损或实现完整器官的构建，因此功能性血管网络的存在成为功能性及可植入组织所必需的关键特征3。
血管系统由多种不同大小、表型和结构的血管组成，其特征与宿主组织密切相关。理解发育中和出芽血管的行为、响应及其迁移决策，有助于指导其在工程化组织中的整合4。目前，体外构建血管网络最常用的方法是将内皮细胞（ECs）与支持细胞（SCs，具有分化为壁细胞的能力）共同接种于三维微环境中。该环境提供化学和物理信号，促使细胞黏附、增殖并自组装形成血管网络2,5,6,7,8。在共培养条件下，支持细胞分泌细胞外基质（ECM）蛋白，同时为形成管状结构的内皮细胞提供机械支撑。此外，两类细胞之间的相互作用促进管状结构形成、血管出芽和迁移，同时也促进支持细胞成熟并分化为表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的壁细胞4。血管网络的发育通常在由水凝胶、多孔聚合物支架或二者结合构建的三维环境中进行研究。后一种方案既能提供有利于细胞生长的环境，又能为细胞和细胞外基质提供必要的机械支撑9。
已有大量研究致力于血管发育的探索，包括在水凝胶上共培养细胞10、使用水凝胶-支架组合11,12、二维平台以及微流控装置13。然而，水凝胶容易受到细胞施加力的作用而发生形变14，而二维和微流控系统则难以重建更接近自然的环境，从而无法获得更具可外推性的响应结果15,16。理解新生血管如何响应其周围环境，可提供关键性见解，有助于构建能够以可预测方式引导血管发育的工程化环境。深入认识血管形成现象对于跟上从亚微米到微米尺度制造技术的快速发展尤为重要，这些技术包括立体光刻、数字投影光刻、连续液态界面制造、三维熔融电喷写、基于溶液的三维电喷写以及新兴的生物打印技术17,18,19,20,21。将这些微制造技术的控制能力与对血管生物学的深入理解相结合，是为特定组织构建合适工程化血管系统的关键。
在此，我们介绍一种三维系统，用于研究新生和出芽血管对周围支架几何结构的响应，观察其出芽起源及随后的迁移过程22。通过使用具有镶嵌式分隔结构的三维支架以及两步接种技术，我们成功构建了高度有序的血管网络，且该网络结构清晰、易于分析。这种镶嵌式几何结构提供了一种高通量系统，其各个独立单元内的血管可响应局部微环境。利用多色内皮细胞（ECs），我们追踪了出芽形成的起源及其后续迁移模式，并将其与分隔结构的几何特征及间充质干细胞（SCs）的位置相关联22。
尽管本方案旨在分析几何线索对血管化行为的影响，但该方法可拓展并应用于多种新领域。这种镶嵌式支架和易于成像的网络结构，可直接用于分析不同内皮细胞与基质细胞的相互作用、特定器官细胞的引入及其与血管网络的相互作用、药物对血管网络的影响等。我们所建议的系统具有高度的多功能性，且制备与加工过程简便。

<table><tbody><tr><td>Angiotool 免费软件</td><td>NIH-CCR</td><td></td><td>可在 https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home 免费下载</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 Probumin</td><td>Millipore</td><td>82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>牙髓干细胞</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>ECM 培养基 + 增强试剂盒</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>Gadot-Group</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Evicel 纤维蛋白封闭剂</td><td>Johnson&amp;amp;Johnson</td><td>EVB05IL</td><td>提供凝血酶和纤维蛋白原（BAC2）溶液</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Cy3 抗体</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa-Fluor 488 抗体</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>人脂肪微血管细胞</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>人纤维连接蛋白</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>储存浓度：1 mg/mL</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>可在 https://imagej.nih.gov/ij/download.html 免费下载</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Gadot-Group</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Lift-off 试剂</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>G112850</td><td>商品名为 Omnicoat</td></tr><tr><td>低糖 DMEM</td><td>Biological Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 SMA 抗体</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛 PBS 溶液</td><td>ChemCruz</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-制霉菌素溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 vWF 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab9378</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>Silicon Valley Microelectronics (SVM)</td><td></td><td>晶圆尺寸 4&quot;，类型 N-1-10，厚度 500–550 微米</td></tr><tr><td>SU-8 2050 光刻胶</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y11058</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr></tbody></table>

在镶嵌式支架上逐步接种细胞以研究出芽型血管

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

循环系统在人体生理学中起着关键作用，为体内大多数组织提供营养；血管根据各自灌注组织的具体需求，呈现出不同的尺寸、结构、表型和功能特性。组织工程领域旨在修复或替代受损或缺失的组织，其成功依赖于可控的血管生成过程，以在工程化组织内建立适当的血管化网络。缺乏血管系统时，较厚的工程化结构无法获得充分营养，可能导致细胞死亡、移植效果差，最终导致失败。因此，理解并调控工程化血管的行为是该领域面临的一项重大挑战。本研究介绍了一种高通量系统，可在三维支架环境中构建有序且可重复的血管网络，用于研究血管行为。该两步接种方案表明，系统内的血管会响应支架的拓扑结构，在不同几何构型的微环境中表现出独特的出芽行为。通过该高通量系统获得的结果与认知，可用于指导更优的三维生物打印支架结构设计——因为在以三维打印技术构建含细胞的生物环境时，难以快速评估多种三维几何结构的性能。此外，该高通量系统所提供的认知还可用于改进快速药物筛选、加速共培养模型的开发，以及探究机械刺激对血管形成的影响，从而加深对血管系统的理解。

本方案采用立体光刻技术，可制备由SU-8光刻胶制成的镶嵌式支架。所获得的支架具有不同的腔室几何形状（方形、六边形和圆形），且结构特征高度精确、可重复（图1）。
<img alt="静态平衡图案：正方形、六边形、圆形。结构分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61995/61995fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：分块的正方形、圆形和六边形支架结构的代表性扫描电子显微镜图像（比例尺 = 500 µm）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61995/61995fig01large.jpg" ...

工程化组织高度依赖于适当的血管网络，以提供必需的营养物质和气体，并清除代谢废物。本研究中，通过内皮细胞与支持细胞的逐步接种方案，在高通量平台上构建出高度有序的血管网络，用于在可控的三维环境中研究血管发育行为。

心血管系统在人体生理学中起着关键作用，为体内大多数组织提供营养；血管以不同大小存在，……

本方案使研究人员能够以清晰且易于追踪的方式研究血管网络的形成过程，为新研究开辟了道路，并揭示了血管行为的机制。该技术有望构建出高度有序且可重复的血管网络，且这些网络能够响应周围环境。通过该系统，可获取患有血管疾病患者的内皮细胞，从而实现血管疾病的体外重建，并有助于寻找合适的治疗方法。该方法可与不同类型的细胞联用，用于研究血管网络的行为，从而观察发育中的血管与特定组织类型之间的相互作用。首先将支架浸入70%乙醇中至少15分钟，然后用PBS洗涤两次。每块待接种的支架，用1.5微升纤连蛋白储备液与28.5微升PBS混合。配制一份纤连蛋白稀释液，用于所有支架，以避免移液误差。将支架稀疏地放置在疏水表面之上，并在每个支架上覆盖30微升纤连蛋白稀释液。盖上培养板盖，将覆盖有纤连蛋白的支架置于37摄氏度、100%湿度的培养箱中，孵育至少一小时。孵育后，用 PBS 轻轻冲洗支架，以去除纤连蛋白残留物。支架可在 4°C 的 PBS 中保存长达一周。通过将基础培养基与相应的培养基试剂盒组分混合，制备内皮细胞（EC）培养基，具体包括抗生素溶液、FBS 以及制造商指定的内皮细胞生长补充剂。用内皮细胞培养基制备人脂肪微血管内皮细胞悬液，细胞浓度为每毫升四百万个细胞。用镊子将一个经纤连蛋白包被的支架放入非组织培养处理的24孔板的每个孔中。在每个支架上覆盖25微升的细胞悬液液滴，注意确保悬液不会从支架上流走。将培养板盖上盖子，放入37摄氏度、5%二氧化碳和100%湿度的培养箱中孵育60至90分钟。孵育结束后，每孔加入700 µL内皮细胞培养基。继续培养内皮化支架，直至通过荧光显微镜观察到内皮细胞融合，或培养三天为止。每隔一天更换一次培养基。通过混合500毫升低糖DMEM、57.5毫升FBS、5.75毫升非必需氨基酸、5.75毫升GlutaMAX以及5.75毫升青霉素-链霉素-制霉菌素溶液，制备DPSC培养基。将内皮化的支架转移至新的非组织培养处理的24孔板中。使用移液器或真空抽吸装置弃去当前培养板中的所有培养基，注意避免将真空直接施加于支架上。将一个支架置于每个孔的中央，然后用轻微真空干燥周围区域。用 PBS 将凝血酶和纤维蛋白原储备液分别稀释至终浓度为每毫升 5 个单位和每毫升 15 毫克。将八百万个DPSC每毫升的细胞悬液加入凝血酶稀释液中，按每块支架12.5微升的量分装至各自的微量离心管中。将5至50微升移液器设定为12.5微升，并吸取纤维蛋白原溶液。不更换枪头，将移液器调整至25微升。吸头内的液体应上升并留出空余体积。缓慢按压推杆按钮，直至液体到达吸头开口处，但不渗出。保持推杆在此位置，将吸头插入含有凝血酶悬浮细胞的微量离心管之一中，确保吸头与液体接触。轻轻松开活塞按钮，将细胞悬液吸入枪头中。充分混匀两种材料，避免产生气泡。迅速将混合材料滴加到已内皮化的支架表面。对每个支架重复上述步骤，注意每次使用后更换枪头，以避免枪头内意外形成纤维蛋白凝胶。更换培养板盖后，将支架置于37摄氏度、5%二氧化碳及100%湿度条件下孵育30分钟。孵育结束后，向每孔加入1毫升1:1混合的牙髓干细胞与内皮细胞培养基。培养一周，每隔一天更换一次培养基。在培养期间的不同时间点，从孔中移除培养基，并使用共聚焦显微镜对构建物进行成像，以研究血管发育或其他感兴趣的参数。该方案可用于制备由SU-8光刻胶制成的镶嵌式支架。获得了具有不同隔室几何形状以及高度精确且可重复特征的支架。采用传统的内皮细胞与支持细胞同时接种方法时，细胞在支架上呈均匀分布，导致血管网络不可预测且无序。相反，分步接种细胞则形成了高度有序的血管网络。使用荧光标记的内皮细胞时，可对血管进行实时成像。表达红色荧光蛋白的内皮细胞在六边形支架上培养并进行成像。在第1天加入支持细胞，并每隔一天对血管网络进行成像，以定量分析血管发育情况。在每个时间点，均拍摄支架的整体宽视野图像。以血管总长度和面积来量化血管生长情况。通过共聚焦成像时间序列观察，利用多色内皮细胞对单个血管进行追踪。通过延时成像生成了血管路径，从而可以观察血管的迁移过程。通过检测平滑肌肌动蛋白和支持细胞的存在来观察血管成熟情况。对于圆形、六边形和方形区域，细胞增殖并自组织形成结构。到第7天时，所有形状均显示出丰富而复杂的血管网络。高倍镜图像显示，平滑肌肌动蛋白和支撑细胞在形成的血管周围共定位，密度更高，表明支撑细胞被募集并围绕血管结构发生分化。该技术可用于研究三维血管网络在不同条件下的行为，例如在特定细胞抑制剂作用下或存在其他细胞类型时的情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

逐步在泰瑟尔脚手架上播种，研究发芽血管

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。...

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

本文描述了一种逐步操作方案，利用光学相干断层扫描技术，对在脉动刺激条件下基于可生物降解聚合物支架构建的组织工程血管进行实时培养过程中的血管重塑及支架降解进行非破坏性、长周期的动态监测。...

利用光学相干断层扫描无创监测基于可降解支架的组织工程血管发育

本方法描述了在标准化的微流控平台上培养由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内皮细胞，形成40条可灌注的三维微血管。该平台能够以可扩展且高通量的方式研究三维环境中由浓度梯度驱动的血管生成出芽过程，包括出芽的吻合及稳定化。...

体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

三维共培养类球体血管生成检测系统旨在模拟生理性的血管生成过程。该共培养类球体由两种人源血管前体细胞——内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）——组成，并包埋于胶原凝胶中。该新系统可用于有效评估血管生成调节剂，并能为体内研究提供更相关的生物学信息。...

利用内皮集落形成细胞与间充质干细胞共培养球体的三维血管生成检测系统

本文提供了一种微流控芯片及一种可自动控制、高效循环的微流控系统，可重现血管新生的初始微环境，使内皮细胞（ECs）同时受到高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及不同分布的血管内皮生长因子（VEGF）的刺激。...

模拟新生血管化初始事件的微流控模型

该实验利用小鼠胚胎干细胞分化形成的类胚体，将其培养在三维胶原凝胶中，以在体外分析调控出芽型血管生成的生物学过程。in...

体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

本文列出了在先前描述的三维胶原基支架上接种神经母细胞瘤细胞系所需的步骤，包括在预定时间内维持细胞生长，并回收支架以进行多种细胞生长和细胞行为分析及后续应用，可根据不同的实验目的进行调整。...

三维 体外 基于胶原支架的神经母细胞瘤仿生模型

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。...

从多能干细胞生成人血管类器官

血管新生是发育和疾病中的基本过程，涉及复杂的分子和力学机制。本文介绍一种多功能的2.5D ex vivo...

2.5D 模型 离体 活体组织中出芽式血管生成的力学表征

了解在三维环境中利用内皮细胞和支持细胞创建有序血管网络的逐步播种方案。该方法可在受控环境中追踪血管形成，并可用于重建血管疾病以探索治疗方法。

在镶嵌式支架上逐步接种细胞以研究出芽型血管

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