逐步在泰瑟尔脚手架上播种，研究发芽血管

我们的协议允许研究人员以清晰易行的方式研究血管网络形成过程，为新的研究打开大门，并揭示血管行为。该技术提供了创建高度组织和可重复的血管网络，以响应周围环境的可能性。使用该系统可以检索血管疾病患者的内皮细胞，从而有可能重现血管疾病并找到适当的治疗方法。

建议的方法可以扩展为研究血管网络行为时，与不同的细胞类型配对，允许观察发展血管与特定组织类型的相互作用。首先将脚手架浸入70%乙醇中至少15分钟，然后用PBS清洗两次。将 1.5 微升纤维素库存溶液与每脚手架 28.5 微升 PBS 混合以进行播种。

准备一个纤维素稀释，用于所有脚手架，以避免管道错误。将脚手架稀疏地放在疏水表面的顶部，用 30 微升纤维素稀释覆盖每个脚手架。更换板盖，将纤维素覆盖的脚手架放入一个孵化器中，温度为 37 摄氏度，湿度为 100%，最少一小时。

孵化后，轻轻冲洗PBS中的脚手架，去除纤维素残留物。脚手架可在 PBS 中保存在摄氏四度，最长达一周。通过将基底介质与相应的中等套件组件混合，包括制造商指出的抗生素溶液、FBS 和内皮细胞生长补充剂，准备内皮细胞或 EC 介质。

使人体脂肪微血管内皮细胞悬浮在EC介质中，每毫升浓度为400万细胞。使用钳子，将每口井一个纤维素涂层脚手架放在非TC 24井板中。用 25 个微滑滴覆盖每个脚手架，确保不要让悬架从脚手架上流出。

将盖子盖在盘子上，放在37摄氏度、5%二氧化碳和100%湿度的孵化器中，60至90分钟。孵化后，每口井中填充700微升EC介质。孵化内皮脚手架，直到使用荧光显微镜或三天观察EC汇合。

每隔一天更换一次媒体。通过混合 500 毫升低葡萄糖 DMEM、57.5 毫升 FBS、5.75 毫升非必需氨基酸、5.75 毫升麸质MAX 和 5.75 毫升青霉素-链霉素-尼他汀溶液来准备 DPSC 介质。将内皮脚手架转移到新的非TC 24井板中。

使用移液器或吸尘器从当前板中丢弃所有介质，注意不要将真空直接涂抹在脚手架上。将一个脚手架放入每个油井的中心，然后用光真空干燥周围区域。与PBS一起稀释血栓和纤维素库存解决方案，最终浓度分别为每毫升5个单位和每毫升15毫克。

在血栓稀释中准备每毫升悬架 800 万 DPSC，并将悬架的 12.5 微升分配到每个脚手架的单个微管中播种。将 5 到 50 微升移液器设置为 12.5 微升，并填充纤维蛋白原溶液。无需取出尖端，将移液器设置为 25 微升。

尖端的材料应上升并留下空体积。慢慢按下柱塞按钮，直到液体到达尖端开口，但不会泄漏出去。将柱塞放在这个位置，并将尖端放入含有血栓悬架中细胞的微中性管中，确保尖端与液体接触。

轻轻释放柱塞按钮，并将单元格悬架拉入尖端。彻底混合两种材料，避免气泡形成。快速将混合材料分配到内皮脚手架上。

重复每个脚手架以前的步骤，确保在使用之间更改提示，以避免尖端内意外的纤维蛋白凝胶形成。更换板盖，在37摄氏度、5%二氧化碳和100%湿度下孵化脚手架30分钟。孵化后，在每口井中填充一毫升一对一的 DPSC 和 EC 介质。

文化一周，每隔一天改变一次媒体。在文化时期的不同时间点，从井中取出介质，并用共聚焦显微镜对构造进行成像，以研究血管发育或任何其他感兴趣的参数。该协议允许制造由SU-8光还器制成的特塞尔脚手架。

获得具有不同隔间几何形状和高度准确和可重复特征的脚手架。传统的内皮细胞和支持细胞同时播种，细胞均匀地分布在脚手架上，导致不可预知和混乱的血管网络。相反，分步细胞播种导致高度有序的血管网络。

使用荧光内皮细胞时，可以实时对血管进行成像。表达内皮细胞的红色荧光蛋白在六边形脚手架上培养并成像。支持单元在第一天被添加，血管网络每隔一天被成像，以量化血管发育。

每个时间点都拍摄了整个脚手架的宽图像。船舶增长按船舶总长度和面积进行量化。进行了共焦成像延时，允许使用多色内皮细胞进行单个血管跟踪。

船只路径是从延时生成的，因此可以观察船只的迁移。容器成熟是由光滑的肌肉作用和支撑细胞的存在观察到的。对于圆形、六边形和方形隔间，细胞会繁殖并组织成结构。

到第七天，所有形状都显示出一个丰富而复杂的血管网络。更高的放大图像显示，更密集的平滑肌肉作用和支撑细胞的存在与形成的血管共同本地化，证明支持细胞招募和血管结构周围的分化。该技术可用于研究三维血管网络在暴露于不同条件下的行为，如特定的细胞抑制剂或在存在其他细胞类型时的行为。