Name: 从鸡胚胎的直膜到研究棒到锥细胞相互作用的锥形丰富文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习从鸡胚胎视网膜分离并培养视锥细胞富集培养物的方法，用于研究视锥细胞代谢与存活因子。该技术可筛选促进视锥细胞存活的分子，为遗传性视网膜变性的治疗提供潜在靶点。

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作者感谢 Jacques Bellalou、Lorelei Fournier、Emmanuelle Clérin、Frédéric Blond 以及 农业有限责任公司 （法国莫里佐厄尔危险地区）提供的宝贵帮助。本研究由法国国家健康与医学研究院（Inserm）、索邦大学及 法国国家科研署 （ANR，Labex Lifesenses）、美国防盲基金会以及由法国国家研究局（ANR）管理的国家资金资助的 IHU FOReSIGHT［ANR-18-IAHU-0001］ 未来投资 程序

该实验方案已获得皮埃尔和玛丽·居里大学动物实验伦理委员会及法国研究部的批准（许可编号：APAFIS#1028 2015070211275177）。动物实验在以下许可授权下进行：&#34;Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris（2011年11月9日–2016年11月8日）&#34;。
1. 受精卵的孵育
<ol>
	<li>在工业孵化场通过自然交配收集每周受精的卵（品系 I 657，红色标签）。</li>
	<li>将受精卵带回实验室后，在17°C（其生物学零度）条件下进行培养 &#34;产卵&#34; 由母鸡产出。</li>
	<li>每个培养组中，将7枚受精卵置于湿润培养室中，先在20 °C下孵育24小时，随后在37 °C下孵育136小时，并间歇性反转卵的倾斜方向（每4小时为一个周期，其中2小时从一侧逐渐转向另一侧）。</li>
</ol>
2. 鸡胚的回收
<ol>
	<li>用消毒剂（如 Pursept A express）清洗7个鸡蛋的表面。</li>
	<li>用大号直嘴钳在蛋壳顶部开一个小孔，然后切割蛋壳，将蛋壳顶部取下，如同制作溏心蛋一般。</li>
	<li>用弯头镊子轻轻将每个胚胎从蛋壳中取出，然后转移至含有已预热至 37 °C 的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。轻轻去除包裹胚胎的膜结构（即绒毛膜或尿囊绒毛膜）。</li>
	<li>通过与哈姆格伦和汉密尔顿（Hamburger and Hamilton）标准进行视觉比对，确定每个胚胎的发育阶段42.</li>
	<li>选择两个处于29期的胚胎th 发育阶段（图1）。翅膀在肘部弯曲。衣领明显突出。喙比第28天时更显著。th 阶段</li>
	<li>摘除所选胚胎的眼球，并将其转移至CO2-独立培养基（Life technologies） 
	注意：胚胎必须处于第29期，而不能是第28期或第30期（图1）；因此，即使最终只使用两个胚胎，也至少需要孵育7个卵。卵壳膜非常薄，难以辨认，但它紧贴胚胎，因此必须在不接触胚胎的情况下将其去除。</li>
</ol>
3. 视网膜的解剖分离
<ol>
	<li>使用弯头镊子将选定的胚胎去头并去眼球。</li>
	<li>将四个眼球转移至不含 CO2 的培养基中。该培养基含有 0.9 mM CaCl2 和 0.65 mM MgCl2。</li>
	<li>将眼球放置为角膜面朝下，视神经面向操作者。使用两把直头镊子在视神经处钻出一个小孔。</li>
	<li>将每把镊子的一个分支插入视网膜与色素上皮之间（图2）。牵拉两把镊子并旋转眼球，使色素上皮与视网膜分离。随后移除角膜，接着取出晶状体和玻璃体。</li>
	<li>将四个视网膜转移至含有 pH 7.2 的任氏液的培养皿中。 
	&#8203;注意：确保仅保留视网膜组织，并彻底清除任何残留的玻璃体及视网膜色素上皮。</li>
</ol>
4. 制备视网膜细胞悬液
<ol>
	<li>使用两把直头镊子将四块视网膜切成非常小的碎片。</li>
	<li>用林格氏液将视网膜碎片清洗两次。</li>
	<li>第二次用林格氏液清洗后，让视网膜碎片沉降至管底，吸除林格氏液。加入0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液，在37 °C条件下处理20分钟。</li>
	<li>10分钟后通过反复吹吸使溶液分散，使用巴斯德移液管进行吹打，并检查视网膜碎片的解离情况。加入含10%灭活胎牛血清的培养基以终止反应。</li>
	<li>在细胞悬液中加入0.05 mg DNase I，立即使用巴斯德移液管反复吹吸，以解离细胞团块和DNA。</li>
	<li>用化学成分确定的培养基（CDCM）将视网膜细胞悬液清洗两次：CDCM由等体积的DMEM培养基和M199培养基组成，添加100 µg/mL亚油酸/BSA、0.86 µM胰岛素、0.07 µM转铁蛋白、2.0 µM孕酮、0.28 µM前列腺素、0.29 µM Na2SeO3、182 µM腐胺、3 mM牛磺酸、4.7 µM胞苷5′-二磷酸胆碱、2.7 µM胞苷5′-二磷酸乙醇胺、0.55 µM氢化可的松、0.03 µM三碘甲腺原氨酸、1 mM丙酮酸钠和20 µM庆大霉素。</li>
</ol>
5. 视网膜细胞接种
<ol>
	<li>用多聚-L-赖氨酸（32.25 µg/cm2）在37 °C下处理两个带透明底的黑色96孔培养板，处理2小时。</li>
	<li>用M199培养基将这些培养板冲洗两次。将细胞沉淀重悬于1 mL CDCM中。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液，加入台盼蓝染色活细胞。将染色后的细胞悬液样品加入血细胞计数板（Malassez细胞计数室）。
	<ol>
		<li>在显微镜下计数血细胞计数板四个区域的染色细胞（即40个方格），然后计算每行（10个方格）的平均细胞数。按以下方法计算细胞悬液的浓度：细胞悬液中细胞数/mL&#160;= 每行平均细胞数（10个方格）× 10 × 血细胞计数板总方格数 × 台盼蓝稀释倍数 × 1,000（将结果表示为细胞/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用CDCM将细胞悬液调整为两种浓度（5.6 × 104 个细胞/mL 和 1.12 × 105 个细胞/mL），分别对应两种接种密度（1 × 105 个细胞/cm2 和 2 × 105 个细胞/cm2）。</li>
	<li>将两种细胞悬液各50 µL接种至两个预处理过的黑色96孔培养板中。使用多通道移液器从培养板右侧向左侧逐列加样，并在每列之间充分混匀，确保细胞分布均匀。</li>
	<li>按照预设模式（表1），向培养板中加入50 µL待筛选的分子文库（例如cDNA文库的条件培养基，见下文）。</li>
	<li>将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育7天，期间不更换培养基。</li>
</ol>
6. 计数活细胞
<ol>
	<li>向每孔中加入 2.7 µM 的钙黄绿素 AM 和 0.3 mM 的碘化乙啶同型二聚体。 
	注意：钙黄绿素可进入活细胞，而对大分子如碘化乙啶同型二聚体不通透。在活细胞的细胞质中，钙黄绿素被内源性酯酶水解后，在 485 nm 激发下于 520 nm 处发出绿色荧光。碘化乙啶同型二聚体则可结合死细胞中的 DNA，其与 DNA 结合后在 520 nm 激发下于 635 nm 处发出红色荧光。</li>
	<li>将培养板在室温、避光条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>使用配备汞灯、激发滤光片（485 nm 和 520 nm）、发射滤光片（520 nm 和 635 nm）、物镜（×10）、由处理器控制的电动载物台以及电荷耦合器件相机（CCD）的倒置显微镜组成的自动酶标仪读取荧光信号。该细胞计数平台由 Metamorph 软件19 控制，可同时获取 96 孔板中每个孔内活细胞和死细胞的荧光图像，扫描顺序为从 A1 孔至 A12 孔，随后从 B12 孔至 B1 孔，再从 C1 孔至 C12 孔，依此类推（表 I）。</li>
	<li>利用 18 个阴性对照孔（表 I）计算单个细胞的平均面积 A。</li>
	<li>对每孔中的细胞进行计数，并应用以下经验公式 A × 29 / 20.7，以避免将双细胞（两个细胞聚集）误计为单个细胞。通过计算待测分子处理组 4 个孔的平均细胞数与阴性对照组 18 个孔的平均细胞数之比，评估锥体分子的保护作用（见 表 1 和 补充图 1）。</li>
	<li>整合接种密度为 1 × 105 个细胞/cm2 和 2 × 105 个细胞/cm2 的两块培养板的结果，以评估所筛选的每种分子可能提供的保护作用（细胞活力比值）。</li>
</ol>

TL、J-AS 和 VF 持有使用 EdCVF 治疗视网膜变性的专利 [WO2009071659 (A1)，2007 年 6 月 12 日]。

在从鸡胚中培养富集视锥细胞的培养物时，可能限制其生产的诸多参数中，首要的关键步骤是准确定位孵化蛋中胚胎的发育阶段。已观察到，从孵化第8天（ED8，34小时）胚胎的视网膜中分离细胞进行培养时，th 阶段）仅产生35%的光感受器，其余65%由其他类型的神经元构成4无论采用何种方法获取孵化的卵，都必须精细调节温度和孵化时间，并将胚胎与各发育阶段的参考图进行仔细比对观察。42,45.
最初，富集视锥细胞的培养体系是利用白来航鸡品系建立的4。该品系鸡蛋的白色外壳在法国并不受欢迎，因此我们选用了一种产棕色蛋的鸡品系。我们使用的是I 657品系，由I 66公鸡与JA57母鸡杂交获得5。我们成功重现了原始培养体系的特征，这表明鸡的遗传背景对于获得视锥细胞富集培养物并非关键因素。
我们尚未测试单独去除培养基中各补充成分的影响，但已观察到胰岛素在rd1小鼠模型（一种常染色体隐性视网膜色素变性模型）中对视锥细胞存活具有关键作用46。根据甲状腺激素受体在视网膜细胞命运决定发育过程中的作用，三碘甲腺原氨酸（T3）也可能参与鸡胚视网膜前体细胞向视锥细胞的分化过程40。因此，该富集视锥细胞的培养系统不能用于通过表达克隆技术鉴定胰岛素的作用46。
视锥细胞富集培养系统依赖于原代神经元的培养，相较于依赖永生化细胞系（如661W细胞系）的方法更为合适24,25,26。
此处所述方法可通过预先进行质粒DNA电穿孔加以改进20。在制备视网膜细胞悬液之前，将整个视网膜置于自制电穿孔仪的腔室中，加入120 µL含有0.5 µg/µL质粒DNA的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA溶液。施加5次15 V、每次50 ms的电脉冲，脉冲间隔为950 ms22。尝试利用具有复制能力的禽类剪接型（RCAS）逆转录病毒将干扰RNA（RNAi）递送至富集视锥细胞的培养物中未获成功47。这显然是由于在无血清且低密度培养条件下，视网膜前体细胞不具备增殖能力，而细胞增殖是逆转录病毒传播所必需的条件。
我们开发了富集视锥细胞的培养系统，通过表达克隆技术来鉴定促进视锥细胞存活的营养因子19。为了使该方法具有可行性，我们首先采用来自100个克隆混合物的条件培养基进行高通量内容筛选。即使文库中的cDNA在转染COS-1细胞后由强效的CMV启动子驱动表达，也不能保证所有由单个cDNA编码的蛋白质都能达到足以在存活率检测中呈阳性的浓度，这是一个主要的局限性。因此，任何筛选都不可能是真正全面的。此外，即使条件培养基中未去除膜蛋白，该检测体系的构型也不利于识别非扩散性因子。另一种方法是在获得cDNA序列后对单个克隆进行筛选，以避免多次检测同一候选蛋白而造成重复。我们已通过测序所使用的视网膜cDNA文库启动了这一工作43。尽管这一策略合乎逻辑，但也存在其局限性。对cDNA序列进行生物信息学分析时，不可避免地会在降低冗余的同时，基于已有知识对某些克隆的筛选进行优先排序。如果最终仍能对整个文库完成筛选，尽管所需时间将显著延长，这种做法不会造成实质性损害。但不可否认的是，序列的身份将影响我们对结果的解读方式，而这种影响并非中立，因为序列的解释自然会与实验数据之间产生竞争。
EdCVF 的鉴定还表明，高含量筛选存在技术局限性。在第一轮筛选中，我们鉴定出两个活性较高的文库（补充图 1）。其中文库 0073 成功实现了 EdCVF 的鉴定，而文库 0080 未获得类似发现。我们尚未解决在制备亚文库过程中可能发生的活性克隆丢失问题。此外，尽管统计学上可能性较低，但也不能排除文库 0080 中的两种蛋白质可能存在协同作用，因而其活性在单独克隆中无法被观察到。
通过筛选小分子来鉴定能够保护视锥细胞的分子，是视锥细胞富集培养系统未来的一项应用。这类分子将对年龄相关性黄斑变性等不适合采用基因治疗的视网膜病理疾病的治疗具有重要价值。

脊椎动物的视网膜具有双重结构，其中视杆光感受器负责弱光视觉，视锥光感受器则负责日光、色彩和高敏锐度视觉。灵长类动物的视觉敏锐度依赖于视网膜中央的一个区域，称为黄斑中央凹（fovea），该区域富含视锥细胞，但总体而言，视锥细胞仅占所有光感受器的5%。因此，对灵长类动物视网膜中视锥细胞的研究，尤其是视锥细胞的培养，在技术上十分困难。其他所有哺乳动物均无黄斑中央凹，而常用于视网膜研究的啮齿类动物中视锥细胞的比例也很低。鸟类则不同，这类视觉敏锐的鸟类其视网膜主要由视锥细胞构成。在系统发育上，鸟类起源于恐龙，而恐龙在哺乳动物最初出现的进化阶段曾占据生态系统的主导地位1。由于恐龙与早期哺乳动物之间存在这种生态竞争，哺乳动物逐渐演化为以夜行性为主，其视网膜也以视杆细胞占主导。直到进化的后期，部分哺乳动物（包括灵长类）的日间视觉才逐渐成为一种进化优势。然而，这一祖先时期的夜行性特征仍作为“夜间瓶颈”（nocturnal bottleneck）的返祖现象，保留在哺乳动物视觉系统的进化历程中2,3。
在研究视网膜细胞分化时，Adler 和 Hatlee 发现，在来自胚胎第6天（ED6）或第29期鸡胚的培养物中，感光细胞约占视网膜分化细胞的&#160;70%4。由于鸡视网膜中视锥细胞占主导地位，因此已建立了来自ED6鸡胚的视网膜细胞培养体系，作为富集视锥细胞的培养模型5。
视锥细胞介导的视觉敏锐度对人类而言至关重要，这是一个不言而喻的事实。因遗传性或衰老相关疾病导致视锥细胞功能受损的患者会遭受严重障碍。这推动了大量关于遗传性视网膜变性（IRD）的研究，旨在为这些致盲性疾病寻找治疗方法6,7。首个成功案例是使用重组腺相关病毒载体（AAV）治疗一种严重的IRD——莱伯先天性黑蒙（LCA），该成果验证了基因治疗的概念8。致病基因的鉴定为通过基因治疗治愈这些疾病提供了可能。然而，这些疾病由超过200个不同基因的突变引起9。即使在常染色体隐性遗传形式的IRD中，虽然重新引入正常致病基因拷贝可能恢复视觉功能，但每种独立疗法的研发成本高昂，导致资源倾向于更常见的类型，而忽视了罕见类型以及遗传病因尚未明确的病例。这一现实促使研究人员思考更具普适性的治疗方法。细胞凋亡被发现是这些疾病中共有的通路，也是治疗靶点，尤其适用于以感光细胞退化为特征的疾病，包括常染色体显性遗传形式10,11。然而，此类策略尚未取得显著成功。对于最常见的IRD类型——视网膜色素变性（RP），其共同通路是继发性功能丧失，最终导致视锥细胞退化12,13。阻止视锥细胞功能的丧失将有助于保护黄斑中心凹的中央视力，而不受致病突变类型的影响14。
在视网膜色素变性（RP）的早期阶段，视杆细胞的丢失会引发由核还原素样1（NXNL1）基因编码的视杆细胞来源的视锥细胞存活因子（RdCVF）表达减少，从而中断视杆细胞与视锥细胞之间的代谢和氧化还原信号传递15。理论上，给予编码NXNL1基因两种产物——营养因子RdCVF和硫氧还蛋白酶RdCVFL——的重组AAV，可预防所有遗传形式RP中的视锥细胞视力丧失16。我们已证实，NXNL1基因产物RdCVFL在鸡视锥细胞富集培养物中表达17，并在其中发挥保护作用18。RdCVF及NXNL1基因是通过高通量筛选视网膜cDNA文库发现的，筛选以视锥细胞富集培养物中细胞存活为读出指标19。我们对文库中相当于210,000个独立克隆进行了筛选，每个克隆进行8项平行测试。如此庞大的测试量要求能够便捷地获取生物材料，即鸡胚胎的视网膜。我们发现，每周定期获取受精鸡卵相对容易，因为这些鸡卵在农业工业中被广泛用于蛋鸡和肉鸡的生产。在对视锥细胞富集培养条件进行严格标准化后，该系统提供了一种简便、稳健且可重复的方法，可用于检测数千种分子在维持视锥细胞存活能力方面的效果。这些细胞也适用于基因操作20，有利于信号转导研究以及生物化学分析21,22,23。
视网膜研究人员已开发出替代方法，例如使用锥细胞系661W24,25,26。然而，该细胞系的身份仍存在争议27,28。661W细胞克隆自一种转基因小鼠品系的视网膜肿瘤，该小鼠品系在人视锥视杆间结合蛋白启动子的调控下表达SV40大T抗原。SV40大T抗原介导细胞转化和永生化。因此，利用661W细胞鉴定出的信号通路必须结合该细胞系为转化且永生化细胞系这一背景进行解读，而该细胞系在许多方面均不同于原位的视锥细胞。在这方面，富集视锥细胞的培养系统由原代神经元组成，即生理上更具相关性的视锥细胞。
尽管可以通过振动切片机对小鼠视网膜进行切片以获得纯化的感光细胞培养物，但啮齿类动物视网膜外层中视锥细胞的比例极低，因此该方法不适合用于制备富集视锥细胞的培养物29。猪的视网膜没有中央凹，但存在一个称为area centralis的区域，该区域富含视锥细胞30。日行性啮齿类动物（如Arvicanthis ansorgei和Psammomys obsesus）的视网膜中视锥细胞比例较高31,32，这可能提供一种替代方案，但需要饲养这些非本地物种。成年猪的眼球可从当地屠宰场获取，可用于制备视杆细胞和视锥细胞的混合培养物，并已被用于研究感光细胞的存活33。一种精巧的方法是利用花生凝集素（peanut agglutinin, PNA）进行免疫黏附富集，该凝集素可特异性结合视锥细胞，从而预先纯化猪视网膜中的视锥细胞34。然而，由于该方法操作复杂，难以实现大规模应用。
人诱导性多能干细胞（iPS）为获得可用于视网膜移植的视锥光感受器细胞群体提供了最有前景的方法，同时也可适用于富集视锥细胞的培养体系35,36。由于转录因子NRL是视杆光感受器发育所必需的37，Nrl-/- 小鼠的视网膜主要由短波视锥细胞（S-视锥细胞）构成。该基因的失活可用于指导人iPS细胞分化，从而获得富集S-视锥细胞的细胞制备物38,39。另一种可能的策略是利用甲状腺激素信号通路促进视锥细胞的分化40。尽管从人iPS细胞制备富集视锥细胞的新方法正在不断出现，鸡胚仍是目前已被证实的有效方法19。
视锥细胞富集培养体系在通过表达克隆鉴定RdCVF的过程中发挥了关键作用19。该体系还被成功用于证明RdCVF可促进葡萄糖的摄取及其通过有氧糖酵解的代谢过程22。此外，视锥细胞富集培养也被用于验证RdCVFL的保护作用，后者是NXNL1基因的第二个表达产物23。最近，该体系还被用于证明经OTX2转导的视网膜色素上皮细胞可分泌具有保护作用的分子41。

<table><tbody><tr><td>96 孔黑色培养板（带盖透明按钮，经组织培养处理）</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap&amp;nbsp; FX HQ</td><td></td></tr><tr><td>CDPC（胞苷-5&amp;prime;-二磷酸胆碱钠盐二水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 独立培养箱</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Dutscher</td><td>005093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>鸡蛋孵化箱</td><td>FarmLine</td><td>M08 01 3100</td><td></td></tr><tr><td>碘化乙啶同二聚体（Ethidium Homodimer）</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>E1169</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;oelig;tal bovine serum</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素（Gentamycin）</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松（Hydrocortisone）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0880</td><td></td></tr><tr><td>ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>大型直头钳</td><td>Dutscher</td><td>005074</td><td></td></tr><tr><td>亚油酸（Linoleic acid）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td></td></tr><tr><td>M199 培养基</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 软件</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>NIKON</td><td>Eclipse TE2000</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>Martzauzer</td><td>Mutlicontrol 2000</td><td></td></tr><tr><td>光学滤光片切换器</td><td>Shutter Instrument company</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>14190-086</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸（Poly-L-lysine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>孕酮（Progesterone）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Pursept A express</td><td>Fisher scientific</td><td>11814110</td><td></td></tr><tr><td>腐胺（Putriscine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（Sodium pyruvate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>直头镊子</td><td>Dutscher</td><td>005092</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸（Taurine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸（Triiodothyronine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝（Trypan blue）</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶（Trypsine 0.25 %）</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

利用鸡胚视网膜的富集视锥细胞培养体系研究视杆细胞与视锥细胞间的相互作用

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

人类的日间视觉依赖于视网膜中央凹处视锥感光细胞的功能。患有最常见遗传性视网膜变性——视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）的患者，由于杆状感光细胞因基因突变而丧失，导致夜视能力下降；随后，视锥细胞功能逐渐退化并死亡，最终导致失明。遗传学家已鉴定出许多导致该疾病的致病基因，但最早发现的突变引发了关于继发性视锥细胞退化机制的疑问：为何视紫红质基因中的显性突变（该基因编码的视觉色素仅在杆状细胞中表达）能够触发视锥细胞的退化？
在该疾病的遗传模型中进行移植实验的结果，提出了视杆细胞与视锥细胞之间存在细胞相互作用，以及在所有遗传形式的视网膜色素变性中，视锥细胞均发生非细胞自主性变性的概念。
视锥细胞在人类所有感光细胞中约占5%，在小鼠中仅占3%，因此在这些物种中研究视锥细胞较为困难，而在鸟类物种中视锥细胞数量超过视杆细胞。我们已采用96孔板培养发育至第29阶段的鸡胚视网膜中的视网膜前体细胞。在这些原代培养细胞中，体外分化后视锥细胞占细胞总数的80%。在无血清条件下，细胞会在一周内逐渐退化。本文介绍了该方法及其标准化流程。
该富集视锥细胞的培养系统被用于通过高内涵筛选大鼠视网膜色素上皮细胞标准化cDNA文库，鉴定出由上皮细胞产生的视锥细胞存活因子（EdCVF）。重组EdCVF可防止视锥细胞的退化。

本文介绍了如何利用富集视锥细胞的培养系统来鉴定具有保护视锥细胞作用的新蛋白。我们采用该方案筛选了一个由8周龄Long-Evans大鼠的400只眼球的脉络膜和视网膜色素上皮组织构建的标准化cDNA文库43。
该文库包含 6.0 × 106 个独立的菌落形成单位（CFUs），克隆插入片段的平均长度为 2.1 千碱基（kb），其中重组克隆比例超过 99%。从该文库中选取每 100 个克隆组成一组，将 0.1 µg 质粒 DNA 瞬时转染至 COS-1 细胞中，转染后在无血清 DMEM 培养基中孵育 48 小时，收集条件培养基（CM）。未通过超速离心去除膜成分或外泌体。将每份 CM 各取 50 µL 加入两个 96 孔板的 4 个孔中：一个孔板的接种密度为 2 × 105 个细胞/cm2，另一个为 4 × 105 个细胞/cm2。使用空载体 pcDNA3.1 转染 COS-1 细胞所获得的 CM 作为阴性对照（表 1）。总共评估了 2,112 组（每组 100 个克隆），相当于 211,200 个独立克隆，在两种锥状细胞富集培养条件下的四个培养孔中进行检测。这两种条件对应于两种略有不同的接种密度，从而可更精确地评估保护活性，总计涉及 1,689,600 个培养孔。
在42个比值大于2的克隆池中，克隆池0080和0073在培养7天后的存活率分别比阴性对照pcDNA3.1高出16倍和14倍（补充图1）。该分析对于鉴定感兴趣的克隆池至关重要。每个选定的含100个克隆的池均从其甘油菌种中进一步分为16个子池，每个子池包含10个克隆。这些子池按照相同方法进行制备和检测，进入第二轮筛选（即共3,200个培养孔）。其中，子池0073-09表现出最强的存活率（补充图2A），并进一步划分为16个单克隆，在富含视锥细胞的培养物中进行第三轮筛选。克隆0073-09-37明显优于其他克隆，其存活率比值达到2.5（补充图2B）。尽管接种密度与补充图2A相同，但纵坐标采用不同的尺度，这种情况在每周重复实验持续数月时较为常见。经分析，这些结果证实克隆0073-09-37对视锥细胞存活具有显著且可重复的促进作用。该实验已独立重复验证（图3A），并对其1.8 kb的插入片段进行了测序（图3B）。
生物信息学分析显示，我们将克隆0073-09-37命名为上皮来源的视锥细胞存活因子（epithelium-derived cone viability factor, EdCVF），其包含三个开放阅读框（ORFs），其中最上游的一个（ORF1）编码大鼠锌指蛋白-180（ZFP180, NP_653358）C端727个氨基酸中的84个残基44。另外两个开放阅读框（ORF2和ORF3）在小鼠中保守性较低，在其他哺乳动物中则不存在。独立测试时，仅有ORF1对视锥细胞具有保护作用（补充图3）。ORF1被表达为谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）融合蛋白（图4A）。EdCVF蛋白经纯化后去除GST标签（图4B）。EdCVF能够在富集视锥细胞的培养系统中防止视锥细胞退化（图4C）。
<img alt="胚胎发育阶段28-30，发育生物学示意图，解剖结构标注。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：28期的鸡胚th, 29th 和 30th 发育过程 箭头：W：翅，C：领羽，B：喙。比例尺为1厘米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="视网膜分离过程示意图，包含步骤：打开卵壳、去核、组织分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：鸡胚视网膜的解剖过程<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图比较细胞活力，阴性对照 vs. 0073-09-37；DNA序列文本结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：上皮来源的视锥细胞活力因子（EdCVF），克隆编号 0073-09-37。A. 在富集视锥细胞的培养物中活力增强。B. cDNA 克隆 0073-09-37 的序列。下划线序列 GAATTC 是用于构建文库的 EcoRI 限制性酶切位点。加粗的两个密码子 GTG 是来源于载体的 EdCVF 非常见翻译起始位点。统计学分析采用 Student's t 检验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑过程；DNA序列、电泳结果、蛋白质分析；实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：重组EdCVF活性。 A. EdCVF与谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合后的序列。 B. 纯化的重组EdCVF蛋白。 C. GST-EdCVF在培养锥状细胞中的营养活性。采用Tukey检验进行统计分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：第一轮筛选中，cDNA文库的平均细胞数与阴性对照（转染空载体pcDNA3.1的COS-1细胞的条件培养基）的比值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplemntary_File_1_12_11_2020.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2： 存活细胞数量。A. 使用0073池的亚池进行的第二轮筛选。B. 使用分离的克隆进行的第三轮筛选。CN：转染空载体pcDNA3.1的COS-1细胞的条件培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_Figure_2_12_11_2020.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a> 
补充图3: 分离克隆0073-09-37的三个开放阅读框的营养活性 使用邓尼特检验进行统计分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_figure_3.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>NC</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>NC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>NC</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>NC</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>6</td>
			<td>NC</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>NC</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>NC</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>NC</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>NC</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>NC</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>NC</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>NC</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>17</td>
			<td>NC</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>NC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>NC</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>NC</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="13">NC 为阴性对照</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="13">1-20 为四次重复检测的样本池位置</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：高内涵筛选96孔板布局方案

我们描述了一种从鸡胚视网膜中获取视锥光感受器原代培养物的方法，并介绍了其在高内涵筛选中的应用。

人类日间视觉依赖于视网膜中央凹处视锥光感受器的功能。患有最常见形式……的患者

该方法用于研究对日间视觉至关重要的视锥感光细胞。该方法的优势在于使用受精的鸡卵，其易于获取，是目前唯一可获得原代视锥细胞培养的来源之一。本实验方案已被用于鉴定杆细胞来源的视锥细胞存活因子，该因子有望成为遗传性视网膜变性疾病的未来治疗手段。此外，该方案还可用于研究视锥光感受器的代谢。通过严格遵循所述方案，具备原代细胞培养经验的研究人员仅需尝试数次即可获得富含视锥细胞的培养物。首先从工业孵化场收集每周受精的鸡蛋。在实验室中将受精卵保持在17摄氏度。每份培养物中，将7枚受精卵在20摄氏度下孵育24小时，随后在37摄氏度的湿润培养箱中孵育136小时，并间歇性地改变倾斜方向。为获取鸡胚，先用消毒剂清洗蛋壳表面，然后用大号直头镊子在蛋壳顶端打孔并敲碎蛋壳，再切割蛋壳以移除蛋壳顶部。用弯头镊子轻轻将每个胚胎从蛋壳中取出，并转移至含有已预热至 37°C 的无菌 PBS 的培养皿中。仔细去除包裹胚胎的包膜。通过与 Hamburger 和 Hamilton 标准发育图谱进行视觉比对，确认每个胚胎的发育阶段，并选取两个处于第 29 发育阶段的胚胎。去除此选定胚胎的眼球晶状体，并将其转移至不含二氧化碳的培养基中。在不含二氧化碳的培养基中操作，将四只眼球放置成角膜朝下、视神经朝向实验者的方向。使用两把直镊在视神经上钻一个小孔。将每把镊子的一个分支插入视网膜与色素上皮层之间，然后牵拉并旋转眼球，使色素上皮层与视网膜分离。移除角膜，随后取出晶状体和玻璃体。将四块视网膜转移至含有pH 7.2 Ringer液的培养皿中。使用两把直镊子将四块视网膜剪成非常小的碎片，并用Ringer液清洗碎片两次。第二次洗涤后，让视网膜组织块沉降至管底，然后吸除培养基。将视网膜组织块用胰蛋白酶溶液在37°C下处理20分钟。20分钟后，加入含有10%灭活胎牛血清的培养基以终止反应。将细胞悬液与0.05 mg DNase 1共同孵育，然后立即用移液器反复吹打，以解离细胞团簇和DNA。用化学成分明确的培养基（CDM）将视网膜细胞悬液洗涤两次。将两块底部透明的黑色96孔培养板在37摄氏度下用多聚赖氨酸处理两小时。完成操作后，用 M199 培养基将培养板冲洗两次。取 10 微升细胞悬液，加入台盼蓝染色活细胞。然后将细胞悬液样品加入血细胞计数板中。计数细胞后，使用 CDM 将细胞悬液调整至适当浓度。按照预定义的模式，加入 50 微升待筛选的分子文库。将 50 微升的两种细胞悬液分别接种到两个预处理的黑色 96 孔培养板中。使用多通道移液器从培养板右侧向左侧分配细胞，并在每列之间充分混匀。随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育七天，期间不更换培养基。为计数活细胞，向培养板的每个孔中加入2.7 µM钙黄绿素AM和0.3 mM碘化丙啶同型双聚体。在避光条件下，于室温孵育平板一小时。使用配备汞灯的自动化平板读数仪检测荧光，该读数仪包含倒置显微镜，汞灯具有485纳米和520纳米两个激发滤光片，520纳米和635纳米两个发射滤光片，以及一个电荷耦合器件（CCD）相机。本实验方案用于筛选由8周龄Long-Evans大鼠400只眼球的脉络膜和视网膜色素上皮组织构建的标准化cDNA文库。总共评估了 2,112 组包含 100 个克隆的样本，共计 211,200 个独立克隆。在 42 个克隆池中，其比值大于 2，其中克隆池 0080 和 0073 在培养七天后，存活率分别比阴性对照高 16 倍和 14 倍。每个选定的包含 100 个克隆的样本均从其甘油菌种中进一步细分为 16 组，每组包含 10 个克隆。亚克隆池0073-09显示出最高的存活力比率，并被进一步划分为16个独立的克隆，这些克隆在第三轮筛选中于视锥细胞富集的培养物上进行了测试。其中克隆0073-09-37表现突出，其存活力比率达到2.5。进一步分析证实，该克隆对视锥细胞存活具有显著且可重复的作用。该实验独立重复进行，1.8 千碱基的插入片段被测序。生物信息学分析显示，克隆 0073-09-37 含有三个开放阅读框，该克隆被命名为视网膜上皮来源的视锥细胞存活因子（Epithelium-Derived Cone Viability Factor，EdCVF）。独立测试时，仅 ORF1 对视锥细胞具有保护作用。ORF1 以谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的形式表达。上皮来源的视锥细胞存活因子被纯化后，去除了 GST 标签。营养活性分析表明，在富含视锥细胞的培养体系中，EdCVF 能够防止视锥细胞退化。进行该操作时，应仔细检查胚胎的发育阶段，以获得富含视锥细胞的培养物。按照本方案，可用质粒 DNA 对细胞进行电穿孔，以研究任何存活因子（如 RdCVF）的分子机制。该技术为代谢研究铺平了道路，包括视锥细胞存活的数学模型构建。

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