小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞作为精子替代物的应用

该方案错误地将单倍体小鼠胚胎干细胞中基因组印记修饰的时间归因于本研究，由于使用了假精子，从而实现了在小鼠中生成自体胚胎。通常，配子的遗传修饰需要复杂的技术。通过本方法，可对杂合胚胎干细胞中的亲本配子进行操作，并将其作为精子替代方案引入小鼠体内。

由于该方法能够实现对胚胎中父源配子的人工特异性修饰，因此特别适用于基因组印记和基因失活的研究。本实验操作将由本实验室的小鼠胚胎学家 Charles Etienne Dumeau 演示。实验前，首先使用微量移液器拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成细长且逐渐 taper 的形状，以制备持卵管和显微注射针。

制备持握移液管时，将拉制好的毛细管（外径为 60 至 100 微米）置于微熔器上，使其位于灯丝的玻璃珠上方。打开灯丝电源，缓慢下移毛细管直至接触玻璃珠。当毛细管与玻璃珠接触并粘附后，关闭灯丝电源并上提毛细管，使毛细管断裂形成平直末端。

接下来，将断裂的毛细管尖端水平放置在灯丝上的玻璃珠旁，加热灯丝使毛细管末端熔化，直至其内径达到10至20微米。然后将毛细管置于玻璃珠上方，距离尖端约一毫米处，加热灯丝使毛细管弯曲成20度角。制备显微注射移液管时，将已拉制的毛细管（外径约六微米）置于加热灯丝上的玻璃珠上方，并缓慢下移毛细管直至接触玻璃珠。

毛细管附着后，关闭加热丝并回撤毛细管，毛细管将断裂形成平直末端。随后将毛细管移至玻璃珠上方，距离毛细管尖端约一毫米处，加热加热丝使毛细管弯曲成20度角。

进行胞质内注射时，将5微升聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液和20微升M2培养基滴加到直径10厘米培养皿倒置的盖子上，并用矿物油覆盖液滴。将培养皿置于显微镜载物台上，并在显微操作仪上安装持卵针。使用微量加样器吸头将氟碳油注入显微注射针中，然后将注射针安装到压电驱动器上。

在显微镜下观察，将显微注射针插入一滴PVP溶液中。当注射针浸入溶液后，反复吸取数次，使玻璃表面均匀涂覆PVP。向显微注射针中吸入少量PVP溶液。

将显微注射针和持卵针浸入M2培养基中，并聚焦于液滴底部的针尖。取约2微升的双基因敲除孤雌发育ES细胞悬液，转移至M2培养基液滴中，再用口吸管将10个M2期卵母细胞转移至同一液滴。旋转其中一个卵母细胞，并通过持卵针施加负压固定卵母细胞，使卵周隙朝向显微注射针，注意确保第二次减数分裂中期板不在显微注射针的进针路径上。

吸取一个双基因敲除的孤雌激活胚胎干细胞至显微注射针尖端，确认细胞膜破裂。对显微注射针施加轻微负压，同时向透明带下方的卵周隙推进针尖，并施加四次压电脉冲以穿透透明带。将显微注射针插入卵母细胞，使卵细胞膜伸展至对侧，然后施加一次压电脉冲刺破卵细胞膜，确保卵细胞膜沿显微注射针针身方向松弛展开。

将双基因敲除的孤雌生殖ES细胞连同最少量的培养基注入卵母细胞的细胞质中，然后将显微注射针平稳地从卵母细胞中退出。松开固定针，释放已注射的卵母细胞，并将其移至微滴的一侧，以便后续收集。当所有卵母细胞注射完成后，将其转移至含有KSOM培养基的预热中心井培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时，随后进行激活。

通过流式细胞术对这条携带CAG/EGFP转基因的代表性双敲除孤雌激活ES细胞系进行DNA含量分析，展示了单倍体和二倍体细胞在G0、G1、S以及G2/M期的分布情况。可通过基因分型确认H19和基因间差异甲基化区域中野生型等位基因的缺失。可将CAG/EGFP转基因导入双敲除致病性ES细胞中，通过显微镜下观察绿色荧光，研究其在半克隆胚胎中的贡献情况。

流式细胞术分析显示，在去黏连素处理后，出现两个细胞群体，分别对应于停滞在G2/M期的单倍体和二倍体细胞。未检测到1N单倍体峰，表明细胞的静止期周期已基本完成。显微注射后，在构建的半克隆胚胎中几乎无法检测到EGFP表达。

因为双敲除孤雌生殖ES细胞的细胞质分散到卵母细胞的大细胞质中。激活后6小时，可在显微镜下观察到多达三个极体，分别为卵母细胞的第一和第二极体，以及来自单倍体ESC的一个假极体。

为了证明其发育能力，半克隆胚胎可被培养至囊胚阶段。此外，将处于二细胞阶段的半克隆胚胎移植到受体雌鼠的输卵管后，可获得足月出生的雌性小鼠。在显微注射过程中，破坏单倍体胚胎干细胞的细胞膜至关重要，因为该细胞膜的存在会阻碍卵母细胞激活时的染色体分离。

除了孤雌生殖的单倍体胚胎干细胞外，也可使用雄核单倍体胚胎干细胞，从而可根据研究目的选择母本或父本配子作为精子替代物。