Name: 应用小鼠部分遗传类胚胎干细胞作为精子的替代品 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 了解利用孤雌单倍体胚胎干细胞替代精子构建半克隆胚胎的技术，通过显微注射将修饰后的细胞注入小鼠卵母细胞，实现基因组印记研究。该方法为生殖生物学和遗传学研究提供了新途径。

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我们感谢朱利奥·迪米宁博士（Dr. Giulio Di Minin）在phaESC细胞系建立方面的贡献，以及雷莫·弗赖曼博士（Dr. Remo Freimann）在流式细胞术操作方面的协助。同时感谢米歇尔·沙夫纳女士（Ms. Michèle Schaffner）和托马斯·M·亨内克先生（Mr. Thomas M. Hennek）在胚胎移植技术上的支持。本研究由瑞士国家科学基金会（资助号：31003A_152814/1）提供资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

哺乳动物的体细胞核移植（SCNT）克隆技术始于20世纪90年代19,20,21。这些进展是在30年前对两栖动物进行克隆研究的基础上发展而来的22。这一较长的延迟反映了哺乳动物胚胎学和基因组印记研究的困难。哺乳动物SCNT技术的发展为利用人孤雌激活胚胎干细胞（haESC）替代精子的应用奠定了基础，本实验方案对此进行了详细说明。
细胞周期同步化是体细胞核移植（SCNT）成功的重要因素23。在本方案中，向卵母细胞注射孤雄单倍体胚胎干细胞（haESC）同样需要考虑这一因素。将供体基因组引入受体时，必须使细胞周期阶段相匹配，以避免染色体断裂或非整倍性，从而导致胚胎发育失败。半克隆技术更为复杂，因为需要两个基因组与一个胞质体之间保持兼容性。先前有研究报道，将处于M期阻滞的孤雄单倍体胚胎干细胞注入卵母细胞，其产生的半克隆胚胎发育率优于G1期孤雄单倍体胚胎干细胞的注射7。该研究提示M期是适用于半克隆技术的细胞周期同步化节点。因此，本研究中将phaESC通过秋水仙胺处理在中期（metaphase）实现有丝分裂阻滞，并将其注入自然停滞于减数分裂II期中期（MII期）的卵母细胞胞质中。重要的是，小鼠胚胎干细胞可通过该方法高效实现M期阻滞，从而实现供体与受体细胞周期的高度同步。
在有丝分裂过程中，核膜破裂，形成纺锤体，复制的染色体附着于其上。将M期的DKO-phaESC注射后，姐妹染色单体被分至假极体和受精卵中7（图3E）。因此，来自一个DKO-phaESC的单套染色体可贡献于半克隆胚胎的形成。确保DKO-phaESC染色体的姐妹染色单体在注射后能够正确分离至关重要。完整的DKO-phaESC质膜会阻碍其向假极体的分离。我们确实观察到极少数情况下DKO-phaESC的质膜未被破坏，注射后在卵质中仍可见完整的DKO-phaESC（图3D）。因此，必须通过吹打小心去除DKO-phaESC的质膜。在注射过程中，同样重要的是避免破坏卵母细胞的减数分裂纺锤体，否则可能导致染色体分离异常并诱发非整倍性。
在哺乳动物中，基因组印记限制了孤雌激活胚胎干细胞（phaESCs）作为精子替代物的应用。孤雌激活的haESCs具有母源性的基因组印记构型，而精子则具有父源性的印记构型。因此，在将野生型phaESCs作为精子替代物进行注射后，未能产生足月幼崽。为克服这一限制，已在phaESCs中对IG-和H19-DMR区域进行基因删除改造。对母源性Igf2-H19和Gtl2-Dlk1位点的印记表达进行修饰，足以改变基因组印记构型，从而以超过5.1%的效率（基于移植的2细胞胚胎数）获得半克隆小鼠。这些结果表明，靶向调控两个印记基因可将phaESCs的基因组转变为具有功能性的父源构型，从而在小鼠中替代精子功能。然而，该策略需要对phaESCs进行永久性的遗传修饰。作为一种替代策略，可考虑使用雄核激活的haESCs。雄核激活的haESCs来源于精子基因组，具有父源性印记。已有报道称，野生型雄核激活haESCs作为精子替代物，可在1.3%至1.9%的移植胚胎中贡献发育并产生足月幼崽4,7,24。此外，将缺失IG-和H19-DMR的雄核激活haESCs注射后，可在20.2%的移植2细胞胚胎中获得足月幼崽24。利用经修饰的雄核激活haESCs进行半克隆的效率提高，可能是因为印记在培养过程中容易变得不稳定，而关键DMR的遗传删除可纠正这些印记缺陷。
考虑到直接对卵母细胞或精子基因组进行遗传修饰存在困难，孤雌单倍体胚胎干细胞（haESCs）成为独立操控亲本基因组的有力工具。利用haESCs替代精子，为小鼠生殖系基因组编辑提供了显著优势。最近一项研究将基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术与haESCs相结合，用于鉴定对胚胎发育至关重要的印记区区域。12本研究分析了 Rasgrf1-DMR 与 H19和 免疫球蛋白- DMRs 在双母源小鼠发育中的作用，以及7个不同DMRs在双父源小鼠发育中的功能。利用haESCs替代精子的方法为开展遗传筛选提供了基础，可用于鉴定原始生殖细胞发育过程中DND1蛋白中的关键氨基酸，以及鉴定骨骼发育相关基因。24,25,26基因组印记研究和遗传筛选以鉴定胚胎发育关键因子的相关研究相当广泛&#160;将人孤雌胚胎干细胞应用于配子基因组的策略。

在哺乳动物中，配子是唯一能够将遗传信息传递给下一代的细胞。卵母细胞与精子融合形成二倍体受精卵，进而发育为成体动物。因此，配子基因组中的突变可遗传给后代，并推动物种的遗传变异1。生殖系突变的引入已被用于制备转基因动物，以开展多种生物学研究，包括基因功能表征和疾病模型构建。卵母细胞和精子均为终末分化且高度特化的细胞，已停止增殖。因此，直接对配子进行遗传操作在技术上具有挑战性，需采用专门的方法。可通过将遗传修饰的小鼠胚胎干细胞（ESCs）注射入囊胚，使其整合至发育中的胚胎并定植于生殖系，从而实现对小鼠生殖系的遗传改造。此外，利用基因组编辑技术（包括CRISPR/Cas9系统）对受精卵进行遗传修饰的方法也已得到广泛应用2。
最近，一项杰出的方法被报道，该方法将孤雌或孤雄单倍体胚胎干细胞（haESCs）作为配子基因组的替代物3,4,5,6,7,8。haESCs 是从孤雌或孤雄来源的单倍体囊胚的内细胞团中建立的干细胞系，具有一套完整的单倍染色体组4,7,9,10。研究表明，将孤雌或孤雄来源的 haESCs 通过胞质内注射导入卵母细胞后，均可参与半克隆小鼠的基因组构建。与其他方法不同，由于 haESCs 具备自我更新能力，其基因组可在体外培养过程中直接进行遗传修饰。通过以 haESCs 替代精子将遗传修饰引入生殖系，是生物学研究中一种重要的手段。该方法使得分别来源于孤雌或孤雄 haESCs 的母源或父源基因组能够被独立地培养和操作。随后，haESCs 可作为配子基因组的替代物，这一策略在基因组印记、等位基因特异性表达以及亲本特异性生物学过程的研究中具有显著优势。
在小鼠中，正常胚胎发育需要母源和父源的基因组信息11。因此，当将野生型孤雌激活的单倍体胚胎干细胞（phaESCs）注射入卵母细胞以替代精子基因组时，无法获得足月出生的仔鼠5,8。为了克服这一发育阻滞，需要将孤雌激活的单倍体胚胎干细胞中母源基因组的基因组印记校正为父源构型。这可以通过对差异甲基化区域（DMRs）进行操作来实现。迄今为止，已有研究通过靶向敲除H19-DMR、Gtl2-Dlk1 IG-DMR 和 Rasgrf1-DMR，以抑制 phaESCs 中母源表达的基因3,5,8,12。这些研究表明，同时敲除H19-DMR 和 IG-DMR 足以将母源印记转变为可替代精子染色体的父源印记构型。将携带这两个 DMR 缺失的 phaESCs 通过胞质内注射注入卵母细胞后，可获得半克隆仔鼠，其出生率占移植的2细胞胚胎的5.1%至15.5%。
本方案基于应用同时缺失H19-DMR和IG-DMR的孤雄单倍体胚胎干细胞（phaESCs），我们将此类细胞称为双敲除孤雄单倍体胚胎干细胞（DKO-phaESCs）。我们提供了详细的实验步骤，包括在phaESCs中对基因组印记进行修饰以建立DKO-phaESC细胞系，将DKO-phaESCs注入卵母细胞以替代精子基因组，培养半克隆胚胎至囊胚阶段，以及获得半克隆小鼠。本方案可为需要精确直接操控父源基因组并生成半克隆胚胎和半克隆小鼠的研究人员提供参考。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>BSA组分</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>秋水仙胺溶液</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>DR4小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>冻存液</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>HEPES溶液</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>经辐照的MEF细胞</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>LIF（白血病抑制因子）</td><td>(自制)</td><td>-</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>脂质体转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>携带CAG-EGFP转基因的piggyBac质粒</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>piggyBac转座酶质粒</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>pX330质粒</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>pX458质粒</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>人孤雌激活胚胎干细胞培养</td></tr><tr><td>DNA聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>dNTP混合液</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>5 mL离心管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>带细胞筛盖的5 mL离心管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>30号半英寸针头</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>B6D2F1小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD动物健康</td><td>49451</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>10 cm培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>4孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>6 cm培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>中心井培养皿</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>数字摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>M16培养基</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>M2培养基</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>氯化锶</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>胚胎操作</td></tr><tr><td>5 mL注射器</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>持卵针</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>显微注射针</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>Microlaoder吸头</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>显微操作臂</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>PVP（聚乙烯吡咯烷酮）</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>显微注射</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>显微注射</td></tr></tbody></table>

小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞作为精子替代物的应用

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

在具有有性生殖的生物中，生殖细胞是发育成新个体的全能细胞的来源。在小鼠中，精子与卵母细胞受精形成全能性的合子。最近，多项研究报道单倍体胚胎干细胞（haESCs）可替代配子基因组并参与胚胎发育，最终产生小鼠。本文介绍了一种利用孤雌生殖来源的haESCs作为精子替代物，通过胞质内注射到卵母细胞中构建胚胎的实验方案。该方案包括将haESCs制备为精子替代物、将haESC染色体注射入卵母细胞以及半克隆胚胎的培养等步骤。这些胚胎经胚胎移植后可产下具有生育能力的半克隆小鼠。使用haESCs作为精子替代物有助于生殖系基因组编辑、胚胎发育研究以及基因组印记机制的探究。

本实验方案的目的是应用类精子单倍体胚胎干细胞（haESC）作为精子替代物，以获得半克隆胚胎和小鼠。为此，构建了携带CAG-EGFP转基因的DKO-phaESC细胞系，并将其用于显微注射至MII期卵母细胞的细胞质中。为了获得具有父源印记特征的合适phaESC细胞系，我们利用Cas9核酸酶进行了基因工程改造。单倍体胚胎干细胞系包含单倍体和二倍体细胞，这是由于单倍体胚胎干细胞固有地倾向于发生二倍体化所致10。单倍体染色体组是成功替代精子基因组的前提条件。通过流式细胞术进行DNA含量分析，可显示单倍体和二倍体细胞在G0/G1期、S期以及G2/M期的分布情况（图2A）。
为建立DKO-phaESC细胞系，将野生型phaESC细胞系转染携带piggyBac转座子结构的载体以实现EGFP的稳定转基因表达，同时转染CRISPR/Cas9质粒以删除H19-DMR和IG-DMR区域。为排除二倍体ES细胞并仅分离表达EGFP的单倍体ES细胞，设定了特定的分选门控（图2A）。随后将单个EGFP阳性的单倍体细胞接种至96孔板的各个孔中，以获得亚克隆。使用MEF饲养层细胞以提高转染后phaESC的接种效率和存活率。在细胞扩增后，通过PCR进行初步基因型鉴定，筛选出两个DMR区域均发生缺失的亚克隆。在去除MEF饲养层细胞后，进行第二次基因型鉴定，以确认H19-DMR和IG-DMR位点不存在野生型等位基因（图2B）。在总共135个亚克隆中，我们获得了5个单倍体DKO-phESC细胞系，这些细胞系携带缺失的等位基因，且在H19-DMR和IG-DMR位点均无野生型等位基因残留。
为了通过显微镜下观察绿色荧光来研究DKO-phaESC对半克隆胚胎的贡献，将CAG-EGFP转基因导入DKO-phaESC中（图3A）。进行胞质内注射时，使用秋水仙胺处理DKO-phaESC，使其停滞在M期，从而使DKO-phaESC的细胞周期与MII期卵母细胞保持同步。流式细胞术分析显示，经秋水仙胺处理后出现两个细胞群体，分别对应于停滞在G2/M期的单倍体（2n）和二倍体细胞（4n）（图3B）。未检测到1n单倍体峰，表明细胞周期阻滞基本完全。随后分选处于M期的单倍体ESC并注射入卵母细胞。具体操作为：将单个DKO-phaESC吸入显微注射针头，并注入MII期卵母细胞的胞质中（图3C）。通过将细胞移液至显微注射针尖端，使其质膜破裂。
注射后，由于 DKO-phaESC 的细胞质已分散到卵母细胞较大的细胞质中，因此在构建的半克隆胚胎中几乎检测不到 EGFP 表达（图 3D）。在极少数情况下，可在卵细胞质内观察到一个圆形的强 EGFP 表达区域，这可能是由于无意中注入了完整的 DKO-phaESC 所致。未能破裂 DKO-phaESC 的细胞膜可能与后续胚胎发育不相容，应予以避免。注射后 1 小时，通过氯化锶处理激活胚胎18。激活开始后 6 小时，在显微镜下可观察到最多 3 个极体（图 3E），这些极体分别对应于卵母细胞的第一和第二极体，以及来自 DKO-phaESC 的一个拟极体7。此外，在微分干涉对比显微镜下可观察到两个原核，其形态类似于精子正常受精后合子的原核期阶段。
为验证发育潜能，将半克隆胚胎培养至囊胚阶段（图5A）。此外，将半克隆的2细胞期胚胎移植至受体雌鼠的输卵管后，成功获得了一只足月出生的小鼠（图5B）。正如预期，该半克隆小鼠为雌性，因为卵母细胞及卵母细胞来源的phaESC均不携带Y染色体。该半克隆小鼠表型正常，与野生型Swiss Webster雄鼠交配后可产生健康后代。截至目前，该半克隆小鼠已存活超过600天，未出现任何明显的健康问题。
<img alt="超数排卵、卵母细胞采集和胚胎激活过程；phaESC工作流程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：DKO-phaESC作为精子替代物的应用概览。（A）本实验方案各步骤的时间流程。（B）示意图展示了建立DKO-phaESC细胞系的步骤（步骤1–6）。（C）示意图展示了通过将DKO-phaESC注射入MII期卵母细胞胞质内构建半克隆胚胎的步骤（步骤7–14）。缩写：DKO = double-knockout；phaESC = parthogenetic haploid embryonic stem cell；FACS = fluorescence-activated cell sorting；MEF = mouse embryonic fibroblast。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术与基因分型分析；图A：细胞周期时相分布，图B：PCR结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图2：通过CRISPR/Cas9介导的H19-和IG-DMR缺失建立DKO-phaESC细胞系。（A）将携带piggyBac质粒以实现EGFP稳定表达以及4种CRISPR/Cas9质粒共转染后，对phaESC进行流式细胞术分析。未转染的phaESC作为对照。DNA图谱（上方）显示单倍体与二倍体细胞的细胞周期分布。表达EGFP的G1/S期单倍体细胞由绿色门控区域标示（下方右侧）。（B）phaESC亚克隆在饲养层MEF上培养时（第一次基因分型）及去除MEF后（第二次基因分型）的基因型鉴定结果。亚克隆的phaESC细胞系1、2、3和4分别为野生型细胞、H19-DMR缺失细胞、IG-DMR缺失细胞以及同时缺失H19-和IG-DMR的细胞。DKO-phaESC细胞系5–8均具有H19-DMR和IG-DMR双缺失，且不含野生型等位基因。缩写：DKO = 双敲除；phaESC = 孤雌单倍体胚胎干细胞；DMR = 差异甲基化区；MEF = 小鼠胚胎成纤维细胞；EGFP = 增强型绿色荧光蛋白；WT = 野生型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="单倍体胚胎干细胞的相差显微镜与EGFP荧光显微镜图像；Hoechst流式细胞术图谱；显微注射图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：有丝分裂阻滞的DKO-phaESC注射入MII期卵母细胞。（A）携带CAG-EGFP转基因以及H19-和IG-DMR缺失的DKO-phaESC培养物的形态；比例尺 = 50 µm。（B）经demecolcine处理8小时后，DKO-phaESC的代表性流式细胞术分析结果；未用demecolcine处理的DKO-phaESC作为对照展示。（C）显微注射移液管中DKO-phaESC的形态；显示了在吹打前（左）和吹打后（右）细胞膜破裂前后的单个完整DKO-phaESC；比例尺 = 20 µm。（D）将DKO-phaESC注射入MII期卵母细胞后1小时构建的胚胎；显示EGFP荧光与明场图像的合并图。黑色箭头指示注射完整DKO-phaESC后出现的强EGFP表达圆形斑点，应避免此类情况；比例尺 = 50 µm。（E）使用氯化锶激活6小时后半克隆胚胎的微分干涉差显微图像；白色箭头指示含有3个极体的胚胎，其中包括一个来自注射的DKO-phaESC的假极体；比例尺 = 50 µm。缩写：DKO = 双敲除；phaESC = 孤雌单倍体胚胎干细胞；EGFP = 增强型绿色荧光蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微注射示意图；M2培养基中单倍体胚胎干细胞注射装置，物镜，培养皿布局。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：将DKO-phaESC注射入卵母细胞胞质的实验装置示意图。（A）注射针、固定针与卵母细胞在注射腔室中的排列方式。α，显微注射针的弯曲角度。（B）用于胞质内注射的显微操作培养皿中液滴的布局。缩写：DKO = 双敲除；phaESC = 孤雌单倍体胚胎干细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠细胞发育：5天内的明场与EGFP荧光图像，发育阶段为0-602 dpp。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：半克隆胚胎的发育。（A）体外半克隆胚胎的着床前发育。在胞质内注射后第2天，四细胞胚胎中首次观察到EGFP表达。第4天时，囊胚中可观察到强烈的EGFP表达；比例尺 = 100 µm。（B）将2-细胞胚胎移植至受体雌鼠后获得的半克隆小鼠。在产后74天（74 dpp），该半克隆小鼠（箭头）与野生型Swiss Webster雄鼠交配后通过自然分娩产下首批幼崽（星号）。本图所示的半克隆胚胎及半克隆小鼠与Aizawa等3中报道的个体相同。缩写：EGFP = 增强型绿色荧光蛋白；dpp，产后天数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">明胶溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>明胶</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">单倍体胚胎干细胞（HaESC）培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 µL</td>
			<td>3 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>1 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>1 x 106 IU/mL</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>1,000 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 µL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HaESC 维持缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaESC 培养基</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 溶液</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">洗涤缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 组分</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7.1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">MEF 培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-巯基乙醇</td>
			<td>14.3 mol/L</td>
			<td>3.9 µL</td>
			<td>100 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素</td>
			<td>100x</td>
			<td>5.6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">裂解缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>8.25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.5 M</td>
			<td>100 µL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 溶液</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 µL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白酶 K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">激活培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化锶</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>4 µL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">PVP 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 培养基</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP</td>
			<td>-</td>
			<td>0.6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">PMSG 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">hCG 溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">透明质酸酶培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>体积 / 质量</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 培养基</td>
			<td>-</td>
			<td>380 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>透明质酸酶</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">缩略语：LIF = 白血病抑制因子；MEF = 小鼠胚胎成纤维细胞；</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">FBS = 胎牛血清；DMEM = 达尔伯克改良伊格尔培养基；BSA = 牛血清白蛋白；</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EDTA = 乙二胺四乙酸；SDS = 十二烷基硫酸钠；EGTA = 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸；</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">PBS = 磷酸盐缓冲液；PVP = 聚乙烯吡咯烷酮；hCG = 人绒毛膜促性腺激素；</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">PMSG = 孕马血清促性腺激素。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：培养基、缓冲液和溶液的配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td colspan="2">序列 (5' 至 3')</td>
			<td>应用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>基因分型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>基因分型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>基因分型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>基因分型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>基因分型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>基因分型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：寡核苷酸列表。

本文旨在展示利用孤雌生殖单倍体胚胎干细胞作为精子替代物，用于构建半克隆胚胎的方法。

在进行有性生殖的生物中，生殖细胞是发育成新个体的全能细胞的来源。在小鼠中，卵子受精后……

该方案错误地将单倍体小鼠胚胎干细胞中基因组印记修饰的时间归因于本研究，由于使用了假精子，从而实现了在小鼠中生成自体胚胎。通常，配子的遗传修饰需要复杂的技术。通过本方法，可对杂合胚胎干细胞中的亲本配子进行操作，并将其作为精子替代方案引入小鼠体内。由于该方法能够实现对胚胎中父源配子的人工特异性修饰，因此特别适用于基因组印记和基因失活的研究。本实验操作将由本实验室的小鼠胚胎学家 Charles Etienne Dumeau 演示。实验前，首先使用微量移液器拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成细长且逐渐 taper 的形状，以制备持卵管和显微注射针。制备持握移液管时，将拉制好的毛细管（外径为 60 至 100 微米）置于微熔器上，使其位于灯丝的玻璃珠上方。打开灯丝电源，缓慢下移毛细管直至接触玻璃珠。当毛细管与玻璃珠接触并粘附后，关闭灯丝电源并上提毛细管，使毛细管断裂形成平直末端。接下来，将断裂的毛细管尖端水平放置在灯丝上的玻璃珠旁，加热灯丝使毛细管末端熔化，直至其内径达到10至20微米。然后将毛细管置于玻璃珠上方，距离尖端约一毫米处，加热灯丝使毛细管弯曲成20度角。制备显微注射移液管时，将已拉制的毛细管（外径约六微米）置于加热灯丝上的玻璃珠上方，并缓慢下移毛细管直至接触玻璃珠。毛细管附着后，关闭加热丝并回撤毛细管，毛细管将断裂形成平直末端。随后将毛细管移至玻璃珠上方，距离毛细管尖端约一毫米处，加热加热丝使毛细管弯曲成20度角。进行胞质内注射时，将5微升聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液和20微升M2培养基滴加到直径10厘米培养皿倒置的盖子上，并用矿物油覆盖液滴。将培养皿置于显微镜载物台上，并在显微操作仪上安装持卵针。使用微量加样器吸头将氟碳油注入显微注射针中，然后将注射针安装到压电驱动器上。在显微镜下观察，将显微注射针插入一滴PVP溶液中。当注射针浸入溶液后，反复吸取数次，使玻璃表面均匀涂覆PVP。向显微注射针中吸入少量PVP溶液。将显微注射针和持卵针浸入M2培养基中，并聚焦于液滴底部的针尖。取约2微升的双基因敲除孤雌发育ES细胞悬液，转移至M2培养基液滴中，再用口吸管将10个M2期卵母细胞转移至同一液滴。旋转其中一个卵母细胞，并通过持卵针施加负压固定卵母细胞，使卵周隙朝向显微注射针，注意确保第二次减数分裂中期板不在显微注射针的进针路径上。吸取一个双基因敲除的孤雌激活胚胎干细胞至显微注射针尖端，确认细胞膜破裂。对显微注射针施加轻微负压，同时向透明带下方的卵周隙推进针尖，并施加四次压电脉冲以穿透透明带。将显微注射针插入卵母细胞，使卵细胞膜伸展至对侧，然后施加一次压电脉冲刺破卵细胞膜，确保卵细胞膜沿显微注射针针身方向松弛展开。将双基因敲除的孤雌生殖ES细胞连同最少量的培养基注入卵母细胞的细胞质中，然后将显微注射针平稳地从卵母细胞中退出。松开固定针，释放已注射的卵母细胞，并将其移至微滴的一侧，以便后续收集。当所有卵母细胞注射完成后，将其转移至含有KSOM培养基的预热中心井培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时，随后进行激活。通过流式细胞术对这条携带CAG/EGFP转基因的代表性双敲除孤雌激活ES细胞系进行DNA含量分析，展示了单倍体和二倍体细胞在G0、G1、S以及G2/M期的分布情况。可通过基因分型确认H19和基因间差异甲基化区域中野生型等位基因的缺失。可将CAG/EGFP转基因导入双敲除致病性ES细胞中，通过显微镜下观察绿色荧光，研究其在半克隆胚胎中的贡献情况。流式细胞术分析显示，在去黏连素处理后，出现两个细胞群体，分别对应于停滞在G2/M期的单倍体和二倍体细胞。未检测到1N单倍体峰，表明细胞的静止期周期已基本完成。显微注射后，在构建的半克隆胚胎中几乎无法检测到EGFP表达。因为双敲除孤雌生殖ES细胞的细胞质分散到卵母细胞的大细胞质中。激活后6小时，可在显微镜下观察到多达三个极体，分别为卵母细胞的第一和第二极体，以及来自单倍体ESC的一个假极体。为了证明其发育能力，半克隆胚胎可被培养至囊胚阶段。此外，将处于二细胞阶段的半克隆胚胎移植到受体雌鼠的输卵管后，可获得足月出生的雌性小鼠。在显微注射过程中，破坏单倍体胚胎干细胞的细胞膜至关重要，因为该细胞膜的存在会阻碍卵母细胞激活时的染色体分离。除了孤雌生殖的单倍体胚胎干细胞外，也可使用雄核单倍体胚胎干细胞，从而可根据研究目的选择母本或父本配子作为精子替代物。

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发育生物学

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了解利用孤雌单倍体胚胎干细胞替代精子构建半克隆胚胎的技术，通过显微注射将修饰后的细胞注入小鼠卵母细胞，实现基因组印记研究。该方法为生殖生物学和遗传学研究提供了新途径。

小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞作为精子替代物的应用

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