使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

该技术可在短时间内通过CRISPR/Cas9基因组编辑在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中引入精确突变，具有显著优势。该方法为编辑秀丽隐杆线虫基因组提供了一种高效且简化的途径，因为使用共编辑标记（Co-CRISPR marker）可显著提高鉴定成功编辑线虫的概率。务必练习显微注射操作，并尽可能对尽可能多的线虫双侧生殖腺臂进行注射，以增加获得目标编辑的几率。

演示该实验步骤的是来自我实验室的本科生 Amy Smith、Mary Bergwell、Danita Mathew、Ellie Smith 和 Carter Dierlam。为准备用于注射的年轻成虫线虫，需挑选 L2 和 L3 期的秀丽隐杆线虫（C.elegans）至 MYOB 平板上的新鲜细菌菌苔中，并将平板在 20 °C 下孵育过夜。次日早晨，在无菌无核酸酶的离心管中按照表格所述配制注射混合液，并用移液器吹打混匀。

将注射混合物在37摄氏度孵育15分钟，以组装核糖核蛋白复合物，随后通过离心沉淀混合物。接着，使用解剖显微镜挑选约30条子宫内胚胎少于10个的年轻成虫线虫，向每条线虫的两个性腺臂各注射几皮升的注射混合物。显微注射后，使用恢复装置通过口吸移液法将注射后的线虫从注射垫轻轻转移至接种了OP50大肠杆菌的60毫米MYOB平板上。

将注射后的线虫在室温下恢复一小时。恢复期结束后，用铂金丝挑取每只注射过的线虫，转移到单独的含菌35毫米MYOB琼脂平板上，于20摄氏度条件下让线虫产卵。24小时后，将注射过的线虫转移到新的个体35毫米平板上。

注射后三到四天内，使用解剖显微镜鉴定含有表现出滚动表型（roller phenotypes）的F1代子代的培养板，其特征为动物移动时身体围绕长轴旋转，并呈环形运动模式；同时鉴定具有粗短表型（dumpy phenotypes）的个体，其表现为与相同发育阶段的对照动物相比，体型更短且更粗壮。挑选50至100条F1代滚动表型线虫，分别转移到各自的独立培养板上，让其产卵一到两天。在F2代线虫产生一到两天后，将每块编号培养板上的单个F1代滚动表型母虫转移至对应编号的PCR管中，PCR管内含有2.5 µL裂解缓冲液，并添加了1:100稀释的20 mg/mL蛋白酶K。按照指示，先将PCR管在-30 °C下冷冻20分钟，然后在热循环仪中裂解线虫。

在反应循环结束后，向每个裂解的线虫样品中加入12.5微升含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、氯化镁和上样染料的2X PCR混合液，1微升10微摩尔的正向引物，1微升10微摩尔的反向引物，以及足量的无菌水，使反应体系总体积达到25微升。随后按照指定程序在热循环仪中运行样品。为筛选长度小于50个碱基对的编辑，将每个PCR反应产物中的10微升转移至新的离心管中，并向每管加入5微升限制性酶切反应主混合液。

将消化反应在 37 摄氏度孵育两小时。孵育结束后，于 65 摄氏度孵育 10 至 15 分钟以加热并终止消化反应。随后，将每根试管中的全部反应产物加入 1% 至 2% 琼脂糖凝胶的单个加样孔中，在 110 毫安条件下电泳，直至达到理想的条带分离效果。

实验结束后，在紫外光下观察琼脂糖凝胶，以检测DNA条带大小。成功编辑的线虫由于使用了修复模板进行编辑，在预期大小位置会显示出一条额外的DNA条带，该条带在秀丽隐杆线虫基因组的靶向位点处携带限制性酶切位点。从已确认成功编辑的F1代滚动表型线虫培养板中，挑选8至12条外观为野生型且不滚动的F2代线虫，让其产卵并繁殖后代1至2天。

然后，按照已确认成功编辑的线虫鉴定纯合线虫品系，并使用序列分析软件分析测序结果，依据标准操作流程确认编辑的存在。此处可观察到秀丽隐杆线虫（C.elegans）rbm-3.2基因的基因组DNA、设计的CRISPR RNA以及修复模板。在此代表性分析中，在73条F1代线虫中，有7条被检测为编辑阳性。

未经编辑的线虫在EcoRI消化后显示出一条445个碱基对的DNA片段，而在rbm-3.2基因中携带提前终止密码子的线虫在EcoRI消化后则显示出两条分别为265和166个碱基对的片段。杂合编辑的线虫在EcoRI消化后显示出三条片段。在鉴定出的阳性F1代杂合子的12条F2代线虫中，有6条被证实为该目标编辑的纯合子。

随后可利用已鉴定的纯合编辑线虫品系的基因组DNA进行DNA测序反应，以确认编辑在纯合状态下的存在。务必确保编辑试剂和筛选引物设计正确，并正确配制显微注射混合液。准确的显微注射操作也至关重要。

完成此操作后，可进行编辑的表型验证（如适用）以及基因和蛋白质表达分析，以确认基因组编辑的准确性。