模拟新生血管化初始事件的微流控模型

新生血管形成，即新血管的生成，是在生理和病理过程中均受到高度调控的生物学过程。为了更深入地理解新生血管形成机制，重要的是在体外重建自然的细胞微环境以模拟该过程。我们已开发出一种微流控芯片及自动控制系统。

通过高效循环形成灌注微管，并利用蛋白质模拟新血管生成的初始事件。微流控出芽芯片由三个通道组成：一个内皮细胞培养通道和一个液体通道，两者之间由一个较宽的中央水凝胶通道隔开。

微流控系统由一个微量注射泵和电磁夹管阀组成，还包括一个气泡捕获芯片、一个微流控出芽芯片、一个微型蠕动泵以及一个培养基储液器。通过该微流控系统，内皮细胞可同时受到高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及多种血管内皮生长因子分布的刺激。

用移液器将20微升浓度为125微克/毫升的纤连蛋白加入细胞培养通道的一个培养基注入孔中。用剪刀剪切移液器吸头，使其适配细胞培养通道的孔口。将该移液器吸头插入细胞培养通道的另一个培养基注入孔中。

然后，从细胞培养通道中吸出空气，使其充满纤连蛋白。将芯片置于37摄氏度孵育1小时。在接种细胞前，向每个培养基注射口加入20微升内皮细胞培养基，并将芯片置于37摄氏度孵育30分钟。

然后，用移液器吸出所有培养基注入孔中的培养基。接着，向细胞培养通道的一个培养基注入孔中加入五微升细胞悬液。随后，在静水压差的作用下，内皮细胞迅速铺展至整个通道。

向另一端口加入约 4 至 6 微升 ECM 培养基，以调节静水压并阻止细胞移动。将芯片转移至细胞培养箱。之后，每 30 分钟翻转一次芯片，直至内皮细胞在细胞培养通道的内表面形成包被，约两小时后完成。

使用移液器吸头非常小心地去除注射孔中贴壁的细胞。然后，将四个带倒刺的雌性鲁尔接头插入培养基注射孔，并加入细胞外基质（ECM）培养基。将芯片转移至细胞培养箱，每12小时更换一次ECM培养基和鲁尔接头。

组装微流控控制系统时，准备两根聚四氟乙烯管、两根短硅胶管、三根长硅胶管、一个带倒刺的雌性鲁尔接头、一个Y型连接器，以及三个L型连接器。用10毫升预热的ECM培养基填充注射器。通过带倒刺的雌性鲁尔接头将一根聚四氟乙烯管连接到注射器上。

然后，将聚四氟乙烯管的另一端连接至Y型连接器。接着，将两根较长的硅胶管分别连接到Y型连接器的另外两端。我们使用其中一根管连接储液池，另一根管连接气泡捕获芯片。

将另一根较长的硅胶管连接至储液器。然后，使用两根较短的硅胶管连接气泡捕集芯片顶层的所有进样口和出样口。将一根聚四氟乙烯管连接至芯片的后端。

接下来，将注射器固定到微量注射泵上。将两根长硅胶管夹入电磁夹管阀中。然后，切换电磁夹管阀，打开注射器与储液器之间的管路。

使用微量注射泵向储液池注入培养基，以排出管路中的空气。然后再次切换阀门，打开注射器与气泡捕获芯片之间的管路。注入培养基以充满气泡捕获芯片的液体腔室及后端管路。

从细胞培养箱中取出血管内皮细胞出芽芯片，移除细胞培养侧的鲁尔接头。将两个管塞插入微流控出芽芯片的水凝胶注射口。将去泡芯片的后端管路连接至细胞培养通道的一个端口。

将T型接头插入另一个端口，并将其连接到与储液瓶相连的长硅胶管上。将长硅胶管固定在微型蠕动泵中。然后，在储液瓶上安装空气过滤器。

接下来，将微流控出芽芯片组装到载物台顶部培养箱中。然后，使用热塑性聚氨酯管将真空泵连接至气泡捕获芯片底层的孔洞。在自定义程序中设置相反方向的循环体积和流速，以同时控制微量注射泵和电磁夹管阀。

接下来，设置微型蠕动泵的流速。打开微量注射泵。随后，建立循环控制系统。

我们通过测量40 kDa F-I-T-C葡聚糖的扩散通透系数，来检测模型中某些微血管的屏障功能。如图所示，带有细胞衬里的静态培养芯片的扩散通透系数为0.1 ± 0.3 微米/秒，而无细胞衬里的空通道的扩散通透系数为5.4 ± 0.7 微米/秒。

内皮细胞出芽实验显示，在静态培养24小时后，内皮细胞大量向中心水凝胶区域出芽；而随着管腔剪切应力的增加，出芽程度显著降低。定量分析表明，管腔剪切应力显著减少了出芽面积、平均出芽长度以及最长出芽长度。利用本系统，可在实验过程中任意时间点选择性地改变作用于内皮细胞的剪切应力，同时保持跨内皮流动处于生理水平。

这种体外三维仿生模型可直接应用于新生血管形成机制的研究，并有望作为一种低成本平台用于药物筛选和毒理学研究。