Name: 呼吸系统同步病毒病毒特定核胶囊的生成和组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学习利用磷蛋白作为分子伴侣在体外组装呼吸道合胞病毒核衣壳的方法。该技术通过共表达RNA游离核蛋白解决重组病毒蛋白表达难题，适用于其他非分节段负链RNA病毒研究。

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梁实验室在埃默里大学的研究项目由美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）、美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01GM130950，以及埃默里大学医学院研究启动基金支持。作者感谢梁实验室成员提供的有益支持和富有建设性的讨论。

1. 分子克隆
注意：采用连接酶无关克隆（Ligase Independent Cloning, LIC）方法构建呼吸道合胞病毒（RSV）双顺反子共表达质粒。LIC 是 20 世纪 90 年代初开发的一种技术，利用 T4 DNA&#160;聚合酶的 3’-5’ 外切酶活性，在载体与 DNA 插入片段之间产生互补的单链突出末端21,22。构建所用的 2BT-10 载体 DNA 在开放阅读框（ORF）的 N 端包含一个 10x His 标签（图 1）。
<ol>
	<li>使用 SSPI 消化对 LIC 载体进行线性化。
	<ol>
		<li>混合10 &#956;SSPI 10X 缓冲液，4 L &#956;5 U/微升的SSPI酶&#956;L，等体积的5 &#956;克隆质粒小提DNA的量，以及无菌ddH₂O20 到 100 &#956;L.</li>
		<li>37℃孵育消化液3小时 &#176;C.</li>
		<li>在1.0%琼脂糖凝胶上进行酶切产物电泳，以回收载体DNA。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒进行提取和纯化。将最终体积的载体DNA悬浮于30 &#956;ddH₂O 升2O，并在 -20 保存 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于N的DNA插入片段1-391 和 P1-126 使用 N 蛋白1-391 N基因上游引物1-391 反向引物，P1-126 正向引物，以及 P1-126 逆转录引物（表1). 
	注意：线性化载体之间存在足够的重叠，以确保熔解温度在55之间 &#176;C 和 60 &#176;C. 对于反向引物，由于相同原因，其与线性化载体的反向互补链之间也存在足够的重叠区域。
	<ol>
		<li>使用指定条件对DNA插入片段进行PCR扩增 表 2 以及 表3.</li>
		<li>提取扩增的DNA片段。将上一步的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，然后通过凝胶回收法提取并纯化目标条带。将提取的DNA最终悬浮于15 μL中 &#956;ddH₂O 升2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T4 DNA聚合酶处理载体和插入DNA表4). 
	注意：必须将载体 DNA 和插入片段 DNA 分别进行处理。
	<ol>
		<li>室温孵育混合物40分钟。然后在75℃下加热使聚合酶失活 &#176;C，20 分钟。将反应混合物于 -20 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 LIC 载体与插入载体退火。
	<ol>
		<li>设置一个含 2 的阴性对照 &#956;L of LIC载体DNA和2 &#956;L 的无菌 ddH₂O2O.</li>
		<li>混合 &#160;2 &#956;插入DNA的L和2 &#956;LIC 载体 DNA 的 L，来自前一步 T4 DNA 聚合酶反应，置于 0.2 mL 管中。</li>
		<li>在室温下进行退火反应10分钟。</li>
		<li>用1.3淬灭反应 &#956;25 mM 浓度的 EDTA 溶液，体积为 L。</li>
		<li>将反应体系转移至100 &#956;L of E. coli Top10 感受态细胞涂布于氨苄青霉素筛选平板23,24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鉴定阳性构建体。
	<ol>
		<li>制备质粒小量提取溶液。可通过挑取菌落并接种于LB培养基中进行，通常选取3个菌落即可。</li>
		<li>37℃下孵育混合物过夜 &#176;C.</li>
		<li>在4,560 x g离心10分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于 250 &#956;使用L型P1缓冲液，并利用离心柱式质粒小提试剂盒制备质粒小量提取物。</li>
		<li>使用 AseI 或其他限制性内切酶对质粒小提产物进行消化分析。</li>
		<li>将样品上样至0.8%琼脂糖凝胶，电泳分离消化后的质粒，然后在紫外灯下分析凝胶。</li>
		<li>使用测序服务验证阳性产物的序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获得共表达DNA插入片段。
	<ol>
		<li>进行 PCR 以获得 N1-391 和 P1-126 使用先前构建的 2BT-10 N1-391 和 2BT-10 P1-126 作为模板。</li>
		<li>执行第1步st 通过PCR获得N1-391 来自 2BT-10 N1-391 使用PCR条件构建 表 2 和 表3 与 N 一起1-391 正向引物和反向引物 &#160;5 &#769;-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG 
		CGCCGCGATCGCGGATCC-3 &#769;.</li>
		<li>执行第2步nd 通过 PCR 获得 P1-126 来自 2BT-10 P1-126 使用正向引物构建：5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC 
		AGGACTCGAGTTCTAGA-3 &#769;以及 P1-126 反向引物（使用以下PCR条件） 表2 以及 表3).</li>
		<li>最后，对前两次PCR反应的混合产物进行重叠PCR，以连接N1-391 以及 P1-126. 使用 &#160;N1-391 正向引物和P蛋白1-126 反向引物。使用以下PCR条件 表5 以及 表6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接载体与DNA插入片段。
	<ol>
		<li>按照步骤1.3中的方案，用T4 DNA聚合酶处理重叠PCR产物。</li>
		<li>按照1.4步骤中的方案，将LIC载体与PCR产物进行退火。</li>
		<li>按照步骤1.5中的方案鉴定阳性构建。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质表达与纯化
注意：使用 E. coli 构建共表达 N 和 P 的双顺反子载体。在 37 °C 下培养细胞，但在降低的温度（16 °C）下过夜诱导表达。通过钴柱、离子交换和尺寸排阻色谱联用纯化蛋白复合物（图 2）。
<ol>
	<li>使用 E. coli BL21(DE3) 菌株进行蛋白表达。在 LB（Luria 肉汤）培养基中于 37 °C 下培养 4 L 细胞培养物，直至 OD600 达到 0.6。</li>
	<li>将温度降至 16 °C，1 小时后加入 0.5 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，过夜培养。</li>
	<li>在 4,104 × g 条件下离心 25 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 200 mL 裂解缓冲液 A（50 mM 磷酸钠，pH 7.4，500 mM NaCl，5 mM 咪唑，10% 甘油，0.2% NP40）重悬细胞沉淀。每 1 L 细胞培养物使用 50 mL 裂解缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>通过超声处理裂解细胞，总时长 15 分钟，工作 3 秒，间歇 3 秒。然后在 37,888 × g 条件下离心 40 分钟。 
	注意：可在超声处理前将细胞于 -80 °C 冰箱中冷冻，暂停实验流程。</li>
	<li>将上清液上样至钴离子亲和重力层析柱（直径 × 长度：2.5 cm × 10 cm），层析柱中预先装填约 10 mL 树脂，并用 5–10 柱体积（CV）的裂解缓冲液平衡。</li>
	<li>用 5 CV 的缓冲液 B（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1 M NaCl，10% 甘油，5 mM 咪唑）和 5 CV 的缓冲液 C（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，500 mM NaCl，10% 甘油，5 mM 咪唑）洗涤层析柱。</li>
	<li>使用 2 CV 的洗脱缓冲液 D（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，500 mM NaCl，250 mM 咪唑）从树脂中洗脱蛋白。</li>
	<li>用 QA 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，5% 甘油）将洗脱的蛋白稀释 5 倍，用于 Q 柱纯化。</li>
	<li>用 QA 缓冲液洗涤 5 mL Q 柱以平衡层析柱，然后使用蠕动泵（例如 Rabbit）将稀释后的样品上样至 Q 柱。</li>
	<li>将 Q 柱连同 QA 缓冲液和 QB 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1.5 M NaCl，5% 甘油）装入 HPLC 仪器中，设置流速为 1 mL/min。</li>
	<li>运行“泵清洗”程序，先用 QB 缓冲液清洗系统，再用 QA 缓冲液清洗（每种缓冲液各 1–2 柱体积），然后将系统流速设为 3 mL/min。</li>
	<li>设置 UV1 为 280 nm，UV2 为 260 nm。使用 96 孔深孔板收集各组分。</li>
	<li>采用逐步梯度洗脱方式，使用洗脱剂（QB 缓冲液），每次增加 5% 的 QB 缓冲液比例，从 0% QB 起始，每步应用 3–4 柱体积。N0P&#160; 蛋白复合物将在 15% QB 缓冲液条件下洗脱出来。</li>
	<li>待所有蛋白洗脱完毕后，用 100% QB 缓冲液（2 柱体积）清洗层析柱。</li>
	<li>通过凝胶过滤 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱（直径 × 长度：1.0 cm × 30 cm）分离蛋白，并使用缓冲液 E（20 mM HEPES，pH 7.4，200 mM NaCl）进行平衡。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 分析含蛋白的各组分。</li>
</ol>
3.&#160;体外组装病毒特异性核衣壳（NC）
注意： 体外 RSV特异性核衣壳（N:RNA）的组装是通过将制备好的N蛋白与RNA寡核苷酸共同孵育完成的0P复合物与RNA寡核苷酸。随后，采用SEC色谱法将组装复合物与N分离0P 和过量 RNA（图2).
<ol>
	<li>混合并孵育纯化的 N0P蛋白与RNA寡核苷酸以1:1.5的分子比例在室温下孵育1小时，通常使用1 mL的N蛋白0P 与一个&#160;浓度为 1 mg/mL 已足够用于下一步。设置仅含有等量 N 的对照样品0P蛋白</li>
	<li>用缓冲液 E（20 mM HEPES，pH 7.4，200 mM NaCl）预先平衡凝胶过滤 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱。</li>
	<li>以 21,130 离心样品 x g 孵育15分钟，去除任何沉淀物，并将上清液上样至尺寸排阻色谱柱。</li>
	<li>比较 N:RNA 组装样品与 N 的 SEC 层析图像0P 对照样品，将 A 混合260/A280 比例，以确定哪些峰对应组装的 N-RNA、N0P，以及游离的 RNA。</li>
	<li>收集峰洗脱组分，进行SDS-PAGE凝胶电泳或制备载网。</li>
	<li>为组装 N-RNA 复合物，收集 N-RNA 峰的所有洗脱组分，进行 RNA 提取，并运行尿素-PAGE 凝胶以再次确认特定 RNA 的长度，该长度应与第一步中混合并孵育的 RNA 相同。</li>
</ol>
4. 制备负染网格
注意：负染电子显微镜（EM）是一种将分子吸附到碳膜上，随后嵌入一层重金属原子中的方法。负染EM可产生高对比度图像，便于观察颗粒并进行计算机对齐。另一优点是颗粒吸附到碳膜上时，通常会以较少的优势取向附着于载网。当分子处于相似取向时，易于将其分离为结构上不同的类别。因此，负染EM是指导样品制备的合适技术25,26（图3）。
<ol>
	<li>使用钨加热器将5 mL ddH2O放入小玻璃烧杯中微波或加热至沸腾。&#160;&#160;</li>
	<li>称取37.5 mg甲酸铀酰，加入5 mL预热的ddH2O中，配制成0.75%的甲酸铀酰染色液。用铝箔覆盖烧杯后搅拌，避免光照。</li>
	<li>向染色液中加入4 μL 10 M NaOH，并在避光条件下继续搅拌15分钟。</li>
	<li>将溶液经0.22 mm滤膜过滤至试管中。</li>
	<li>使用辉光放电使连续碳膜包被的透射电镜（EM）载网具有亲水性27。 
	注意：将载网置于连接电源的腔室中。施加高电压时，腔室内气体电离，带负电荷的离子沉积于碳载网上，使其具有亲水性。</li>
	<li>剪裁并折叠一条Parafilm膜条，在其一侧滴加两滴40 μL缓冲液，另一侧滴加两滴40 μL染色液。</li>
	<li>制备EM碳载网时，将3 μL蛋白样品滴加于载网上，作用1分钟。</li>
	<li>用滤纸吸去载网上的液体。 
	注意：载网用缓冲液洗涤2次，每次用0.75%甲酸铀酰染色液染色1次，每次步骤后均用滤纸吸干。</li>
	<li>将载网浸入第二滴0.75%甲酸铀酰染色液中30秒。</li>
	<li>用滤纸吸去多余染色液，使载网自然风干。</li>
	<li>成像前将载网存放于载网盒中。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已知的非分段负链（NNS）RNA病毒的核衣壳样颗粒（NCLP）结构显示，当在细菌或真核表达系统中过表达时，组装形成的NCLP是由N蛋白与宿主细胞RNA结合形成的复合物15,16,17,18,19。以往的研究曾尝试通过多种方法获得无RNA的N蛋白，例如使用RNase A消化、高盐洗涤或调节不同pH的缓冲液以去除非特异性结合的细胞RNA28,29。然而，上述方法均未能成功用于病毒特异性核衣壳（NC）的组装。为了获得无RNA的呼吸道合胞病毒（RSV）N蛋白，我们也尝试了多种方法的组合，包括RNase A消化、高盐（1.5 M NaCl）洗涤、调节缓冲液pH值（从pH 5.0至pH 9.0）、蛋白质变性与复...

非分段的负链RNA病毒包括许多重要的人类病原体，例如狂犬病病毒、埃博拉病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）1,2。RSV是全球婴幼儿和老年人支气管炎及肺炎等呼吸道疾病的主要病因3。目前尚无有效的疫苗或抗病毒疗法可用于预防或治疗RSV感染4。在RSV生命周期中，其基因组作为模板，由RSV依赖RNA的RNA聚合酶进行复制，生成抗原组，而抗原组又作为模板产生子代基因组。基因组和抗原组RNA均被核蛋白（N）完全包裹，形成核衣壳（NCs）3。由于核衣壳（NCs）是RSV聚合酶进行复制和转录的模板，因此核衣壳的正确组装对于聚合酶接触模板以进行RNA合成至关重要5。有趣的是，基于对非分段负链RNA病毒聚合酶的结构分析，研究推测多个N蛋白会从核衣壳上瞬时解离，以便聚合酶接触RNA模板，并在RNA合成完成后重新结合到RNA上6,7,8,9,10,11,12。&#160;
目前，RSV RNA 聚合酶活性检测已通过使用纯化的 RSV 聚合酶和短的裸露 RNA 模板建立起来13,14。然而，RSV 聚合酶的活性尚未达到最佳状态，表现为使用裸露 RNA 模板时产生非持续性和中止性产物。缺乏与病毒特异性 RNA 结合的核衣壳蛋白（NC）是进一步深入理解 RSV RNA 合成机制的主要障碍。因此，使用真实的 RNA 模板成为推进 RSV RNA 合成基础研究的关键需求。已知的 RSV 及其他非节段负链 RNA 病毒（NNS RNA 病毒）核衣壳样颗粒（NCLPs）的结构显示，这些 NCLPs 中的 RNA 要么是随机的细胞 RNA，要么是平均化的病毒基因组 RNA15,16,17,18,19。综上所述，主要障碍在于当核衣壳蛋白（N）在宿主细胞中过表达时，会非特异性地结合细胞 RNA，从而形成 NCLPs。
为了克服这一障碍，我们建立了一种先获得无RNA的N蛋白（N0），再将N0与真实的病毒基因组RNA组装成核衣壳样颗粒（NCLPs）的方案20。该方案的原理是通过共表达N蛋白与其分子伴侣——呼吸道合胞病毒（RSV）磷蛋白的N端结构域（PNTD），从而大量获取重组的无RNA N蛋白（N0）。纯化的N0P复合物在加入RSV特异性RNA寡核苷酸后可被激活并组装成NCLPs，在组装过程中，分子伴侣PNTD会被RNA寡核苷酸置换而释放。
在此，我们详细介绍一种用于制备和组装呼吸道合胞病毒（RSV）RNA特异性纳米颗粒（NCs）的实验方案。本方案中，我们描述了分子克隆、蛋白质制备， 体外 组装及复合物组装的验证。我们重点介绍了用于分子克隆的双顺反子表达载体构建策略，以实现蛋白质的共表达。在蛋白质制备方面，我们描述了细胞培养、蛋白质提取以及蛋白复合物纯化的实验步骤。随后，我们讨论了相关方法 体外 RSV RNA特异性核衣壳的组装。最后，我们采用尺寸排阻色谱法（SEC）和负染电子显微镜（EM）对组装好的NCLPs进行表征和可视化观察。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>SIgma</td><td>A9539-500G</td><td>使用LIC方法构建质粒</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td>浓缩蛋白样品</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>5118.111317A</td><td>细胞培养用抗生素</td></tr><tr><td>AseI</td><td>NEB</td><td>R0526S</td><td>使用LIC方法构建质粒</td></tr><tr><td>钴（高密度）琼脂糖珠</td><td>Gold Bio</td><td>H-310-500</td><td>用于纯化带His标签的蛋白</td></tr><tr><td>Corning LSE 数字干浴加热器</td><td>CORNING</td><td>6885-DB</td><td>加热样品</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>10217016</td><td>使用LIC方法构建质粒</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Invitrogen</td><td>10218014</td><td>使用LIC方法构建质粒</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516-4L</td><td>配制溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td>配制溶液</td></tr><tr><td>HiTrap Q HP</td><td>Sigma</td><td>GE29-0513-25</td><td>蛋白纯化</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>I5513-100G</td><td>配制溶液</td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷）</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>1116.071717A</td><td>诱导蛋白表达</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>用于PCR</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator XL2020 超声波液体处理器</td><td>SpectraLab</td><td>MSX-XL-2020</td><td>用于细胞裂解的超声仪</td></tr><tr><td>负染网格</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CF400-Cu-TH</td><td>用于制备负染网格</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R</td><td>eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td>用于细胞培养的摇床</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 替代物</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td>配制溶液</td></tr><tr><td>OneTaq DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td>纯化DNA</td></tr><tr><td>SSPI-HF</td><td>NEB</td><td>R3132S</td><td>使用LIC方法构建质粒</td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>Sigma</td><td>GE29-0915-96</td><td>蛋白纯化</td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>Sigma</td><td>70099-3</td><td>使用LIC方法构建质粒</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus 离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td>离心机，最高转速20,000 rpm</td></tr><tr><td>Trizma 盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>T3253-250G</td><td>配制溶液</td></tr><tr><td>甲酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td>配制负染溶液</td></tr></tbody></table>

呼吸道合胞病毒特异性核衣壳的生成与组装

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

使用真实的RNA模板对于推进病毒RNA合成的基础知识至关重要，这可以指导病毒学领域的机制发现和检测方法开发。非分段负链（NNS）RNA病毒（如呼吸道合胞病毒（RSV））的RNA模板并非单独的RNA分子，而是一种由核蛋白（N）包裹形成的核糖核蛋白复合物。尽管真实RNA模板具有重要意义，但此类核糖核蛋白复合物的生成与组装过程仍十分复杂，需要深入阐明。主要挑战在于，过表达的RSV核蛋白（N）会非特异性地结合细胞内的RNA，形成随机的类核衣壳颗粒（NCLPs）。本文中，我们建立了一种实验方案：首先通过将核蛋白（N）与分子伴侣磷酸化蛋白（P）共表达，获得无RNA的N蛋白（N0）；随后将N0与含有RSV特异性RNA序列的RNA寡核苷酸组装，从而获得病毒特异性的核衣壳（NCs）。该方案展示了如何克服传统上制备此类病毒核糖核蛋白复合物所面临的技术难题。

无RNA的N0P蛋白纯化 
通过本方案可获得大量可溶性的RSV异源二聚体N0P复合物。在大肠杆菌（E. coli）中共同表达带有10X His标签的全长N蛋白和P蛋白的N端部分。利用钴柱、离子交换层析和尺寸排阻层析对N0P进行纯化。根据紫外吸收A260/A280比值判断，N0P包含全长N蛋白和N端P蛋白，但不含细胞RNA20（图4）。
N-RNA 的组装及负染检测 
随后，我们证明了纯化的N0P 可通过与特定 RNA 寡核苷酸孵育而被激活并组装成类核质粒（NCLPs）。NCLPs 通过将 N 与特定 RNA 寡核苷酸孵育而组装0P 与 RNA 寡核苷酸以 1:1.5 的比例在室温下孵育 1 小时，然后通过凝胶过滤柱。当 N:RNA ...

为深入分析呼吸道合胞病毒（RSV）RNA合成的分子机制，我们报告了一种利用分子伴侣磷酸化蛋白（P）共表达无RNA的核蛋白（N）的实验方案0用于后续 体外 病毒特异性核衣壳（NCs）的组装

使用真实的RNA模板对于推进病毒RNA合成的基础知识至关重要，这可以为机制性发现以及……提供指导。

该方法利用多种策略，通过一种病毒蛋白P作为分子伴侣辅助另一种病毒蛋白N，以解决重组病毒蛋白表达中的难题，从而获得不含RNA的N蛋白。在体外组装病毒特异性RNA进入核衣壳之前，即可获取无RNA的呼吸道合胞病毒（RSV）N蛋白。该方法也可应用于其他非分段的负链RNA病毒。无缝克隆技术是一种快速获得共表达载体的简便方法。而负染电子显微镜则是检测细胞粗提物中大分子组装情况的快速手段，我们在此提供两点建议：第一，在进入下一步之前，确保每一步均获得高产量且稳定可靠的结果；第二，合理设置层析程序，并练习使用镊子熟练地夹取载网。 为了构建N蛋白和P蛋白的双顺反子共表达，将四份1升的LB培养基接种大肠杆菌BL21DE3菌株，在37摄氏度下培养。当600纳米处的光密度达到0.6时，将温度降至16摄氏度。一小时后，加入0.5毫摩尔IPTG诱导蛋白表达，并过夜培养。次日早晨，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于200毫升裂解缓冲液中。采用超声处理裂解细胞，总时长15分钟，工作3秒、间歇3秒循环进行，随后通过离心收集裂解液。将上清液上样至尺寸为2.5 × 10厘米的钴离子亲和重力柱，柱中预先装有约10毫升经5至10柱体积裂解缓冲液平衡的钴离子螯合珠，依次用5柱体积的缓冲液B和5柱体积的缓冲液C洗涤层析柱。使用2柱体积的缓冲液D从树脂中洗脱目标蛋白。同时，用5次每次1毫升的QA缓冲液对Q柱进行平衡。使用蠕动泵将稀释后的样品加载到柱子上。将已上样的Q柱与新鲜的QA和QB缓冲液一起安装至高效液相色谱仪上。运行泵清洗程序，用一至两个柱体积的QB和QA缓冲液成功清洗仪器。最后一次洗涤后，将流速设为每分钟1毫升，并将UV1设为280纳米，UV2设为260纳米，使用96深孔板收集各组分。然后采用逐步梯度洗脱法，每种浓度的洗脱剂使用三到四个柱体积进行洗脱，从0% QB浓度开始，每次增加5%。N0 P蛋白复合物将在15% QB缓冲液浓度下被洗脱出来。 通过凝胶过滤法分离蛋白质，使用一根1 × 30厘米的小型纯化柱，以缓冲液E进行平衡。然后通过SDS-PAGE分析含蛋白质的组分。 对于病毒特异性的核衣壳组装，将纯化的 N0P 复合物与 RNA 寡核苷酸以 1:1.5 的分子比例在室温下混合并孵育一小时。用缓冲液 E 预平衡小规模纯化凝胶过滤柱，并通过离心去除任何沉淀物。将上清液上样至尺寸排阻色谱柱中，并比较蛋白-RNA组装样品与单独蛋白对照样品的尺寸排阻色谱图，结合核酸纯度比值，确定哪些峰对应组装的N-RNA、N0P和游离RNA。为组装N-RNA复合物，收集所有N-RNA峰对应的组分，进行RNA提取，然后运行尿素PAGE凝胶以再次确认特定RNA的长度。为制备用于负染透射电镜的载网，使用加热板将5 mL双蒸水加热至沸腾，加入37.5毫克醋酸铀酰，得到0.75%的醋酸铀酰染色液。将该溶液转移至用铝箔覆盖的烧杯中，并加入4 µL 10 M氢氧化钠。避光搅拌15分钟后，将溶液通过0.22微米滤膜过滤至离心管中。为使连续碳膜包被的透射电镜载网具有亲水性，将载网置于连接电源的腔室内，并对载网施加负电荷离子。剪取一条2英寸×2英寸的Parafilm膜并将其折叠。在膜的一端加入两滴40微升的去离子水，每滴40微升；在另一端加入两滴40微升的0.75%醋酸铀酰染色液，每滴40微升。向每个载网上加入3微升蛋白样品。1分钟后，用滤纸轻轻吸除多余液体，将载网在去离子水液滴中浸洗两次，随后浸入第一滴染色液中一次。然后将载网浸入第二滴染色液中30秒，再用滤纸吸去多余染色液，室温晾干后即可进行成像。通过本方案，可获得大量可溶性的呼吸道合胞病毒N0P异源二聚体复合物。在大肠杆菌中，全长N蛋白与P蛋白的N端片段共同表达，其中N蛋白带有10×His标签。根据紫外吸收测定的核酸纯度比值，N0P包含全长N蛋白和N端P蛋白，但不含细胞RNA。纯化的N0P随后可通过与特定RNA寡核苷酸孵育，在透射电子显微镜载网上被激活并组装成类似核衣壳的颗粒，如前所示。纯化蛋白时，柱层析过程中应避免产生气泡，并在上样前用QA缓冲液稀释样品以调节pH值和盐浓度。操作透射电镜载网时应握住其外缘，避免污染载网。这将有助于我们解答RSV基因组长期以来的包装问题，即其螺旋结构是左手构型还是右手构型。通过执行这些步骤，并制备真实的RNA模板，可开展RSV聚合酶活性检测，且该RSV病毒特异性核衣壳可用于高分辨率冷冻电镜分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

呼吸系统同步病毒病毒特定核胶囊的生成和组装

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs...

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

一种简单、高效且稳健的方法，通过同步递送多种病毒组分至植物细胞 农杆菌介导的瞬时表达方法被描述。该方法适用于研究复制、衣壳化，随后的 体外...

简单且可靠的 in vivo 与 in vitro 研究病毒组装的方法

本视频展示了一种用于检测抗呼吸道合胞病毒（RSV）中和抗体的实验方法。将含有抗RSV中和抗体的血清与病毒预先孵育，可使病毒颗粒失活，从而减少细胞感染及空斑形成。随后对感染病毒的细胞进行固定、封闭，并使用荧光素标记的抗体进行染色，以实现空斑的可视化观察。该过程可用于确定能够中和50%...

一种用于测定呼吸道合胞病毒特异性中和抗体滴度的检测方法

人呼吸道合胞病毒（HRSV）可导致婴幼儿严重的细支气管炎。严重HRSV疾病发病机制的一部分由宿主免疫反应引起。利用HRSV刺激原代人免疫细胞，可提供一种快速且可重复的模型系统，用于研究炎症通路的活化及感染过程。...

一个 体外 研究人外周血单个核细胞对人呼吸道合胞病毒感染免疫应答的模型

本文介绍了一种构建感染性细菌人工染色体的实验方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组RNA的全长cDNA。该方案可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，因此是研究病毒生物学的有力基因组学工具。...

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本文介绍了一种在BSL-2条件下生成假病毒颗粒的实验方案，该假病毒颗粒携带高致病性病毒——中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒的刺突蛋白。这些假病毒颗粒含有荧光素酶报告基因，可用于定量检测病毒进入靶宿主细胞的过程。...

在生物安全二级条件下制备假病毒颗粒以研究高致病性冠状病毒

一种改进的高通量呼吸道合胞病毒（RSV）微量中和实验

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重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

我们提出了一种优化的体外（in...

生产一种SARS-CoV-2病毒样颗粒系统以在体外研究病毒生命周期 In Vitro

学习利用磷蛋白作为分子伴侣在体外组装呼吸道合胞病毒核衣壳的方法。该技术通过共表达RNA游离核蛋白解决重组病毒蛋白表达难题，适用于其他非分节段负链RNA病毒研究。

呼吸道合胞病毒特异性核衣壳的生成与组装

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