呼吸系统同步病毒病毒特定核胶囊的生成和组装
2021年7月27日
为了深入分析呼吸道同步病毒 （RSV） RNA 合成，我们报告了利用伴生磷蛋白 （P） 共同表达无RNA核蛋白 （N0）的协议，用于病毒特定核胶囊 （NCs） 的后续 体外 组装。
这种方法利用各种方法解决重组病毒蛋白表达挑战使用一种病毒蛋白P'作为伴随另一个病毒蛋白N'获得无RNAN蛋白质。无RNA的RSV N蛋白是在将病毒特定RNA组装成体外核胶囊之前获得的。该方法还可用于其他非细分负感RNA病毒。
结对独立克隆法是获取共同表达结构的快速技术。为什么或选修课污渍电子显微镜是检查生细胞中大组装的快速方法。我们想给你两个提示。
首先，在进入下一步之前，每一步都获得高收益和扎实的结果。第二，建立适当的色谱程序，并练习用钳子拾取网格。对于N和P共同表达的双语制结构，在37摄氏度的LB介质中生长四个一升培养大肠杆菌BL21DE3应变细胞。
当 600 纳米的光学密度达到 0.6 时，将温度降低到 16 摄氏度。一小时后，通过治疗诱导蛋白质表达与0.5毫升IPTG过夜。第二天早上，通过离心收集细胞，并在200毫升的裂解缓冲器中补充颗粒。
通过声波解化细胞15分钟，3秒开，3秒关闭脉冲。并通过离心收集裂解物。将超自然物装载到 2.5 乘 10 厘米的钴重力柱中，并带有大约 10 毫升的珠子。
预平衡 5 到 10 列的裂解缓冲器。并用五列缓冲器 B 和五卷缓冲 C 清洗柱子。使用两卷缓冲 D 从珠子中去除蛋白质。并平衡Q列与五个一毫升的Q缓冲器体积。
使用围射泵将稀释的样品加载到柱子上。将加载的 Q 列与新鲜的 QA 和 QB 缓冲器一起熔化到 HPLC 机器上。运行泵清洗，用一到两卷 QB 和 QA 缓冲器成功清洗机器。
最后一次洗涤后，将流速设定为每分钟一毫升，并设置紫外线1至280纳米和紫外线2至260纳米，使用96深井板收集分数。然后使用每浓度的三到四卷洗脱剂的分步梯度应用来阐明蛋白质，从0%的QB浓度开始，每次增加5%的百分比。N-0 P 蛋白复合物将在 15% QB 缓冲浓度下稀释。
通过凝胶过滤分离蛋白质，在一个30厘米的小规模纯化柱中，用缓冲器E等于，然后通过SDS页面分析含有分数的蛋白质。对于病毒特定的核胶囊组装，混合和孵育纯净的N-0 P复合物与RNA寡头在室温下1:1.5分子比一小时。用缓冲器 E 预平衡小规模纯化凝胶过滤柱，并通过离心去除任何沉淀物。
加载超自然，到大小排除色谱列。并将蛋白质的大小排除色谱图像与RNA组装进行比较，并单独对照蛋白质控制样品，结合核酸纯度比，确定哪些峰值是组装的N RNA、N-0 P和自由RNA。要组装 N RNA 复合物，收集所有 N RNA 峰值分数，执行 RNA 提取，并运行尿素页凝胶以仔细检查特定 RNA 的长度。
要为负污渍电子显微镜准备负污渍网格，使用热板加热 5 mL 的双蒸馏水煮沸，并在水中加入 37.5 毫克尿素，以获得 0.75% 的尿素供友染色溶液。将溶液转移到铝箔覆盖烧嘴上。并加入4微升的10摩尔氢氧化钠。
搅拌15分钟后，通过0.22微米滤芯将溶液过滤到试管中。要使连续的碳涂层电子显微镜网格具有亲水性，请将电网放置在连接到电源的腔室中，并将带负电荷的离子应用于电网。剪切并折叠两英寸的胶片条。
将两滴 40 微升蒸馏水添加到条带的一端。和两个 40 微升下降 0.75% 尿素为队友染色溶液到另一端。在每个网格中加入三微升蛋白质样本。
一分钟后，将网格阻塞在印迹纸上，并将网格浸入蒸馏水滴中两次。一旦在第一个染色溶液液滴。然后将网格浸入第二个染色溶液液滴中 30 秒，然后将网格与印迹纸擦黑，以去除任何多余的污渍溶液，并允许网格在成像前风干。
利用本协议，可获得大规模可溶性异地呼吸道同步病毒N0 P复合物。在大肠杆菌中，P蛋白的N和N-终端部分的全长与N蛋白上的10 X标签共同表达。根据紫外线吸收核酸纯度比，N0 P 包含全长 N 和 N 端 P，但不包含细胞RNA。
然后，纯化的N0 P可以通过特定RNA寡头的孵化，像电子显微镜网格上的粒子一样被刺激并组装成核胶囊。当净化蛋白质时，在柱子纯化过程中避免气泡，用 QA 缓冲器稀释样品，以调整 pH 和盐浓度，然后将样品加载到柱子上。小心将电子显微镜网格保持在外缘，以免对网格进行污染物处理。
这将有助于我们确定非阳性RSV基因组包装问题，无论是左手还是右手的单体结构。按照这些程序，可以执行RSV聚合酶活性检测的RNA模板。而这种RSV病毒特异性核胶囊可用于高分辨率低温EM分析。
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概述
本文介绍了一种使用磷酸蛋白（P）作为RNA-free核蛋白（N）的伴侣蛋白来进行呼吸道合胞病毒（RSV）核衣壳体的体外组装方法。该方法解决了重组病毒蛋白表达的挑战，可应用于其他非分段负链RNA病毒。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 分子生物学
- 病毒蛋白表达
背景
- 呼吸道合胞病毒（RSV）是一种重要的呼吸道病原体。
- 理解RSV RNA合成对开发治疗策略至关重要。
- 伴侣蛋白可以促进病毒蛋白的正确折叠和组装。
- 在有效表达重组病毒蛋白方面存在挑战。
研究目的
- 开发RSV核衣壳体组装的协议。
- 利用磷酸蛋白（P）作为RNA-free核蛋白（N）的伴侣蛋白。
- 提供一种可应用于其他非分段负链RNA病毒的方法。
所用方法
- 磷酸蛋白（P）和RNA-free核蛋白（N）的共表达。
- 病毒特异性核衣壳体的体外组装。
- 用于获得共表达构建体的不依赖连接克隆。
- 用于可视化组装结构的电子显微镜。
主要结果
- 成功将RNA-free RSV核蛋白组装成核衣壳体。
- 证明了使用P作为伴侣蛋白的有效性。
- 该方法显示了应用于其他病毒的潜力。
- 电子显微镜确认了大型结构的组装。
结论
- 该研究为RSV研究提供了宝贵的协议。
- 利用伴侣蛋白可以增强病毒蛋白表达。
- 这种方法可能促进对非分段负链RNA病毒的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Authentic assembly of virus-specific nucleocapsids for respiratory syncytial virus (RSV) enables mechanistic interrogation of viral RNA synthesis, directly impacting early-stage target validation and assay development in antiviral R&D. This protocol overcomes longstanding challenges in generating RNA-free nucleoprotein complexes, supporting predictive confidence in virology workflows. The approach is broadly relevant for nonsegmented negative-sense RNA virus research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic dissection of viral RNA synthesis using authentic nucleocapsid substrates.
- Supports functional target validation by providing native-like ribonucleoprotein complexes.
- Facilitates biological de-risking for antiviral target selection and pathway analysis.
- Improves predictive confidence in early-stage virology research portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated nucleocapsid complexes for downstream polymerase activity assays.
- Enables standardization and reproducibility in in vitro viral replication assays.
- Supports quantitative readouts for compound screening and mechanistic studies.
- Prepares robust biological systems for scalable assay platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro systems with disease-relevant viral replication mechanisms.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of antiviral strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity.
- Facilitates high-resolution structural studies for translational biomarker identification.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and assay development, enabling transition from mechanistic hypothesis testing to quantitative screening and preclinical validation.
- Discovery Biology: Provides authentic nucleocapsid substrates for hypothesis-driven interrogation of viral replication.
- Screening: Delivers reproducible, standardized complexes for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of nucleocapsid assembly and RNA incorporation.
- Translational Research: Supports alignment with disease-relevant viral processes for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiple nonsegmented negative-sense RNA viruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in antiviral target validation.
- Operational Value: Standardizes nucleocapsid preparation for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression and purification.
- Demands access to chromatography and electron microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility in complex assembly.
- Adaptable to other nonsegmented negative-sense RNA virus systems with protocol optimization.
- Dependent on precise control of RNA and protein stoichiometry for authentic assembly.
