小鼠后肢激光多普勒血流成像

皮肤溃疡伴愈合不良是导致人类患者截肢的主要原因。充分的伤口愈合需要比维持完整皮肤更高的动脉灌注水平，而在外周动脉疾病患者中，这种灌注水平受到损害。其他多种风湿性疾病和糖尿病也可能导致皮肤微循环障碍，从而影响伤口愈合。

许多糖尿病患者同时患有外周动脉疾病，这使他们面临极高的截肢风险。激光多普勒灌注成像（LDPI）在临床中用于评估皮肤微循环，也在科研中用于评估实验性后肢缺血、缺血再灌注以及显微外科皮瓣术后的血流及血流恢复情况。LDPI系统投射一束低功率激光，该激光被扫描镜反射，从而移动覆盖目标区域。

这与激光多普勒血流仪不同，后者仅能对直接接触血流探头的小范围组织提供灌注测量。当激光束与微血管中流动的血液相互作用时，会发生多普勒频移，该信号由扫描仪中的光电探测器检测并转换为任意灌注单位。由于激光多普勒灌注成像（LDPI）是一种基于光的技术，其穿透深度受限，仅为 0.3 至 1 毫米，因此主要评估的是真皮层的灌注情况。

皮肤温度和交感神经系统可影响皮肤血流，而这些因素可能受到多种麻醉剂的影响。光学激光测量结果还受环境光照条件、皮肤色素沉着的影响，并可能被表层的毛发或皮毛遮挡。由于激光多普勒灌注成像（LDPI）具有无创性，无需使用造影剂，且扫描速度快，可实现对多只动物的数据采集，因此是监测缺血后灌注恢复最常用的研究技术。

这使其成为评估旨在促进治疗性动脉生成或血管生成的疗法在小型动物模型中是否有效的理想方法。通过激光多普勒血流成像（LDPI）测量的后肢缺血后血流恢复情况，与其他方法（如微血管灌注铸型或显微CT）评估的侧支动脉发育情况具有良好的相关性。本方案的目标是演示如何使用LDPI评估后肢灌注。调整扫描仪高度，使扫描仪与被扫描对象之间的距离约为30厘米。

打开成像仪并启动相关软件。打开检测程序。如果软件与扫描仪通信正常，将出现红外激光开启警告提示。

根据房间内的背景材料和照明条件调整扫描仪设置。将激光束对准黑色背景材料，按下“自动背景设定”以设置背景阈值。设置异氟烷诱导室，并配备适当的废气清除装置。

将诱导室放置在加热垫上，有助于防止小鼠在麻醉诱导期间体温下降。打开同温毯装置，该装置置于扫描区域下方的非反光表面之上，本例中为黑色氯丁橡胶织物。

将恒温毯设置为维持体温37摄氏度。将温度探针和润滑剂放置在便于插入的位置。同时，将麻醉面罩和废气清除系统置于扫描区域内。

使用异氟烷麻醉机对小鼠进行麻醉。氧气流速设定为每分钟1升，异氟烷浓度调整为4%以诱导麻醉。

打开气流至麻醉诱导室，小鼠的呼吸频率将减慢。当小鼠失去翻正反射时，即达到充分的麻醉状态。将小鼠转移至带有连接废气清除装置的麻醉面罩鼻罩，并将异氟烷浓度调节至1.5%。此麻醉水平通常足以使小鼠在扫描过程中保持相对静止，但并不旨在提供外科手术深度的麻醉。

因此，麻醉深度未被监测。异氟烷浓度的改变会引起心率、呼吸和皮肤灌注的变化。因此，在任何时间过程实验中以及对所有实验对象，应始终使用恒定的异氟烷浓度。

其他麻醉方法（如氯胺酮与赛拉嗪的腹腔注射）也可使用，但在同一时间过程研究中应始终采用相同的麻醉方法，因为不同的麻醉剂对皮肤灌注的影响不同。如果待扫描的目标区域被毛发覆盖，可使用小型电动剃毛器和/或脱毛膏去除目标区域的毛发。扫描前应彻底清除脱毛膏，并将小鼠皮肤完全擦干，因为湿润的皮肤可能导致激光反射。将与恒温毯配套的润滑直肠温度探头插入小鼠直肠内。

将小鼠体温平衡至所需的扫描温度，即 37 摄氏度。此过程可能需要 5 到 10 分钟。选择扫描仪设置，可通过顶部菜单或扫描仪设置图标进入。

应通过调整X、Y坐标来改变扫描区域，以适应目标区域。扫描速度取决于扫描分辨率。分辨率越高，扫描所需时间越长。

对于重复扫描，若关注的是整体灌注情况，而非高分辨率的解剖学灌注，则每像素4毫秒的最高速度已足够。若需进行重复扫描，请选择“重复与线扫描”选项卡。扫描次数可进行调整。

在此情况下，包括三次扫描以及重复间隔时间。重复间隔的最短时间由右侧框内灰色区域所示的估计扫描时间决定，该时间根据扫描面积和扫描分辨率确定。增加几秒钟可允许用户在每次扫描之间暂停，并在需要时重新调整鼠标位置。

本案例中的总扫描时间为3分21秒。选择“图像扫描”选项卡，然后选择“标记”按钮。这将使激光勾勒出扫描区域的轮廓。

调整鼠标位置，使待扫描的目标位于标记区域内。选择“重复扫描”图标并按下播放按钮，以启动扫描，开始重复测量。此时将弹出一个确认扫描距离的窗口。

单击“确定”开始扫描。图中实时显示了在诱导小鼠后肢缺血之前进行的初始扫描。第二次和第三次重复扫描已加速至16倍速。

主窗口显示软件生成的扫描结果。右下角插图显示激光正在扫描小鼠足垫。对于足垫或足垫联合小腿背侧的扫描，采用俯卧位并使后肢向尾部方向伸展，相较于仰卧位能提供更一致的兴趣区域。

股动脉、隐动脉及其侧支血管非常靠近大腿和小腿的腹侧表面，因此在使用这些感兴趣区域时，建议采用仰卧位。扫描过程中需监测小鼠的运动情况。

如果在扫描过程中，小鼠移动幅度较大，导致足垫不再位于扫描区域中央，则需重新开始扫描。分析软件可对小鼠足垫位置的微小变化进行校正。此外，在扫描过程中需持续监测小鼠体温，即使使用恒温毯，体温仍可能出现波动。

如果小鼠体温波动过大，可能会导致不同扫描之间的显著差异。通常，体温范围在 36.8 至 37.2 之间可获得可接受的数据。在“另存为”窗口中保存采集的扫描文件时，文件名应包含小鼠标识符和时间点，以便于后续数据分析。

如需，可在“受试者详情”窗口中输入小鼠及时间点的详细信息。此处显示的是调整扫描区域后，小鼠处于仰卧位时对后肢腹侧进行扫描的图像。请注意，当小鼠仰卧时，扫描区域会不同程度地包含足部侧面的部分组织。

移除直肠温度探头，并用70%乙醇进行消毒，以便供下一只小鼠使用。将异氟烷浓度降至0%。在恢复过程中持续给予氧气可使小鼠苏醒更快，但也可在不补充氧气的情况下恢复。在将小鼠放回笼子之前，应让其从麻醉状态恢复至能够表现出翻正反射，即能从仰卧位自行翻转为俯卧位。

恢复可在加热垫上进行，适用于异氟烷麻醉，因为其恢复速度非常快；或在温暖的恢复笼中进行，适用于氯胺酮-赛拉嗪麻醉。打开成像回顾软件程序，将弹出用于查看扫描图像的新窗口。

转到文件菜单，选择打开并找到已保存的文件。从工具栏中选择 ROI 图标。选择添加多边形图标。

使用鼠标在感兴趣区域周围进行描记。完成后，返回工具栏并选择统计图标。此时将弹出一个窗口，显示该感兴趣区域的统计信息。

在数据分析过程中，每只脚垫在重复扫描中的平均灌注单位（PU）数值变化不超过100至150 PU。此结果属于可接受的扫描范围，表明小鼠在扫描期间已达到良好的平衡状态。若平均PU值在重复扫描中的变异超过100至150 PU，相当于非手术小鼠脚垫平均灌注量的10%以上，则表明小鼠未达到良好平衡状态，强烈建议重新进行扫描。

在扫描完成后立即进行快速分析，可以在小鼠仍处于麻醉状态时重新扫描，从而避免因后续分析发现重复扫描间存在显著差异而导致数据点丢失。结果以手术侧后肢灌注与对照侧后肢灌注的比值表示；由于小鼠在术后会先出现血管扩张，随后逐渐形成内在侧支循环，因此通过LDPI应能观察到术后不同时间点的血流恢复情况。恢复程度取决于小鼠品系及后肢缺血模型的严重程度。

该图展示了一项为期28天的完整时间过程实验，其中使用LDPI在股动脉结扎后，对P27基因敲除型和野生型C57Bl/6小鼠的足垫血流恢复情况进行随时间监测。在给予口服多西环素（一种广谱基质金属蛋白酶抑制剂）处理后，P27基因敲除型小鼠与野生型小鼠相比，血流恢复能力受损，提示MMP活性有助于动脉生成。在整个时间过程实验中，增益设置和背景阈值应保持恒定。

如果背景阈值设置过低，扫描背景材料时将导致灌注值偏低。这会使背景灌注值在多边形选区过程中被平均到感兴趣区域中。为消除此问题，可在“扫描仪设置”窗口的“常规”选项卡下调整背景阈值。

在此情况下，将背景阈值提高至118个灌注单位，可使灰色背景不被纳入任何分析。流量图像的调色板或颜色标尺既可在测量软件中调整，也可在图像浏览软件中调整。所有高于标尺最大值的灌注数值，均会以最高灌注对应的颜色显示。

在这种情况下，为红色。增加动态范围，例如将量程调整为从0到1500，会使重复扫描间的差异在视觉上更加明显，因为测量值在1000至1500灌注单位之间的区域现在将使用颜色梯度显示，而不是全部显示为红色。此处显示的扫描结果来自一只小鼠，该小鼠在重复扫描开始时的核心体温低于36.8°C，随后在重复扫描过程中逐渐升高。

需要注意的是，对照组足垫的平均灌注受较低的核心体温影响程度大于缺血侧足垫。若仅对体温较低的动物进行一次扫描，将导致该数据点记录的灌注比值偏高。小鼠皮肤色素沉着的差异（例如在C57Bl/6小鼠中可见的情况）可能导致扫描区域的信号低于背景阈值，从而使包含色素沉着区域的兴趣区分析变得困难。

小鼠足垫通常不会出现色素沉着过度，因此这是扫描该小鼠品系最方便的区域。如果研究者希望研究后肢腹侧，则应选择白色品系的小鼠。激光多普勒灌注成像（LDPI）是一种有效、操作简便且可重复的方法，可用于测量后肢皮肤灌注，以反映整体动脉灌注情况。

使用LDPI获取可靠数据时，需要保持操作技术的一致性。