激光多普勒灌注成像在鼠标欣德利姆
April 18th, 2021
在这里，我们提出了一个协议，演示了激光多普勒灌注成像的技术和必要的控制，以测量小鼠后肢的血流。
伤口愈合不足的皮肤溃疡是人类患者截肢的主要原因。充分的伤口愈合需要更高的动脉丰度水平，这是需要保持完整的皮肤，这是妥协的外周动脉疾病患者。其他几个类风湿病和糖尿病也可能导致不安和不足的皮肤微循环愈合伤口。
许多糖尿病患者患有伴随的外周动脉疾病，使他们面临截肢的特别高风险。激光多普勒灌注成像或 LDPI 用于临床情况，用于评估皮肤微循环以及研究情况，以评估实验性后肢缺血、缺血性输液和显微外科皮瓣后的血流和血流恢复。LDPI 系统投射低功率激光束，该光束由扫描镜偏转，以移动到感兴趣的区域。
这与激光多普勒流量计不同，后者为与流测探头直接接触的较小组织区域提供灌注测量。当激光束与微血管中移动的血液相互作用时，它会经历多普勒频率变化，由扫描仪进行光电检测并转换为任意灌注单元。由于 LDPI 是一种基于光的技术，因此其渗透深度限制为 0.3 至 1 毫米，这意味着大部分皮肤灌注都进行了评估。
皮肤流量可以通过皮肤温度和交感神经系统改变，这可能会受到各种麻醉剂的影响。光学激光的测量也受到环境照明条件、皮肤色素沉着的影响，并可能被过度的毛皮或头发阻塞。LDPI 是最常用的研究技术，用于监测缺血后大量恢复，因为它具有非侵入性，不需要对比度管理，并且具有快速扫描时间，允许对多个动物进行数据收集。
这使得它非常理想，以帮助确定治疗动脉生成或血管生成的治疗是否有效的小动物模型。LDPI 测量的后肢缺血后血流恢复与辅助动脉发育密切相关，当通过其他方法（如微填充铸造或微CT）进行评估时。本协议的目的是演示使用 LDPI 对后肢灌注的评估。调整扫描仪高度，使扫描对象的距离约为 30 厘米。
打开成像器并启动相关软件。打开测量程序。如果软件与扫描仪进行正确通信，将显示红外激光打开警告。
调整扫描仪设置，以适合房间的背景材料和照明设置。通过将激光束指向黑色背景材料并按自动 BK 集设置背景阈值。设置异氟素感应室，适当清除废气。
将感应室放在加热垫上将有助于防止麻醉感应期间小鼠温度下降。打开放在非反射表面下方扫描区域的温热毯。在这种情况下，黑色氯丁橡胶织物。
家温毯将保持37摄氏度的体温。定位温度探头和润滑油，以便它们准备好插入。将麻醉面罩和清除系统放入扫描区域。
用异氟烷蒸发器麻醉小鼠。氧气率设定为每分钟流动一升。麻醉感应的异丙酮调整为4%。
水流被打开到麻醉感应室，鼠标的呼吸速度会变慢。当鼠标失去正确的反射时，可以达到足够的麻醉效果。将鼠标转移到麻醉面膜鼻锥，并附上废气清理器，并将异氟兰调整到1.5%，这种麻醉水平通常足以使小鼠在扫描过程中相对静止，但并不打算提供手术麻醉水平。
因此，麻醉的深度没有检查。改变异丙酮水平会导致心率、呼吸和皮肤大量变化。因此，在任何时间课程实验和所有实验科目中，都应使用一致的百分比。
替代麻醉技术，如氯胺酮二甲胺的IP注射也可以使用，但相同的麻醉技术应该在整个任何时间课程研究中使用，因为不同的麻醉剂对皮肤的丰富影响不同。如果要扫描的计划区域被毛皮覆盖，请使用小型电修剪器和/或脱毛霜从感兴趣的区域去除头发。脱脂霜应完全去除，小鼠皮肤在扫描前干燥，因为湿润的皮肤可能会导致激光反射将与家温毯相关的润滑直肠温度探头插入小鼠直肠。
平衡鼠标温度，以欲望扫描温度，37摄氏度。这可能需要长达 5 到 10 分钟。选择可从顶部菜单或扫描仪设置图标访问的扫描仪设置。
扫描区域应通过更改 X、Y 坐标来调整，以适应感兴趣的区域。扫描速度将取决于扫描分辨率。更高的分辨率将导致更长的扫描时间。
对于重复扫描，专注于全球大量，而不是更高的分辨率专注于解剖灌注，最高扫描速度为每像素四毫秒是足够的。如果执行重复扫描，请选择重复扫描和线扫描选项卡。扫描次数可以更改。
在这种情况下，三次扫描，以及重复间隔。重复间隔的最短时间是框右侧灰色区域显示的估计扫描时间，由扫描区域和扫描分辨率决定。添加几秒钟后，用户可以暂停，如果需要，可能会在扫描之间重新定位鼠标。
本案的总扫描时间为 3 分 21 秒。选择"图像扫描"选项卡并选择"标记"按钮。这将导致激光勾勒出扫描区域的轮廓。
调整鼠标位置，以便扫描的目标位于标记区域内。通过选择重复扫描图标并按下 Play 按钮启动扫描，开始重复测量。将显示一个确认扫描距离的弹出窗口。
单击"确定"开始扫描。在诱导后肢缺血之前对鼠标的初始扫描实时显示。第二次和第三次重复扫描加速到 16 倍的速度。
主窗口显示由软件生成的扫描结果。右下角的插图显示激光扫描鼠标脚垫。对于脚垫或脚垫和背背小腿扫描，容易定位与后肢向尾部延伸提供了一个更一致的兴趣区域，在苏平定位。
股动脉、树苗动脉和辅助材料非常接近大腿和小腿的腹腔表面。因此，如果使用这些感兴趣的区域，则首选超置定位。在扫描鼠标移动时监视鼠标。
如果鼠标移动得足够充分，脚垫不再位于扫描中间的扫描区域，请重新启动扫描。在分析软件中可以容纳鼠标脚垫位置的小变化。此外，在扫描过程中监测鼠标温度，因为即使使用家温毯，鼠标也可能波动。
如果鼠标温度变化太大，这可能会导致扫描之间的显著变化。一般来说，36.8 至 37.2 的温度范围将产生可接受的数据。在"保存为"窗口下保存捕获的扫描，其中包含鼠标标识符和时间点的文件名，以便于进行数据分析。
如果需要，请在主题详细信息窗口中输入鼠标和时间点详细信息。调整扫描区域后，此处显示使用鼠标处于超平位置的文特尔后肢扫描。请注意，使用鼠标的命题会导致扫描脚侧的可变部分。
取出直肠温度探头，用 70% 乙醇消毒，以便为下一只鼠标做好准备。如果小鼠继续接受氧气，其恢复速度会更快，但无需补充氧气也可以恢复。允许鼠标从麻醉中恢复到显示右反射的地步，在返回笼子之前，将鼠标从苏平位置翻转到易发生位置。
恢复可以在异氟素的加热毯上进行，因为恢复非常快，也可以在氯胺酮 xylazine 的温暖恢复笼中进行。打开成像审查软件程序。将打开一个新的窗口来查看扫描。
转到"文件"菜单，打开并定位已保存的文件。从工具栏中选择投资回报率图标。选择"添加多边形"图标。
使用鼠标跟踪感兴趣区域周围的区域。完成后，返回工具栏并选择"统计"图标。这将带来一个窗口，显示来自感兴趣地区的统计数据。
在数据审查方面，与每个脚垫的重复扫描相比，平均丰度单位（PU）值的差异不超过 100 到 150 PU。这是一个可接受的扫描，并指示鼠标在扫描过程中很好地平衡。平均 PU 值的变异大于 100 到 150 PU，这相当于重复扫描中未操作鼠标脚垫平均灌注的 10% 以上，表明鼠标没有很好地平衡，强烈建议重复扫描。
扫描完成后立即进行快速分析，允许在鼠标仍在麻醉时进行重复扫描，并避免丢失如果在以后分析扫描时可能发生的数据点，并且由于重复扫描之间的显著变化，扫描被视为不可接受的。结果表现为手术后肢大量超过控制后肢灌注的比例，因为小鼠最初是血管扩张，然后发展其内在的抵押品，LDPI的血流量恢复应在术后时间过程中看到。恢复程度取决于小鼠应变和后肢缺血模型的严重程度。
这个数字显示了一个完成的时间课程实验超过28天，其中LDCI被用来测量脚垫血流恢复随着时间的推移后，股骨动脉结缘和P27淘汰赛和野生类型C57Bl/6小鼠。野生型小鼠的两种P27淘汰赛在用口服多氧环素（一种广义基质金属蛋白酶抑制剂）治疗时都损害了血流量的恢复，这表明MMP活性有助于动脉形成。在整个时间课程实验中，增益设置和背景阈值应保持不变。
如果背景阈值设置过低，扫描背景材料将导致低丰度值。这将导致在多边形选择过程中将背景丰富值平均值纳入感兴趣区域。要消除此问题，可以在"一般"选项卡下的扫描仪设置窗口中调整背景阈值。
在这种情况下，将背景阈值提高到 118 个大量单位会导致灰色背景，而该背景不会包含在任何分析中。通量图像的调色板或色阶可以在测量软件和图像审查软件中进行调整。所有大于比例上最大值的丰度值都将显示为最高丰度颜色。
在这种情况下，红色。例如，将动态范围从零更改为 1500，将使重复扫描变化对眼睛更加明显，因为测量 1000 到 1500 个丰度单位的区域现在将使用颜色梯度显示，而不是全部显示为红色。此处显示的扫描是在重复扫描开始时，其核心体温最初低于 36.8 的鼠标中获得的，然后在重复扫描中增加。
请注意，控制脚垫的平均丰度比缺血脚垫更受较冷的核心体温的影响。单次扫描较冷的体温会导致该数据点的丰度比率更高。小鼠皮肤色素着色的变化，如C57Bl/6小鼠，可能导致扫描区域低于背景阈值，这将使分析含有色素区域的兴趣区域变得困难。
鼠标脚垫一般没有高估，这使得这个最方便的区域扫描这个鼠标应变。如果研究人员希望研究腹腔后肢，则应选择白鼠株。LDPI 是一种有效、易于执行且可重复的方法，用于测量后肢皮肤丰度，以反映整体动脉灌注。
使用 LDPI 获取可靠数据时，需要一致的技术。
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概述
本文介绍了一种激光多普勒灌注成像（LDPI）协议，用于测量小鼠后肢的血流。LDPI 对于评估皮肤微循环至关重要，特别是在外周动脉疾病和糖尿病等情况下。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微循环
- 成像技术
背景
- 皮肤溃疡和不充分的伤口愈合可能导致截肢。
- 更高的动脉充盈水平对于维持完整的皮肤是必要的。
- 外周动脉疾病和糖尿病可能会破坏皮肤微循环。
- LDPI 用于评估各种临床和研究场景中的血流和恢复。
研究目的
- 展示 LDPI 技术用于测量血流。
- 提供必要的控制以进行准确测量。
- 强调评估伤口愈合中微循环的重要性。
使用的方法
- 激光多普勒灌注成像技术。
- 低功率激光束投射。
- 用于感兴趣区域评估的扫描镜。
- 评估缺血后血流恢复。
主要结果
- LDPI 有效测量小鼠后肢的血流。
- 展示的控制增强了测量精度。
- 提供了各种条件下微循环的见解。
- 支持伤口愈合和缺血恢复的研究。
结论
- LDPI 是评估皮肤微循环的有价值工具。
- 可以帮助理解伤口愈合机制。
- 可能降低高风险人群的截肢风险。
常见问题
Executive Industry Relevance
Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) provides a noninvasive, repeatable method for assessing dermal blood flow recovery in preclinical models of hindlimb ischemia, supporting evaluation of therapeutic arteriogenesis and angiogenesis strategies. By enabling longitudinal monitoring of perfusion in small animal models, LDPI aids in target validation and mechanistic de-risking of pro-angiogenic candidates before costly late-stage studies. Its utility in quantifying perfusion recovery correlates with collateral artery development, offering predictive confidence in translational continuity from discovery to preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to arteriogenesis and angiogenesis by measuring functional blood flow recovery as a phenotypic endpoint.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, longitudinal assessment of perfusion in disease-relevant hindlimb ischemia models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, reproducible perfusion measurements in arbitrary units, facilitating reliable compound evaluation across time course experiments.
- Operational Value: Enables high-throughput readiness due to quick scan times, non-invasiveness, and absence of contrast agents, supporting repeated measurements in the same animal.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system data where LDPI-measured perfusion recovery correlates with microvascular collateral formation, enhancing predictive confidence in therapeutic efficacy.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by offering a consistent, translatable perfusion readout across study phases.
Pipeline & Workflow Integration
LDPI fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for programs focused on ischemic tissue repair and perfusion restoration.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying perfusion changes in response to genetic or pharmacological manipulations in hindlimb ischemia models.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scanning protocols, consistent background thresholding, and repeatable region-of-interest selection for reliable perfusion quantification.
- Analytics: Generates quantitative perfusion unit (PU) outputs and ratio-based recovery metrics (ischemic/control limb) that enable statistical comparison across experimental groups and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating LDPI-derived perfusion recovery against gold-standard methods like microfill casting and micro-CT, reinforcing its role in de-risking angiogenic targets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across multiple ischemic models and therapeutic modalities due to its noninvasive nature and compatibility with longitudinal study designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, functional assessment of blood flow recovery.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled anesthesia, temperature regulation, and hair removal protocols that minimize confounding variables in dermal perfusion measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, quantitative perfusion data that correlates with pathophysiological outcomes, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic candidates based on demonstrable perfusion recovery in preclinical models, supporting capital-efficient advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, anesthesia management, and physiological monitoring to maintain consistent dermal perfusion during imaging.
- Dependent on laser Doppler imager with scanning mirror, temperature regulation equipment (e.g., homeothermic blanket), and image analysis software for region-of-interest tracing and perfusion quantification.
- Necessitates cross-team standardization of scanner settings (background threshold, gain, scan speed) and animal preparation protocols (anesthetic type, temperature, hair removal) to ensure reproducibility across studies and sites.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, skin pigmentation, and anatomical regions of interest (e.g., footpad vs. ventral hindlimb), which may require strain-specific optimization or alternative positioning.
- Limited by measurement depth (0.3–1 mm), restricting assessment to dermal perfusion and potentially missing deeper muscular perfusion changes relevant to certain ischemic models.
