Name: 为互连神经元微缩组织制造磁平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 了解利用磁性纳米颗粒和微图案平台控制神经元网络形成的方法。该技术可在微米尺度精确调控细胞位置与生长，为神经科学体外研究和生物接口设备治疗应用提供新工具。

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本研究由科学部资助 &amp;#38; 技术，以色列，以及以色列科学基金会（569/16）。

注意：所有生物反应均须在生物安全柜中进行。
1. 磁性平台的制备
<ol>
	<li>光刻
	<ol>
		<li>使用刻划笔将载玻片切割成 2 × 2 cm2 的尺寸。将载玻片依次置于丙酮和异丙醇中超声清洗各 5 分钟。用超高纯度（UHP）氮气吹干。</li>
		<li>采用旋涂法在载玻片上涂覆光刻胶，转速为 6,000 rpm，持续 60 秒，以获得 1.5 µm 的厚度，并在 100 °C 下烘烤 60 秒。使用与光刻胶匹配的适当波长光源，通过光掩模或无掩模光刻技术对样品进行带有特定图案的曝光。</li>
		<li>在显影液中显影 40 秒，显影液按制造商说明用去离子水（DW）稀释；随后用去离子水清洗 45 秒，并用 UHP 氮气吹干。在光学显微镜下检查图案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溅射沉积
	<ol>
		<li>将样品放入沉积系统的主腔室，等待本底真空达到约 5 × 10-8 托。打开气体流量，设定氩气流量为标准溅射条件（本文为 28 sccm [标准立方厘米/分钟]）。点燃溅射靶材，然后将溅射气压设定为 3 mTorr。</li>
		<li>逐步提高各靶材的功率，直至达到所需的沉积速率。 
		&#8203;注意：Pd 沉积速率：0.62 Å/s = 1.0 nm/16 秒；Co80Fe20 沉积速率：0.32 Å/s，0.2 nm/6.25 秒。</li>
		<li>开启样品台旋转。通过依次打开和关闭 Co80Fe20 和 Pd 靶的快门，交替沉积 FM 多层膜。共沉积 14 个 Co80Fe20（0.2 nm）/Pd（1.0 nm）双层结构，最后再沉积一层 2 nm 厚的 Pd 保护层。</li>
		<li>去胶：将样品在丙酮中浸泡 30 分钟，然后用异丙醇冲洗。接着用 UHP 氮气吹干，并将样品保存在洁净干燥的环境中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过输运测量表征磁性器件
<ol>
	<li>使用带有100 µm宽十字形磁条的Si基底或玻璃片，磁条上已沉积FM多层膜（见图1C插图）。用双面胶将样品固定在样品台上。</li>
	<li>使用引线键合机，在样品的十字电极每条臂上各键合一根引线。将样品台及样品置于具有磁场的输运测量系统中，使磁场方向垂直于样品表面。在室温下进行测量。</li>
	<li>对器件进行横向电压（VT）测量；参照图1C（插图）中的标记：在触点1和3之间施加1 mA的电流，测量触点2和4之间的VT；然后在触点2和4之间施加电流，测量触点1和3之间的电压。最后，计算两次测量所得电压的差值，并除以2，得到VT。使用切换系统自动切换两种测量构型。</li>
	<li>将磁场从0.4 T扫描至-0.4 T，步长为5 mT，测量VT随磁场的变化。绘制横向电阻（VT/I）随磁场的变化曲线，以确定反常霍尔信号，该信号与薄膜中的垂直磁化强度成正比。</li>
</ol>
3. 通过磁强计测量对磁性纳米颗粒和磁性多层膜的表征
<ol>
	<li>铁磁多层膜的磁性测量
	<ol>
		<li>在硅基底上沉积铁磁多层膜（见第1.2节）。将样品切割成6个尺寸为4 × 4 mm2 的正方形。将样品逐片堆叠，并将其置于样品胶囊中，使堆叠方向垂直于磁场方向（见图1D插图）。</li>
		<li>将胶囊插入磁强计中，在室温下测量磁化强度。将磁场在-0.4 T至0.4 T范围内扫描。</li>
		<li>计算磁性材料的总体积，需考虑磁性层的厚度、样品尺寸以及基底数量。将测得的磁化强度除以磁性材料的总体积。</li>
		<li>绘制单位体积磁化强度随磁场变化的曲线。从高场区磁响应中扣除基底的抗磁背景，并通过曲线外推获得铁磁材料的饱和磁化强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性纳米颗粒（MNPs）的磁性测量
	<ol>
		<li>将指定质量的磁性纳米颗粒装入合成聚合物胶囊中。若测量的饱和磁化值较小，应考虑使用较大体积的样品。</li>
		<li>若磁性纳米颗粒分散在溶剂中，需将胶囊敞口放置过夜以干燥颗粒。将胶囊插入磁强计中，在室温下测量磁化强度。将磁场在-0.2 T至0.2 T范围内扫描。</li>
		<li>通过指定体积与颗粒浓度的乘积计算磁性纳米颗粒的总质量。将测量结果归一化至1克样品质量。</li>
		<li>绘制单位质量归一化磁化强度随磁场变化的曲线。通过曲线外推获得磁性纳米颗粒的饱和磁化强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胶原蛋白包被方案
<ol>
	<li>包被塑料培养皿
	<ol>
		<li>将490 µL盐酸加入500 mL经高压灭菌的双蒸水（DDW）中，配制0.01 M HCl。 
		注意：此步骤仅可在化学通风橱中进行。</li>
		<li>用0.01 M HCl将I型胶原蛋白（大鼠尾来源溶液）按1:60至1:80比例稀释，得到终工作浓度为50 µg/mL的溶液。取1.5 mL稀释液加入35 mm培养皿中，盖上盖子，在通风橱中静置1小时。</li>
		<li>吸除溶液，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。培养皿即可用于接种细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被玻片
	<ol>
		<li>用30%（v/v）乙醇将I型胶原蛋白（大鼠尾来源溶液）按1:50比例稀释。若包被一个35 mm培养皿，可将20 µL胶原蛋白加入1 mL 30%乙醇中。</li>
		<li>用上述溶液覆盖培养皿，静置至溶液完全蒸发，敞口放置数小时。用无菌1×PBS洗涤3次；玻片即可用于接种细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞对MNP的摄取及存活率
<ol>
	<li>细胞对MNP的摄取
	<ol>
		<li>在RPMI培养基中加入10%马血清（HS）、5%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和0.2%两性霉素B，配制PC12细胞培养用基础生长培养基，并使用0.22 µm尼龙滤器过滤。</li>
		<li>向RPMI培养基中加入1%马血清（HS）、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和0.2%两性霉素B，配制PC12分化培养基，并使用0.22 µm尼龙滤器过滤。</li>
		<li>在未经处理的培养瓶中加入10 mL基础培养基培养细胞；每2–3天向培养瓶中添加10 mL基础培养基，培养8天后对细胞进行传代。</li>
		<li>细胞摄取时，在离心管中将细胞悬液以200 × g离心8分钟 g 室温下离心，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 3 mL 新鲜的基础培养基中。再次以 200 × g 离心 5 分钟 g 室温下离心，弃去上清液。用3 mL新鲜分化培养基重悬细胞。</li>
		<li>用注射器和针头将细胞吹打10次，以分散细胞团块。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并接种106 未包被的常规35 mm培养皿中的细胞。</li>
		<li>向培养皿中加入计算好的磁性纳米颗粒（MNP）悬液体积和分化培养基体积，以达到所需的MNP浓度和总体积。混匀细胞、MNP和分化培养基，将培养皿置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24 h。</li>
		<li>将细胞悬液在200 × g条件下离心5分钟 g 在室温下离心，弃去上清液。用1 mL新鲜分化培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>负载MNP的细胞分化
	<ol>
		<li>执行摄取实验方案（第5.1节）。接种8 × 104 将载有MNP的细胞接种于35 mm、I型胶原包被的培养皿中，加入分化培养基（参见第4.1节中的胶原包被方案）。24小时后，加入1:100的新鲜小鼠β-神经生长因子（β-NGF）（终浓度为50 ng/mL）。</li>
		<li>每2天更换一次分化培养基，并添加新鲜的鼠源β-NGF。每隔2天使用光学显微镜对细胞进行成像观察。待神经网络形成后（PC12细胞通常需要6–8天），使用共聚焦显微镜对细胞成像，并观察颗粒的荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MNP负载细胞的活力检测：2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四氮唑-5-羧苯胺（XTT）细胞活力试验
	<ol>
		<li>按照步骤5.1.1制备基础生长培养基。将PC12细胞以不同浓度的磁性纳米颗粒（MNP，分别为0.1 mg/mL、0.25 mg/mL和0.5 mg/mL，溶于基础生长培养基中）处理，并设置不含MNP的对照组，每组设三个复孔，接种于平底96孔板中（每孔总体积为100 µL）。将细胞置于5% CO₂培养箱中孵育24 h。237 °C 恒温湿润培养箱中</li>
		<li>准备不含细胞的空白孔，仅含培养基，用于背景校正。解冻XTT试剂溶液及含有反应溶液的组分 N-methyl二苯并吡嗪甲基硫酸盐) 置于37 °C水浴中预热，使用前轻轻摇动，直至形成澄清溶液。</li>
		<li>对于一个96孔板，将0.1 mL激活液与5 mL XTT试剂混合。向每孔加入50 µL反应液，轻轻振荡平板以使染料在孔中均匀分布，然后将平板置于培养箱中孵育5 h。</li>
		<li>使用酶联免疫吸附测定（ELISA）读板仪，在450 nm波长下以空白孔为对照测定样品的吸光度。在630 nm波长下测定参考吸光度，并从450 nm的测定值中减去该参考值。</li>
		<li>由于含XTT试剂的培养基在450 nm处孵育时会产生轻微的自发性吸光度，需从其他各孔的吸光度值中减去空白孔的平均吸光度。同时，减去与细胞样品相同测试浓度下的磁性纳米颗粒（MNPs）平行样品的信号值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MNP负载细胞的活力检测：基于刃天青的细胞活力检测
	<ol>
		<li>按照步骤5.1.1制备基础生长培养基。将PC12细胞分别在含有不同浓度MNPs（0.1 mg/mL、0.25 mg/mL和0.5 mg/mL，溶于基础生长培养基中）的条件下，以及不含MNPs的对照组中，于平底96孔板中每组设三个复孔，培养24 h。将细胞置于5% CO₂培养箱中孵育24 h。2 37 °C 培养箱中孵育。准备不含细胞的空白孔，仅含培养基。</li>
		<li>用1×PBS洗涤细胞。向培养基中加入基于刃天青的试剂（10% w/v），在37 °C培养箱中孵育2 h。</li>
		<li>将150 µL样品等分试样加入ELISA读板仪中，在激发波长560 nm和发射波长590 nm条件下测定吸光度。减去与细胞样品相同测试浓度下的磁性纳米颗粒（MNPs）平行样品的信号值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 使用电感耦合等离子体（ICP）表征细胞内磁性纳米颗粒浓度
<ol>
	<li>根据步骤5.1.1准备基础生长培养基。将PC12细胞分别在含有不同浓度（0.1 mg/mL、0.25 mg/mL 和 0.5 mg/mL）磁性纳米颗粒（MNPs）的基础生长培养基中，以及不含MNPs的对照组中，以每孔100 µL的总体积，在96孔平底培养板中三复孔培养。在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>将各孔中的悬浮液分别转移至离心管中，在室温下以200 × g 离心5分钟，弃去上清液。用1 mL新鲜分化培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>向各孔分别加入100 µL 70%硝酸处理细胞至少15分钟以实现细胞裂解。向裂解后的细胞中加入5 mL去离子水（DDW），并过滤溶液。</li>
	<li>使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP）测定铁浓度，并结合细胞计数结果记录每个细胞的铁含量。</li>
</ol>
7. 磁性平台上的细胞分化与生长
<ol>
	<li>用70%（v/v）乙醇清洗图案化基底，并将基底放入超净台中的35 mm培养皿内。在图案化基底下方放置一块大磁铁（约1500 Oe），作用1分钟，然后先将培养皿向上移离磁铁，再将磁铁移出超净台。打开紫外灯照射15分钟。</li>
	<li>根据第4.2节方法用I型胶原蛋白包被基底。在细胞摄取磁性纳米颗粒（MNP）后（见第5.1节），将105个细胞接种至35 mm培养皿中，并加入2 mL分化培养基。将细胞培养物置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育。</li>
	<li>24小时后，加入1:100的新鲜小鼠β-NGF（终浓度为50 ng/mL）。每2天更换一次分化培养基，并添加新鲜的小鼠β-NGF。每隔2天使用光学显微镜观察细胞形态；在神经网络形成后，对细胞进行免疫染色（见第8.1节）。</li>
</ol>
8. 载有磁性纳米颗粒的细胞染色
<ol>
	<li>微管蛋白免疫染色
	<ol>
		<li>通过混合10 mL的16% w/v PFA溶液、4 mL的10x PBS和26 mL的DDW，配制4%多聚甲醛（PFA）溶液。将500 µL非离子型表面活性剂加入50 mL的1x PBS中，配制50 mL的1% PBT。将25 mL的1% PBT与25 mL的1x PBS混合，配制50 mL的0.5% PBT。在0.25% PBT中加入1%牛血清白蛋白和1%正常驴血清，配制封闭液。 
		&#8203;注意：仅可在化学通风橱内使用PFA。</li>
		<li>移除细胞中的上清培养基。在化学通风橱内，用4% PFA在室温下固定载有磁性纳米颗粒（MNP）的细胞15分钟。在化学通风橱内，用1x PBS洗涤载有MNP的细胞3次，每次5分钟。</li>
		<li>用0.5% PBT对载有MNP的细胞进行10分钟的透化处理。将载有MNP的细胞先在封闭液中于室温孵育45分钟，随后在封闭液中加入兔抗α-微管蛋白抗体，于4 °C过夜孵育。用1x PBS洗涤载有MNP的细胞3次，每次5分钟。</li>
		<li>在避光、室温条件下，用Cy2标记的驴抗兔二抗孵育载有MNP的细胞45分钟。用1x PBS洗涤载有MNP的细胞3次，每次5分钟。</li>
		<li>进行共聚焦成像。对于微管蛋白，使用492 nm的激发波长和510 nm的发射波长。对于磁性纳米颗粒（MNP，罗丹明标记），使用578 nm的激发波长和613 nm的发射波长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色
	<ol>
		<li>用1x PBS洗涤载有MNP的细胞3次，每次5分钟。去除样品周围的多余液体，加入1滴（约50 µL）含DAPI的封片剂，覆盖22 mm × 22 mm区域，在避光、室温条件下孵育5分钟。</li>
		<li>用1x PBS洗涤载有MNP的细胞3次，每次5分钟。进行共聚焦成像。对于DAPI，使用358 nm的激发波长和461 nm的发射波长。对于磁性纳米颗粒（MNP，罗丹明标记），使用578 nm的激发波长和613 nm的发射波长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 测量与统计分析
<ol>
	<li>载有磁性纳米颗粒细胞分化的形态计量学分析
	<ol>
		<li>为测量距离细胞体不同距离处的交点数量，需在使用神经生长因子（NGF）处理后最多3天内获取培养细胞的相差图像。 
		&#8203;注意：若操作时间过晚，细胞可能已形成网络，从而无法实现单细胞分辨率的测量。
		<ol>
			<li>在图像处理软件ImageJ中打开图像，并使用NeuronJ插件，该插件可实现半自动的神经突追踪与长度测量36。利用神经突追踪插件对神经突进行追踪，并将数据转换为二值图像。定义胞体中心位置。</li>
			<li>使用NeuronJ插件中的Sholl分析功能。设定最大半径。重复实验三次。每次实验分析超过100个细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞定位分析
	<ol>
		<li>为确定在孵育3天后定位在磁性区域的细胞百分比，需获取摄取与未摄取磁性纳米颗粒（MNP）细胞的共聚焦显微镜图像。使用DAPI染色（第8.2节）。</li>
		<li>手动计数位于图案上方或部分位于图案上方（接触细胞）以及未位于图案上方的细胞数量。重复三次实验。每次分析超过400个摄取和未摄取MNP的细胞。</li>
		<li>计算位于磁性图案上方的细胞占总细胞数的相对比例（有或无MNP）。此外，通过将细胞体直径加至图案宽度，计算磁性图案有效面积的比例，以确定细胞随机落在磁性图案上的概率。</li>
		<li>进行单样本 Z-检验，分析细胞分布是否为各向同性着陆的结果，或是否存在趋向磁性图案的偏好性偏差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生长方向性分析
	<ol>
		<li>为量化对神经突向外生长方向性的影响，需在孵育8天后获取经MNP处理与未经MNP处理细胞的共聚焦显微镜图像。进行免疫荧光染色（第8.1节）。</li>
		<li>使用ImageJ软件，测量两种条件下细胞神经突与磁性条带之间的夹角。 
		&#8203;注意：仅分析起源于位于磁性条带上的胞体的神经突。</li>
		<li>绘制神经突角度相对于条带方向（Δθ）的分布图。对Δθ的分布进行卡方检验，以证明该分布并非正态或均匀分布。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性经济利益。

代表性结果表明，本研究所提出的方法在微米尺度上控制和组织神经元网络形成方面具有显著效果。载有磁性纳米颗粒（MNP）的PC12细胞保持了良好的活性，并转化为对磁场敏感的单元，能够被铁磁（FM）电极产生的磁力引导至特定位置。这一点在图5C中表现得最为明显：细胞优先黏附于六边形结构的较大顶点处，而非细线部分。此外，细胞的分支生长也良好地遵循了磁性图案的分布。所有对照实验均明确表明，细胞体及其突起的定位是由磁力所引导的。尽管已有研究证明拓扑结构线索可用于引导神经突生长40,41，但本实验中并非如此，因为未负载磁性纳米颗粒的细胞对图案形状无任何响应。
采用自下而上的方法，利用许多研究机构中常见的标准光刻和溅射沉积技术来调控局部磁力，从而促进众多研究人员采用这些技术。该自下而上的方法可根据研究人员的需求灵活设计复杂图案和形状，在厘米尺度的区域内实现微米级分辨率。尽管实验结果是在玻璃载片上实现的，但原则上也可在其他适用于...

神经元的微图形化在组织再生1,2,3,4,5以及神经电子器件的开发6,7,8方面具有巨大潜力。然而，像生物组织中那样，在高空间分辨率下实现神经元的微米级精确定位仍面临重大挑战。在此尺度上构建预设结构，需要通过局部控制胞体运动和轴突生长来引导神经细胞的突起。以往研究已提出利用化学和物理信号9,10,11,12来引导神经元生长。本文介绍一种新方法，即通过磁场梯度控制细胞定位13,14,15,16,17，将载有磁性纳米颗粒（MNPs）的细胞转变为具有磁敏感性的单元，从而实现远程操控。
Kunze 等人通过使用磁性芯片和加载磁性纳米颗粒（MNP）的细胞，表征了诱导细胞反应所需的力，证明细胞内机械张力可触发早期轴突伸长18。Tay 等人证实，具有增强磁场梯度的微加工基底可实现对加载磁性纳米颗粒并使用钙指示剂染料标记的神经回路进行无线刺激19。此外，Tseng 等人使细胞内的纳米颗粒发生聚集，产生接近细胞张力的局部纳米颗粒介导的力20。这推动了特定微磁性基底图案的制备，有助于研究细胞对机械力的响应。通过在细胞内聚集纳米颗粒，实现了由局部纳米颗粒介导的力所引发的细胞张力20。Lee 等人开发了一种互补金属氧化物半导体（CMOS）-微流控混合系统，将微电磁阵列嵌入 CMOS 芯片中，以控制标记有磁性微珠的单个细胞的运动21。
Alon 等人利用微尺度、预编程的磁性垫作为磁性&#34;热点&#34;来定位细胞22。还可利用微图案化磁性阵列将纳米颗粒定位在特定的亚细胞位置，从而在细胞内刺激特定活性23。已有研究成功证明水蛭、大鼠和小鼠的原代神经元均可摄取磁性纳米颗粒（MNP）24,25,26。本文中，该方法应用于大鼠 PC12 嗜铬细胞瘤细胞系，此前已有报道称该细胞系对磁性纳米颗粒具有较高的摄取能力27。近年来，磁性纳米颗粒已在多种医学领域得到应用，包括癌症治疗中的药物递送和热疗28,29,30,31。具体而言，已有研究涉及磁性纳米颗粒与神经元网络的应用32,33,34,35。然而，利用磁性纳米颗粒在单细胞水平上对神经元进行磁性调控仍需进一步研究。
本研究介绍了一种自下而上的方法，通过预设计的平台调控神经元排列，以构建局部磁力。文中展示了铁磁多层膜微米级图案的制备过程。这种独特的铁磁多层结构可产生稳定的垂直磁化，从而对所有磁性图案产生有效的吸引力。通过孵育，将磁性纳米颗粒（MNPs）载入PC12细胞，使其转变为具有磁敏感性的单元。将载有磁性纳米颗粒的细胞接种于磁性平台上并诱导其分化，这些细胞优先附着于磁性图案区域，且神经突的生长方向与图案形状高度一致，形成取向性神经网络。本文还描述了多种表征铁磁多层膜和磁性纳米颗粒磁学性能的方法，以及细胞摄取磁性纳米颗粒和细胞活力检测的技术。此外，详细阐述了神经元生长的形态计量学参数及结果的统计学分析方法。

<table><tbody><tr><td>16% 多聚甲醛（甲醛）水溶液</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>FALCON</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>SPL life sciences</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B 溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-028-1B</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1514H 光刻胶</td><td>MicroChemicals GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 351 B 显影液</td><td>MicroChemicals GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Biological Industries</td><td>03-010-1B</td><td></td></tr><tr><td>细胞和组织培养瓶</td><td>Biofil</td><td>TCF002250</td><td>75.0 cm^2 250 mL 透气盖，未处理</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627-160</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>细胞增殖检测试剂盒（基于 XTT）</td><td>Biological Industries</td><td>20-300-1000</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Biofil</td><td>CFT021500</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Co80Fe20 at% 溅射靶材</td><td>ACI Alloys</td><td></td><td>99.95%</td></tr><tr><td>I 型胶原蛋白</td><td>Corning Inc.</td><td>354236</td><td>大鼠尾，浓度范围 3–4 mg/mL</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5</td></tr><tr><td>Cy2 标记的驴抗兔二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 氟封片剂</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>一次性针头</td><td>KDL</td><td></td><td>23 G</td></tr><tr><td>一次性&amp;nbsp;注射器</td><td>Medispo</td><td>1160227640</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>供体马血清</td><td>Biological Industries</td><td>04-124-1A</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 酶标仪</td><td>Merk Millipore</td><td></td><td>BioTek synergy 4 混合型微孔板读板仪</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>ROMICAL LTD</td><td>19-009102-80</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇（脱水乙醇）</td><td>Biolab-chemicals</td><td>52505</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>新鲜小鼠 &amp;beta;-NGF</td><td>Peprotech</td><td>450-34</td><td></td></tr><tr><td>GMW C 型框架电磁铁</td><td>Buckley systems LTD</td><td></td><td>3470, 45 mm</td></tr><tr><td>32% 盐酸</td><td>DAEJUNG CHEMICAL &amp;amp; METALS</td><td>4170-4100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院，贝塞斯达</td><td></td><td>NeuronJ 插件</td></tr><tr><td>电感耦合等离子体（ICP）</td><td>Ametek Spectro</td><td></td><td>SPECTRO ARCOS ICP-OES，FHX22 多视角等离子体</td></tr><tr><td>吉时利源表</td><td>Keithley</td><td></td><td>2400</td></tr><tr><td>吉时利开关系统</td><td>Keithley</td><td></td><td>3700</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>DMIL LED</td></tr><tr><td>无掩模光刻系统</td><td>Heidelberg Inst.</td><td></td><td>MLA150</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>BAR-NAOR</td><td>BN1042000C</td><td></td></tr><tr><td>70% 硝酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清（NDS）</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>hylabs</td><td>BP507/1LD</td><td></td></tr><tr><td>PC12 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Pd 溅射靶材</td><td>ACI Alloys</td><td></td><td>99.95%</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-制霉菌素溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue 细胞活力试剂</td><td>Molecular probes</td><td>A-13261</td><td>基于刃天青</td></tr><tr><td>兔抗 &amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>射频磁控溅射系统</td><td>Orion AJA Int.</td><td></td><td>Orion 8</td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>KUDOS</td><td>SK3210HP</td><td>频率：53 kHz；超声功率：135 W</td></tr><tr><td>SQUID 磁强计</td><td>Quantum Design, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>CHEM-IMPEX INTERNATIONAL</td><td>1279</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>XTT 细胞活力试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于互连神经元微尺度组装的磁性平台制备

Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons

将神经元引导形成有序神经网络的能力在再生医学、组织工程和生物界面领域具有重要意义。许多研究致力于利用化学和拓扑线索来引导神经元的生长。然而，在大范围内实现微米尺度组织控制的报道仍十分有限。本文介绍了一种有效的方法，通过嵌入微图案化磁性元件的磁性平台，以微米级分辨率将神经元定位在预设位点并引导其轴突发育。研究表明，通过将磁性纳米颗粒（MNPs）导入神经元，可使其转变为对磁场梯度敏感的磁性单元。基于该策略，研究人员制备了一种独特的磁性平台，并在平台上接种了常见的类神经元模型——PC12细胞，同时将其加载超顺磁性纳米颗粒。通过沉积具有稳定垂直磁化的铁磁性（FM）多层薄膜，为磁性图案提供有效的吸引力。这些加载了MNP的PC12细胞在磁性平台上贴附并分化后，优先附着于磁性图案区域，且其神经突的生长方向与图案形状高度一致，形成取向明确的神经网络。本文还提供了磁性特性、细胞对MNP的摄取、细胞活力以及结果统计分析的定量表征方法。该方法通过调控磁力实现了对神经网络形成的控制，并改善了神经元与电极之间的界面连接，有望成为体外神经网络研究的有效工具，并为新型治疗性生物界面提供新方向。

制备了具有不同几何形状的磁性平台（图1A）。通过溅射沉积磁性图案：共沉积14层Co80Fe20和Pd，厚度分别为0.2 nm和1 nm。电子显微镜显示磁性图案的总高度约为18 nm（图1B）。这种独特的铁磁多层结构沉积形成了相对于基底平面具有垂直磁各向异性（PMA）的稳定平台，可使负载磁性纳米颗粒（MNP）的细胞被整个磁性图案表面吸引，而不仅限于边缘区域22,37。通过磁输运测量对铁磁多层结构的参数进行了表征，为此制备了一个十字形的多层结构器件（图1C插图），并通过反常霍尔效应（AHE）测量垂直于基底方向的磁化强度，其中AHE电阻与垂直方向的磁化强度成正比38。AHE随磁场变化的测量结果呈...

本研究提出了一种自下而上的方法，通过工程化局部磁力来调控神经元的排列结构。将载有磁性纳米颗粒（MNPs）的类神经元细胞接种于具有垂直磁化的微图案化平台表面，并实现对其的操控。文中还描述了磁性表征、磁性纳米颗粒的细胞摄取、细胞活力检测以及统计学分析方法。

将神经元引导形成有序神经网络的能力，在再生医学、组织工程和生物界面领域具有重要意义。

我们的方法使得利用磁操控手段控制神经网络的形成成为可能。该技术是体外研究神经网络的有效工具，并为生物接口设备提供了新的治疗方向。通过该技术，我们能够在微米尺度上控制细胞的位置和生长，从而灵活设计磁性图案，进而调控网络的结构与组织。高效且无毒的磁性纳米颗粒灭菌剂至关重要。要实现这一目标，需要选择合适的磁性纳米颗粒。关键特性包括颗粒尺寸、包覆层以及饱和磁化值。演示实验操作的是本实验室的硕士研究生 Reut Plen 和 Dafna Levenberg。首先，使用划片笔将载玻片切割成 2 厘米 × 2 厘米的片状。随后，将载玻片在超声波清洗仪中分别用丙酮和异丙醇各清洗五分钟。然后用超高纯度氮气吹干。采用旋涂法在玻璃上涂覆光刻胶，转速为6,000 RPM，持续60秒，以获得1.5微米厚度，并在100摄氏度下烘烤60秒。使用光掩模或无掩模光刻技术，将样品暴露于光源下，以形成所需图案。根据制造商的说明，将样品在用去离子水稀释的显影液中显影40秒。然后在水中清洗45秒，并用超高压氮气干燥。在光学显微镜下检查图案。将样品插入沉积系统的负载锁室，并等待达到基础真空压力。将样品转移至主腔室，并将样品调整至适合沉积的合适高度。逐步提高每个靶材的功率，直至达到所需的沉积速率。开启旋转，然后通过依次打开和关闭靶材快门，交替使用钴、铁和钯靶材沉积铁磁多层膜。沉积14个钴铁钯双层结构，并以一层额外的钯盖层结束。沉积完成后，将样品从沉积系统中取出。将样品在丙酮中浸泡30分钟，并用异丙醇冲洗。然后用超高压氮气吹干，并在显微镜下观察。使用前将其保存在洁净干燥的环境中。使用带有十字形磁条的玻璃载玻片，磁条宽度为100微米，并沉积有铁磁多层膜。使用双面胶带将样品固定在样品台上。使用引线键合机将四根导线键合到样品上，每根导线连接十字电极的一个臂。将样品架和样品置于具有磁场的输运测量系统中，使磁场方向垂直于样品表面。按照文本稿件中的描述进行横向电压测量。扫描磁场，并测量横向电压随磁场的变化关系。绘制横向电阻随磁场变化的曲线，以确定反常霍尔信号，该信号与薄膜中的垂直磁化强度成正比。按照文本稿件中的描述，制备用于PC12细胞培养的基础生长培养基和分化培养基。在未处理的培养瓶中加入10毫升基础生长培养基培养细胞，每隔两到三天向培养瓶中添加10毫升培养基。八天后对细胞进行传代培养。进行细胞摄取实验时，在室温下以200 × g离心细胞悬液8分钟，然后弃去上清液。将细胞重悬于3 mL新鲜的基础生长培养基中。将细胞再次离心5分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于3毫升新鲜分化培养基中。使用注射器和针头将细胞吹打10次，以分散细胞团块，然后使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将一百万个细胞接种至一个常规未包被的35毫米培养皿中。向培养皿中加入计算好的磁性纳米颗粒（MNP）悬液和分化培养基体积，以达到所需的MNP浓度。将细胞、磁性纳米颗粒（MNPs）和分化培养基混合，然后将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育24小时。用70%乙醇清洗图案化基底，并将其放入生物安全柜中的35毫米培养皿内。将一块大磁铁置于图案化基底下方1分钟，然后通过将培养皿向上移开并取出磁铁，将其从生物安全柜中移除。打开紫外灯照射15分钟。为制备胶原包被的玻璃基底，将I型胶原以1:50的比例溶于30%乙醇中。用该溶液覆盖玻璃。将培养皿置于超净台中敞口放置四小时，直至所有溶液完全蒸发，然后用无菌 PBS 洗涤三次。从培养箱中取出细胞，将细胞悬液在 200 G 条件下离心五分钟，并弃去上清液。用一毫升新鲜分化培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。在35毫米培养皿的基质表面接种10⁵个细胞，并加入2毫升分化培养基。将培养物置于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。24小时后，向细胞中加入1:100稀释的新鲜小鼠β-NGF。每两天更换一次分化培养基，并添加新鲜的β-NGF。每隔两天使用光学显微镜对细胞进行成像，并在神经网络形成后对细胞进行免疫荧光染色。制备了具有不同几何形状的磁性平台，并通过成核法合成了荧光氧化铁磁性纳米颗粒（MNPs）。对磁性纳米颗粒（MNPs）的磁强计测量结果显示，其磁化曲线无滞后现象，饱和磁场较低，且磁化饱和值相对较高。将PC12细胞培养在含有氧化铁荧光磁性纳米颗粒的培养基中，使其转变为具有磁性的单元。这些磁性纳米颗粒被细胞胞体所内化，但未进入细胞核。细胞内的铁浓度随着培养基中磁性纳米颗粒（MNP）浓度的增加而升高。通过Shoal分析比较不同浓度MNP处理的PC12细胞的形态学参数，评估其细胞活力，结果显示与对照组细胞无差异。基于XTT和Resazurin的检测方法进一步证实，所评估的MNP浓度对细胞无明显细胞毒性。在磁性基底上培养并分化了经MNP处理与未经MNP处理的PC12细胞。发现经磁化处理的细胞能够附着于磁性图案，并沿图案方向生长出突起，而未经MNP处理的细胞则对磁性装置无趋向性生长。此处展示了细胞在具有六边形几何结构的基底上的定位情况。75% 负载 MNP 的细胞体与磁性条带接触，而仅有 35% 未磁化的细胞位于条带上。除了对细胞定位的影响外，这些磁性平台还被发现能够控制生长中神经突的方向性。为评估磁性对神经元生长方向性的影响，测量了神经突与磁性条带之间的夹角，结果显示其与磁性条带的取向存在显著相关性。该方法可轻松适用于引导活性化合物（如药物），只需将其与磁性纳米颗粒偶联即可。该技术可拓展至高通量药物筛选实验或组织内的局部治疗。这一创新方法为通过添加磁性吸引结构来功能化其他基底或装置开辟了新的可能性。目前，我们正在开发改进的生物相容性神经元芯片接口。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

为互连神经元微缩组织制造磁平台

在本视频中，我们演示了使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻的技术，该技术用于制备用于培养神经元的微流控装置。...

用于神经元胞体与轴突区室化培养的微流控装置的制备

我们开发了一种新型的多区室神经元共培养微系统平台，用于体外研究中枢神经系统中轴突与胶质细胞的相互作用。该平台能够并行开展多达六项独立实验，并采用新开发的宏/微混合制造方法加工而成。...

一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

本视频展示了神经元细胞通过内吞作用摄取荧光磁性纳米颗粒（MNPs）的过程。将负载MNPs的神经元培养在磁性图案化基底上，可实现细胞的附着。添加含有生长因子的培养基有助于神经元突起的生长，而基底的磁场则引导突起的取向。...

磁性纳米颗粒负载神经元在磁性平台上的生长与分化

本视频展示了在图案化多电极阵列（MEA）上培养神经元细胞以构建模块化神经元网络的过程。该方法可用于研究神经信号传递和细胞间相互作用。...

在多电极阵列上构建图案化神经元环路

本视频演示了一种利用时变磁场刺激生长在盖玻片上环形图案化区域的神经元培养物的方法。...

磁刺激模式化神经元培养物

本文描述了用于单神经元微流控阵列化以及芯片内生物材料涂层等离子体图案化水掩模技术的实验方案。利用极少的细胞输入即可制备高度互连的共培养体系。...

单细胞精度神经元共培养体系的制备

本文描述了一种培养 体外 由空间上受限、功能上相互连接的神经元回路组成的模块化网络。使用聚合物掩模在培养基底上构图蛋白层，以促进细胞在特定区域的黏附。接种的神经元在包被区域生长，形成自发连接并表现出电生理活性.

由功能互连回路构成的模块化神经网络的设计、表面处理、细胞接种与培养

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。...

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

本方案描述了使用塑料芯片培养和分隔原代小鼠神经元的方法。这些芯片为预组装设计，操作简便，且适用于高分辨率、活细胞及荧光成像。本方案详细说明了如何在这些芯片中接种大鼠海马神经元，并进行流体隔离、轴突切断和免疫染色操作。...

使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养

本方案旨在演示如何结合 体外...

将微流控技术与微电极阵列结合用于研究神经元通讯及轴突信号传导

在微米尺度上进行3D打印，能够快速制备用于神经元细胞培养的聚合物装置。作为原理验证，通过构建影响神经突生长的屏障和通道来限制神经元之间的结构连接，同时通过细胞外电生理记录观察此类操作的功能性后果。...

双光子聚合三维打印微尺度神经元细胞培养装置

了解利用磁性纳米颗粒和微图案平台控制神经元网络形成的方法。该技术可在微米尺度精确调控细胞位置与生长，为神经科学体外研究和生物接口设备治疗应用提供新工具。

用于互连神经元微尺度组装的磁性平台制备

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