用于互连神经元微尺度组装的磁性平台制备

我们的方法使得利用磁操控手段控制神经网络的形成成为可能。该技术是体外研究神经网络的有效工具，并为生物接口设备提供了新的治疗方向。通过该技术，我们能够在微米尺度上控制细胞的位置和生长，从而灵活设计磁性图案，进而调控网络的结构与组织。

高效且无毒的磁性纳米颗粒灭菌剂至关重要。要实现这一目标，需要选择合适的磁性纳米颗粒。关键特性包括颗粒尺寸、包覆层以及饱和磁化值。

演示实验操作的是本实验室的硕士研究生 Reut Plen 和 Dafna Levenberg。首先，使用划片笔将载玻片切割成 2 厘米 × 2 厘米的片状。随后，将载玻片在超声波清洗仪中分别用丙酮和异丙醇各清洗五分钟。

然后用超高纯度氮气吹干。采用旋涂法在玻璃上涂覆光刻胶，转速为6,000 RPM，持续60秒，以获得1.5微米厚度，并在100摄氏度下烘烤60秒。使用光掩模或无掩模光刻技术，将样品暴露于光源下，以形成所需图案。

根据制造商的说明，将样品在用去离子水稀释的显影液中显影40秒。然后在水中清洗45秒，并用超高压氮气干燥。在光学显微镜下检查图案。

将样品插入沉积系统的负载锁室，并等待达到基础真空压力。将样品转移至主腔室，并将样品调整至适合沉积的合适高度。逐步提高每个靶材的功率，直至达到所需的沉积速率。

开启旋转，然后通过依次打开和关闭靶材快门，交替使用钴、铁和钯靶材沉积铁磁多层膜。沉积14个钴铁钯双层结构，并以一层额外的钯盖层结束。沉积完成后，将样品从沉积系统中取出。

将样品在丙酮中浸泡30分钟，并用异丙醇冲洗。然后用超高压氮气吹干，并在显微镜下观察。使用前将其保存在洁净干燥的环境中。

使用带有十字形磁条的玻璃载玻片，磁条宽度为100微米，并沉积有铁磁多层膜。使用双面胶带将样品固定在样品台上。使用引线键合机将四根导线键合到样品上，每根导线连接十字电极的一个臂。

将样品架和样品置于具有磁场的输运测量系统中，使磁场方向垂直于样品表面。按照文本稿件中的描述进行横向电压测量。扫描磁场，并测量横向电压随磁场的变化关系。

绘制横向电阻随磁场变化的曲线，以确定反常霍尔信号，该信号与薄膜中的垂直磁化强度成正比。按照文本稿件中的描述，制备用于PC12细胞培养的基础生长培养基和分化培养基。在未处理的培养瓶中加入10毫升基础生长培养基培养细胞，每隔两到三天向培养瓶中添加10毫升培养基。

八天后对细胞进行传代培养。进行细胞摄取实验时，在室温下以200 × g离心细胞悬液8分钟，然后弃去上清液。将细胞重悬于3 mL新鲜的基础生长培养基中。

将细胞再次离心5分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于3毫升新鲜分化培养基中。使用注射器和针头将细胞吹打10次，以分散细胞团块，然后使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将一百万个细胞接种至一个常规未包被的35毫米培养皿中。向培养皿中加入计算好的磁性纳米颗粒（MNP）悬液和分化培养基体积，以达到所需的MNP浓度。

将细胞、磁性纳米颗粒（MNPs）和分化培养基混合，然后将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育24小时。用70%乙醇清洗图案化基底，并将其放入生物安全柜中的35毫米培养皿内。将一块大磁铁置于图案化基底下方1分钟，然后通过将培养皿向上移开并取出磁铁，将其从生物安全柜中移除。

打开紫外灯照射15分钟。为制备胶原包被的玻璃基底，将I型胶原以1:50的比例溶于30%乙醇中。用该溶液覆盖玻璃。

将培养皿置于超净台中敞口放置四小时，直至所有溶液完全蒸发，然后用无菌 PBS 洗涤三次。从培养箱中取出细胞，将细胞悬液在 200 G 条件下离心五分钟，并弃去上清液。用一毫升新鲜分化培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。

在35毫米培养皿的基质表面接种10⁵个细胞，并加入2毫升分化培养基。将培养物置于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。24小时后，向细胞中加入1:100稀释的新鲜小鼠β-NGF。

每两天更换一次分化培养基，并添加新鲜的β-NGF。每隔两天使用光学显微镜对细胞进行成像，并在神经网络形成后对细胞进行免疫荧光染色。制备了具有不同几何形状的磁性平台，并通过成核法合成了荧光氧化铁磁性纳米颗粒（MNPs）。

对磁性纳米颗粒（MNPs）的磁强计测量结果显示，其磁化曲线无滞后现象，饱和磁场较低，且磁化饱和值相对较高。将PC12细胞培养在含有氧化铁荧光磁性纳米颗粒的培养基中，使其转变为具有磁性的单元。这些磁性纳米颗粒被细胞胞体所内化，但未进入细胞核。

细胞内的铁浓度随着培养基中磁性纳米颗粒（MNP）浓度的增加而升高。通过Shoal分析比较不同浓度MNP处理的PC12细胞的形态学参数，评估其细胞活力，结果显示与对照组细胞无差异。基于XTT和Resazurin的检测方法进一步证实，所评估的MNP浓度对细胞无明显细胞毒性。

在磁性基底上培养并分化了经MNP处理与未经MNP处理的PC12细胞。发现经磁化处理的细胞能够附着于磁性图案，并沿图案方向生长出突起，而未经MNP处理的细胞则对磁性装置无趋向性生长。此处展示了细胞在具有六边形几何结构的基底上的定位情况。

75% 负载 MNP 的细胞体与磁性条带接触，而仅有 35% 未磁化的细胞位于条带上。除了对细胞定位的影响外，这些磁性平台还被发现能够控制生长中神经突的方向性。为评估磁性对神经元生长方向性的影响，测量了神经突与磁性条带之间的夹角，结果显示其与磁性条带的取向存在显著相关性。

该方法可轻松适用于引导活性化合物（如药物），只需将其与磁性纳米颗粒偶联即可。该技术可拓展至高通量药物筛选实验或组织内的局部治疗。这一创新方法为通过添加磁性吸引结构来功能化其他基底或装置开辟了新的可能性。

目前，我们正在开发改进的生物相容性神经元芯片接口。