使用从纤维细胞直接转换为神经元祖先细胞和分化为星形细胞的神经系统疾病体外建模

我们使用此协议从患者皮肤成纤维细胞中制造神经祖细胞，并研究神经和神经退行性疾病。我们认为，与经典的IPS技术相比，此协议有很多优点，包括速度，但在某些情况下，还会获得更严重的疾病表型。我们研究神经和神经退行性疾病，使用皮肤样本使我们能够真正评估患者的多样性。

我的实验室对星形细胞在疾病中的作用特别感兴趣，我们使用我们从NPC中产生的星形细胞来测试药物，也研究疾病机制，同时也研究与人类和小鼠神经元的共生。我们希望此协议将翔实，如果您有任何问题，请联系。谢谢。

使用可从细胞库或皮肤活检中获取的原发性人类皮肤成纤维细胞。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。在实验中使用之前，至少一到两个通道的通道细胞在解冻后。

细胞准备好后，在室温下在PBS中稀释1:200浓度的六井板，涂上人类纤维素的井，时间为15至20分钟。准备图一中所示的成纤维细胞介质。当细胞准备镀时，从盘子中取出纤维素，并立即添加细胞溶液或两毫升成纤维细胞介质。

在添加介质之前，不要让盘子变干。根据细胞生长的速度，在两口井中，有15万到20万块成纤维细胞，这些纤维细胞是人体纤维素涂层的六井板。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。

播种后的第二天，检查显微镜下的成纤维细胞，并验证细胞密度在70%至85%之间，用所有四个逆转录病毒载体:Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc。使用多种感染10为快速生长或15缓慢生长的成纤维细胞。每个向量的转导效率必须超过 70% 或更多正细胞。

将常规成纤维细胞介质添加到病毒混合物中，每口井的总容量为 1 密耳。将第二口井未经处理，将细胞返回组织培养孵化器，在一夜之间孵化。转导后的第二天，用 PBS 清洗细胞一次，并添加一密耳新鲜成纤维细胞介质。

在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。第二天，准备转换介质，如表一所示，用PBS清洗细胞一次，以摆脱残留的成纤维细胞介质，然后添加一密耳的转换介质。将未经处理的介质也更改为转换介质。

观察显微镜下的细胞，观察形态的变化。在整个转换过程中，应每天更换一到两密耳的转换介质和随后的 iNPC 文化。通过小心地从井中去除 70% 的介质来改变介质，同时确保细胞仍然覆盖在剩余的 30% 介质中。

继续观察细胞，每天用一到两密耳的转换介质改变介质。在转换介质中大约五到六天后，或当细胞变得非常密集时，通过它们一到二或最多一到三个。加热 Accutase，在六井板中涂上适量的油井，在室温下在 PBS 中稀释 1:200，总纤维素为 15 至 20 分钟。

使用PBS小心地清洗细胞，而不会分离任何细胞。使用井壁轻轻地将 PBS 涂抹在细胞上。小心地用移液器或吸气去除 PBS。

加入500微升吸管，在37摄氏度的组织培养孵化器中孵化2至3分钟。在显微镜下检查，以验证大多数细胞是否已经分离。如果细胞脱落，加入两毫升的新鲜转化介质，轻轻上下吹笛两到三次，以分离团块。

将细胞收集在15密耳管中，并加入3个密耳介质，以进一步稀释阿库塔塞。在室温下200G下离心机4分钟。从细胞颗粒中取出超纳特，用一百万的新鲜介质重新注入细胞。

轻轻上下吹笛两到三次，以解决细胞团。从涂层的六口井中取出纤维素，并立即向每口井添加一个 mil 新鲜介质。对于 1:2 的分割比，在一口井中加入 500 微升的细胞悬浮，在第二口井中添加其他 500 微升。

通过在东西南北方向轻轻摇动六口井并放入37度组织培养孵化器来分配细胞。第二天观察显微镜下的细胞，用一到两毫升改变介质。每天更换介质，直到细胞准备再次分裂。

准备 NPC 媒体包含 FGF 在增加浓度没有EGF或肝素，如表一所示。在这种新的分裂中，在转化介质中播种一口细胞，在NPC介质中播种另一口细胞。每天用一到两百万的 NPC 媒体不断更换 incpc 的媒体。

根据表一准备星体细胞介质。为了从新鲜的iNPC中制造星形细胞，在10厘米的纤维素涂层板中直接在10密耳的天体细胞介质中播种iNPC，以便第二天它们大约10%的汇合度。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。

电镀三天后用 10 密耳的星体细胞介质改变介质。保持细胞分化五到七天。要播种进行实验，请使用第 2 步到 2.6 中描述的胰蛋白酶或 Accutase 分裂星形细胞。

建议的播种密度包含在表二中。关于如何分份 iNPC 以生成诱导星形细胞的说明位于表三中。要从冷冻的 iNPC 库存中分离出星形细胞，请从液氮储存罐中取出部分储存文件，并在 37 摄氏度下快速解冻。

细胞解冻后，在含有5密耳星介质的1500万管中，一旦移液器细胞溶液。在200G室温下离心机4分钟。去除超自然物，并在一个密耳新鲜的星体细胞介质中重新喷出。

在纤维素涂层的10厘米盘中加入9密耳新鲜的星体细胞介质，并加入一个密耳细胞溶液，在南北东西运动中轻轻分配细胞。在 5% CO2 组织培养孵化器中培养 37 摄氏度的培养细胞。该协议允许使用含有山中因子的逆转录病毒，直接从人的皮肤成纤维细胞中快速、轻松地生成 iNPC。

这种方法允许绕过干细胞状态和克隆选择的需要，从而避免克隆变异。细胞在转换过程中需要记住的重要步骤是成纤维细胞播种密度、介质 pH 值以及保持细胞的最佳组合。在图一中可以找到转换过程中最佳汇流和形态变化的示例。

转换过程完成后，NPC 将显示强烈减少的表达或没有成纤维细胞标记和形态的表达，并表达 NPC 特定的细胞标记。此外，它们还可用于生成不同的细胞系，如诱导神经元、寡头细胞和星形细胞。根据我们的经验，诱导星核细胞尤其对药物和疾病机制测试非常有价值，因为它们可以在可重复大量可重复的纯种群中产生。

诱导的星形细胞可以通过在分裂过程中或先前冻结的 iNPC 部分时采取少量细胞的细胞，并在星形细胞介质中直接电镀来与 iNPC 区分开来。在这个过程中，重要的考虑因素是保持 iNPC 的初始播种密度低，因为高播种密度已证明阻碍分化过程，并更加注意介质 pH，因为酸化甚至可以激活健康的星形细胞。总之，直接转换协议是一种非常快速的方法，能够从患者皮肤样本中制造神经祖细胞。

这允许同时研究更多的细胞样本，并真正研究疾病背景的多样性。我们觉得这是一个非常强大的检测，你可以用来制造神经祖细胞，神经元，但也星形细胞，然后可用于共同培养或自己用于药物测试或机械研究。