Name: DNA晕片制备物的荧光原位杂交揭示整个染色体、端粒和基因位点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 了解DNA晕片制备物结合荧光原位杂交技术，用于高分辨率分析基因组与核骨架的相互作用。该方法可在单细胞水平区分附着与非附着的基因组结构，适用于癌症和早衰症细胞研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢 Michael Bittner 教授慷慨赠送染色体臂涂染探针。LG 得到了欧盟资助的 EURO-Laminopathies 项目和 Brunel 早衰症研究基金的支持。

<ol><li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+protein+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li>
<li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li>
<li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li>
<li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+chromatin%3A+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li>
<li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li>
<li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li>
<li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+mapping+by+fiber-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li>
<li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+combing%3A+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li>
<li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li>
<li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface%2C+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475(2017).</li>
<li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li>
<li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+integrity+testing%3A+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li>
<li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively%2C+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li>
<li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR%3A+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li>
<li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li>
<li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+Hidden+behind+a+%27Classic+Proliferation+Marker%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%2C+expressing+a+novel+SUN1+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li>
<li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li>
<li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li>
<li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMPdb%3A+Database+of+nuclear+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li>
<li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li>
<li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li>
<li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+glossary%3A+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li>
<li>Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Human+Interphase+Chromosomes%22">Human Interphase Chromosomes</a>. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).</li>
<li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在分析核骨架与基因组之间的相互作用时，DNA晕圈法是一种理想的选择方法，但有一些关键步骤必须严格遵守。其中最重要的参数之一是细胞接种密度的优化。如果细胞过度融合，DNA晕圈将与邻近细胞重叠，从而无法进行分析。CSK缓冲液和提取缓冲液必须在使用当天新鲜配制，并在提取缓冲液制备过程的最后阶段加入亚精胺、精胺和皂苷，以保持其生物活性。若进行Halo-FISH实验，必须特别注意DNA晕圈的变性温度，以确保探针或染料能够随后有效杂交。
电子显微镜已被用于观察核基质，并已鉴定出丝状结构20。然而，电子显微镜存在局限性，因为难以推断基质与染色质之间的关联。事实上，与电子显微镜相比，DNA晕环法更具多功能性，可检测特定基因、染色体以及细胞状态。此外，目前正对核基质蛋白进行蛋白质组学分析21,22。该方法适用于比较核基质组分，特别是在比较病变细胞时效果良好，但它无法提供标准DNA晕环技术所揭示的空间分布和连接信息。
DNA晕轮实验确实存在一些局限性。首先，由于需要提取细胞基质，该实验只能在固定细胞上进行，因此无法实现活细胞成像。尽管DNA晕轮实验本身操作相对快速简便，但若将细胞培养、探针制备、晕轮FISH（Halo-FISH）以及数据分析等整个流程综合考虑，整体过程可能较为耗时。
采用超分辨率显微镜对DNA晕和HALO-FISH进行成像，将显著提高DNA特异性探针和抗体的分辨率。此外，由于荧光染料在光谱上更容易被区分，有可能在单次实验中同时使用多种DNA探针，从而提供更丰富的信息。染色体构象捕获（3C）等分子生物学技术的进步已被用于确定基因位点间的相互作用，并分析细胞内染色质的空间组织结构。DNA晕实验与3C技术可结合使用，该联合方法称为M3C23，再次体现了DNA晕技术的可扩展性与适应性。
本文展示的原始数据旨在演示基因组行为研究的可能性以及如何呈现这些数据。通过这些数据，我们证明了可以利用以下方法确定基因组附着性的显著差异：（1）染色体涂染探针，在本研究中揭示染色体18是所分析染色体中附着性最低的（图3）；（2）基因位点，两个基因位点之间存在显著差异（图4）；（3）端粒，在静止细胞中其附着强度低于增殖细胞和衰老细胞（图5）。我们能够通过增殖标志物Ki67抗原的存在与否来区分增殖与非增殖细胞，该抗原为不溶性蛋白，因此保留在残余细胞核中；或者通过核苷酸掺入法标记在特定时间段内经历S期的细胞（图2）。该技术还使我们能够分析核骨架受损细胞（即层蛋白病细胞）中的基因组行为；在此以及Bikkul等（2018年）的研究中，我们发现与对照细胞相比，此类细胞的基因组附着性较弱，而在使用特定药物治疗后，可缓解经典HGPS细胞中lamin A突变的影响，从而恢复基因组附着性15。然而，本文首次报道了非典型HGPS AGO8466细胞的新数据：这类细胞缺乏lamin A突变，但含有异常形式的LINC复合物蛋白SUN119，其染色体13的附着性较弱（图6）。
HALO-FISH 是一种独特的方法，可通过结合间接免疫荧光技术研究基因组与核骨架的相互作用，从而检测在提取过程中未被去除的蛋白质。已有研究表明，核骨架在多种疾病（如某些癌症类型19）中发生改变，并且一些与核骨架相关的蛋白质作为诊断生物标志物具有重要意义24,25。因此，该技术在研究核骨架对疾病状态下染色质结构有序性或紊乱性的影响方面具有重要作用15,24,25,27，且不仅限于人类细胞；使用来自其他动物的染色体涂染探针，同样可采用相同的DNA晕环实验方案28。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

的 &#34;细胞核&#160;基质&#34; 1974年由Berezney和Coffey首次描述1在对大鼠肝细胞核进行高盐浓度提取及核酸酶处理后，他们鉴定出一种蛋白质性质的结构骨架。随后由此方法衍生出DNA晕环技术，该技术通过去除可溶性蛋白，仅保留核基质（NM）以及与核基质相关的蛋白和染色体。DNA附着区域位于DNA环的基部，被称为基质附着区（MARs）或支架附着区（SARs），这些区域分别对高盐浓度和离子型去垢剂锂-3,5-二碘水杨酸盐（LIS）的提取具有抗性。在DNA晕环结构中，与MARs/SARs相关的DNA被固定在残余的核结构内，而DNA环则从这些位点向外延伸，形成DNA晕环。目前我们已知，基因组通过与核纤层相连的结构域（LADs）锚定于核纤层，并通过核仁相关区域（NADs）以及可能的其他核结构（如特定的核体）实现锚定。
DNA晕轮法可用于DNA、基因和染色体区域的物理作图，因为延伸的DNA和染色质具有更高的分辨率，此时染色质已去除组蛋白，DNA被充分拉伸2,3,4,5,6。然而，将DNA晕轮用于此目的时也存在一些局限性。例如，与DNA晕轮中残留核结构紧密结合的DNA可能无法被探针接触，从而无法进行分析和物理作图6。其他技术如纤维荧光原位杂交（fiber-FISH）2,4,5,7和分子梳技术（molecular combing）8也可实现物理作图，且具有操作相对快速简便的优势。这两种方法在基因的DNA作图中均优先于DNA晕轮法。这些方法通过溶剂或盐提取从细胞核中分离染色质纤维，其中分子梳技术通常具有更好的可重复性8,9。
越来越多的证据表明，核骨架在支持关键的核内过程方面发挥着重要作用，例如DNA的附着位点、染色质重塑、DNA转录、DNA修复和DNA复制11,12。因此，人们开发了DNA晕轮技术，用于研究在这些细胞活动中核骨架与基因组之间的相互作用，并已在研究中被常规使用和报道。该技术还被用于研究基因组与核骨架之间的相互作用，特别是在疾病进展方面，已发现与恶性肿瘤相关的核结构改变11。
DNA晕轮技术还被用于研究发育和分化过程中基因组与核骨架之间的关系12。许多研究采用了一种称为halosperm的DNA晕轮技术变体13，若与FISH联用则称为SpermHalo-FISH14。精子染色质紧密地与被称为鱼精蛋白的蛋白质结合，该技术的开发旨在提高对精子DNA的可及性。halosperm已被用于评估精子DNA的完整性，并判断是否存在DNA损伤。DNA损伤较少的精子对应较大的DNA晕轮尺寸，而DNA断裂和损伤程度较高的精子则表现为晕轮较小或完全无晕轮。因此，halosperm可作为评估体外受精（IVF）中胚胎质量和妊娠成功潜力的预后标志物13。这一实例突显了该技术潜在的临床应用价值。在我们的研究中，我们采用HALO-FISH技术来分析早衰症（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS）中基因组行为的变化以及特定药物治疗的影响15。
这些研究及其他研究共同凸显了DNA晕轮技术可用于研究的过程和应用范围，以及该技术的实用性。

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10388739</td><td>用于形成DNA晕环</td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;prime;-脱氧尿苷&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>标记核苷酸</td></tr><tr><td>5-氟-2&amp;prime;-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>标记核苷酸</td></tr><tr><td>琼脂（技术级）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15562141</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A939-50G</td><td>检测DOP-PCR和缺口平移产物大小</td></tr><tr><td>非典型2型HGPS成纤维细胞（AG08466）</td><td>Coriell研究所</td><td>AG08466</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16269751</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>生物素-16-dUTP</td><td>Roche诊断&amp;nbsp;</td><td>11093711103</td><td>标记核苷酸</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>经典型Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）成纤维细胞（AG06297）&amp;nbsp;</td><td>Coriell研究所</td><td>AG0297</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>考普林瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12608596</td><td>可容纳5张或8张背靠背放置的载玻片</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15279011</td><td>在HALO FISH中阻断非特异性杂交</td></tr><tr><td>DEPC处理水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4030</td><td>杂交混合液组分</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>提取缓冲液组分</td></tr><tr><td>地高辛-11-dUTP&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11093088910</td><td>标记核苷酸</td></tr><tr><td>驴抗小鼠Cy3</td><td>Jackson实验室</td><td>715-165-150</td><td>二抗</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>提取缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td>提取缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443611</td><td>探针沉淀和HALO FISH</td></tr><tr><td>胎牛血清系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>细胞培养用血清</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10523525</td><td>DNA晕环的二维FISH</td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td>离心柱</td></tr><tr><td>鲱鱼精子DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7290</td><td>探针沉淀</td></tr><tr><td>HXP&amp;trade; 灯（金属卤化物显微镜灯）</td><td>OSRAM</td><td>HXP-R120W45C VIS</td><td>DNA晕环成像</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313680</td><td>清洗显微镜载玻片</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR试剂盒</td><td>KAPA生物系统</td><td>KK2103</td><td>PCR试剂盒</td></tr><tr><td>配备DFC365 FX相机和LAS AF（版本：4.5.0）图像采集软件的Leica DM4000荧光显微镜</td><td>Leica显微系统</td><td></td><td>DNA晕环成像</td></tr><tr><td>LB琼脂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13274843</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>CSK缓冲液组分</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10284580</td><td>清洗和灭菌显微镜载玻片</td></tr><tr><td>小鼠抗BrdU抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>B2531-100UL</td><td>BrdU可视化</td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16010159</td><td>细胞培养用血清及封闭试剂</td></tr><tr><td>缺口平移试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>PCR和BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>PCR引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1851</td><td>CSK缓冲液和提取缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>QuadriPERM&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 4 X 12</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6077.307</td><td>方形细胞培养皿，聚苯乙烯材质，含四个隔室。&amp;nbsp; 具有疏水表面，无菌、无热原/内毒素，且无细胞毒性。</td></tr><tr><td>兔抗Ki67抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1007-25UL</td><td>增殖标志物</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>橡胶胶水</td><td>Halford's</td><td>101836</td><td>DNA晕环的二维FISH</td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6022-25G</td><td>离心柱</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>探针沉淀</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>CSK、提取缓冲液和SSC缓冲液组分</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td>SSC缓冲液组分</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠&amp;nbsp;</td><td></td><td>L3771-100G</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>提取缓冲液组分</td></tr><tr><td>精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4264</td><td>提取缓冲液组分</td></tr><tr><td>链霉亲和素-Cy3&amp;nbsp;</td><td>Amersham生命科学有限公司，科学实验室用品</td><td>pa43001</td><td>探针抗体</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>CSK缓冲液组分</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>CSK缓冲液+A66:D68</td></tr><tr><td>SuperFrost&amp;trade; 显微镜载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12372098</td><td>显微镜载玻片：厚度1 mm，长度76 mm，宽度26 mm，未包被。</td></tr><tr><td>猪抗兔TRITC&amp;nbsp;</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TELO-PNA FISH试剂盒</td><td>Agilent Dako</td><td>K532511-8</td><td>端粒界定</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253-100G</td><td>柱缓冲液</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>CSK缓冲液组分</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10158962</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416- 100ML</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>含DAPI的Vectashield封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>DNA晕环的二维FISH</td></tr><tr><td>全人类染色体探针</td><td>Calbiochem</td><td></td><td>DNA晕环的二维FISH</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10108202</td><td>BAC克隆的DNA分离</td></tr></tbody></table>

利用dna晕圈制备物进行荧光原位杂交揭示整条染色体、端粒及基因位点

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

基因组与细胞核内的多种结构相关联，以调控其活性并将其锚定在特定位置。这些结构统称为核骨架，包括核纤层、核仁和核体。尽管目前已存在多种荧光原位杂交（FISH）技术用于研究基因组及其空间组织，但这些方法通常受限于分辨率，且难以充分揭示基因组与核内结构之间的关联信息。DNA晕圈法利用高盐浓度和非离子型去污剂处理，使基因组中锚定区域仍与核内结构相连，而其余DNA则形成伸展的环状结构。在此过程中，可溶性核蛋白（如组蛋白）、脂质以及未紧密结合于核基质的DNA被提取去除，从而形成围绕残余核的DNA晕圈。该残余核则保留了与核内结构紧密结合的DNA以及抗提取的蛋白质。这些延伸的DNA链可提高分辨率，并有助于物理图谱的构建。结合FISH技术后，该方法还能进一步研究基因组与所有锚定结构之间的相互作用。这种被称为HALO-FISH的技术具有高度灵活性，可将DNA晕圈与核酸探针联用，以显示基因位点、整条染色体、α卫星序列、端粒，甚至RNA。该技术为理解正常&#160;细胞及疾病进展（如癌症）中的核结构与功能提供了重要视角。

这种DNA晕圈制备方法有助于我们研究年轻细胞与衰老细胞之间基因组行为的差异，同时也可用于研究来源于早衰性疾病、具有异常核骨架蛋白的细胞。15. 图1 展示了DNA晕轮的示例，其中可观察到残余细胞核的边缘、残余细胞核内保留的DNA，以及延伸至周围区域形成DNA晕轮的游离DNA。图中还描绘了用于获取残余细胞核以及进行核边缘（NE）和细胞质延伸（CTE）测量的分析方法。可通过在S期细胞中掺入标记核苷酸（如BrdU），或使用增殖标志物抗pKi67抗体进行检测，以区分增殖与非增殖细胞；后者可显示G1期细胞中的核仁及异染色质区域。17,18. 在高血清条件下培养但未达到汇合状态且增殖标志物呈阴性的原代细胞，被认为处于衰老状态。在低血清条件下培养或已达到汇合状态（即接触抑制）且增殖标志物呈阴性的原代细胞，则被视为静息状态，在给予适当营养和条件的情况下能够重新进入增殖细胞周期。能够区分Ki67阳性与阴性细胞，使我们得以明确增殖中、静息态及衰老态人皮肤成纤维细胞之间的差异。 图2 显示了增殖性人皮肤成纤维细胞的DNA晕轮结构，这些细胞在DNA复制过程中掺入了BrdU，该机制不存在于非增殖细胞中，随后用抗BrdU抗体进行染色。同时可见增殖标志物抗-pKi67抗体的染色结果 图2。该抗原稳定性强，可耐受FISH实验流程，因此可在FISH后、封片前进行染色。因此，增殖细胞在左列显示BrdU和抗pKi67抗体阳性（红色），而非增殖细胞，尤其是衰老细胞在 图2 显示在右侧栏中。绿色信号是使用端粒PNA FISH/FITC试剂盒检测出的单个端粒。将免疫荧光与DNA晕轮技术相结合，可实现对不同细胞状态下的分析，如图所示。 图2 在研究增殖、静息和衰老细胞时。根据所选抗体的不同，还可检测其他条件，例如分化、通过辐照引起的DNA损伤等。
染色体区域也可通过FISH在DNA晕中进行可视化。由于制备过程中允许DNA从细胞核中解旋释放，染色体区域的形态可能受到干扰，其部分可能出现在DNA晕中，出现程度大小不一，这取决于基因组在残余细胞核及其结构内的锚定情况。 图3 显示了一组DNA晕轮图像，其中使用特异性的全染色体臂涂染探针（红色）揭示了染色体1、13、17和18的个体形态。抗-pKi67抗体（绿色）用于标记增殖细胞，而在同一培养物、同一载玻片上缺乏该标记的细胞则代表衰老细胞。从图像及以CTE/NE形式呈现的数据可以明显看出，基因贫乏的小型染色体18与残余细胞核结构的连接较少，其DNA晕轮从残余细胞核向外延伸更远，显著地比其他染色体更远离残余细胞核中心。然而，染色体1也表现出类似特征。通过增殖标志物抗-pKi67，可在同一培养物和同一载玻片上比较增殖细胞与衰老细胞，该分析显示，在这两种状态截然不同的细胞中，染色体与残余核结构的连接程度并无显著差异。
有趣的是，在经过DNA晕（DNA Halo）制备后，增殖细胞与衰老细胞之间在基因定位方面也显示出统计学上的显著差异，具体表现为基因在残余细胞核内或DNA晕中的分布情况。图4展示了用红色标记的BAC探针界定的基因位点（loci），以及绿色的抗Ki67染色结果。在DNA晕制备后，增殖细胞与衰老细胞之间的基因定位未见显著差异。然而，与几乎很少见的细胞周期蛋白D1 CNDD1 位点相比，连环蛋白α1 CTNNA1 位点在DNA晕中显著更多。图5展示了以绿色显示端粒的DNA晕制备结果。背景信号被有意保留较高，以便在DNA晕内可视化端粒信号。在本组数据中，包含了静止期细胞（即经血清饥饿处理7天的细胞），有趣的是，与增殖细胞和衰老细胞相比，静止期细胞中未连接且位于DNA晕内的端粒数量显著更多。在图5a中可以观察到DNA晕中端粒所占比例，尤其是“实验2”的图像。这与图5b相对应，其中静止期细胞中位于DNA晕内的端粒平均比例约为17%。有部分证据表明，并非衰老细胞中的所有端粒均可被观察到，因为其中一些可能非常短。
采用DNA晕轮法，我们已成功用于研究疾病细胞核内基因组相互作用的改变15。图6展示了原代对照成纤维细胞与典型（核纤层蛋白A突变）及非典型Hutchinson-Gilford早衰综合征疾病细胞在染色体锚定方面的差异，后者表达不同的SUN1异构体且无核纤层蛋白A突变19。与对照组DNA晕轮相比，染色体1和13在残留细胞核内的锚定位置显示出统计学上的显著差异。图6b将整个染色体区域的位置与残留细胞核及DNA晕轮进行关联。数值等于或小于1表示染色体位于残留细胞核内，而大于1的数值则表示染色体或其部分位于DNA晕轮中。
总体而言，这凸显了HALO-FISH在研究全染色体、特定基因和端粒在多种影响细胞周期（增殖、静息和衰老）或疾病细胞（如早衰症和癌细胞系）条件下的基因组相互作用方面的实用性。事实上，这些状态之间相互作用的差异表明，核骨架在调控细胞核内关键生物学过程中具有重要作用。
<img alt="DNA晕圈、残余细胞核；荧光显微图像显示核边缘（NE）、染色体区域边缘（CTE）光谱分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：人真皮成纤维细胞（HDF）提取的细胞核显示残余细胞核与DNA晕圈，以及分析方法概览。（a）通过DNA晕圈实验制备的人真皮成纤维细胞（HDF）细胞核，并用DAPI复染。染色较亮的残余细胞核显示DNA锚定在核骨架上，其周围为未附着的DNA，形成环绕的DNA晕圈结构。放大倍数 = ×100；比例尺 10 µm。（b）蓝色通道捕捉DAPI染色的细胞核及其周围DNA信号。使用ImageJ软件选取并去除残余细胞核。箭头表示从细胞核中心至残余核边缘（NE）的距离。（c）红色通道显示探针信号。（d）标注为“结果”的图像为红色通道与蓝色通道图像叠加后的结果，可用于测量从细胞核中心至最远端染色体区域边缘（CTE）的距离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞增殖与衰老分析；荧光显微镜，抗-BrdU，抗-pKi67染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：增殖性与衰老性人真皮成纤维细胞（HDFs）的DNA晕圈制备结合端粒PNA FISH分析。对经DNA晕圈实验处理的人真皮成纤维细胞（HDFs）进行端粒PNA FISH检测。端粒信号以绿色（FITC）显示，残留DNA与晕圈DNA用DAPI复染呈蓝色，增殖性细胞核则通过间接免疫荧光法使用抗-BrdU或抗-pKi67抗体在红色（TRITC）中检测。放大倍数 = ×100；比例尺 = 10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，染色体分析，pKi67染色，增殖，衰老柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3： 利用DNA晕环实验分析核骨架-染色体相互作用。（a）对经DNA晕环制备的人成纤维细胞（HDFs）进行针对染色体1、13、15、17和18的2D-FISH实验。整条染色体以红色（Cy3）标记，细胞核同时用pKi67探针检测以判断其处于增殖或衰老状态。增殖细胞（pKi67+）以绿色（FITC）勾勒轮廓，而衰老细胞（pKi67-）无绿色信号，保持未染色状态。放大倍数 = ×100；比例尺为10 µm。（b）在经历HALO-FISH处理的增殖期与衰老期HDFs中，核骨架对染色体的锚定情况。图中数据显示增殖（pKi67+）与衰老（pKi67-）细胞中染色体区域边缘（CTE）至相应核边缘（NE）的距离比值。误差线表示±标准误（SEM）。（c）pKi67+与pKi67-细胞核中特定染色体的染色体区域边缘（CTE）至相应核边缘（NE）的改良箱型图表示。Q1 = 下四分位数；Min = 记录的最小值；Med = 中位数；Max = 记录的最大值；Q3 = 上四分位数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="增殖细胞与衰老细胞DNA研究，显微图像，基因表达图表（CCND1, CTNNA1）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4： 使用HALO-FISH技术在HDF细胞中检测基因特异性相互作用。（a）通过基因特异性探针（CCND1 和 CTNNA1）对提取的DNA晕圈核进行杂交，以研究这些基因在增殖细胞和衰老细胞中与核基质（NM）的锚定情况。基因信号显示为红色（Cy3），抗-pKi67 标记增殖细胞，信号显示为绿色（FITC）。在增殖细胞的 CCND1 图像中，残留细胞核位于白色圆圈内，白色与绿色圆圈之间的区域代表DNA晕圈。放大倍数 = ×100；比例尺 10 µm。（b）比较残留细胞核与DNA晕圈之间的 CCND1 和 CTNNA1 基因特异性信号，以及增殖细胞与衰老细胞之间的信号差异。误差线表示 ± 标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞核的荧光显微镜图像、Ki-67 表达及增殖状态柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5： 利用端粒 PNA-FISH 探针检测静止期 HDF 细胞的 DNA 晕轮实验。（a）通过在低血清培养基中培养 7 天诱导 HDF 细胞进入静止状态。进行 DNA 晕轮实验，PNA-FISH 利用 FITC 信号（绿色）显示端粒，残余细胞核及周围的 DNA 晕轮用 DAPI 复染（蓝色）。同时使用抗-pKi67 抗体对细胞进行染色，以确认细胞核处于非增殖状态。该实验独立重复了两次。放大倍数 = ×100；比例尺 10 µm。（b）增殖期、衰老期和静止期 HDF 细胞中定位于 DNA 晕轮内的端粒平均百分比比较。误差线表示 ± 标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞成像与分析；DNA荧光显微镜图像（左），对比柱状图（右）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：利用HALO-FISH技术检测HGPS细胞中整条染色体与核骨架的锚定情况26。（a）对照组HDF（2DD）、经典型HGPS（AG06297）和非典型2型HGPS（AG08466）细胞核经过DNA晕圈制备后，使用针对染色体1、13、15和17的全染色体涂染探针进行2D-FISH。整条染色体以绿色（FITC）显示，DNA用DAPI复染呈蓝色。放大倍数 = ×100；比例尺为10 µm。（b）通过测量染色体区域边缘（CTE）平均值与细胞核边缘（NE）的比值，确定提取后细胞核内染色体的位置。比值大于1表明最远的CTE位于DNA晕圈内的相应NE之外，而比值小于1则表明最远的CTE位于残余细胞核内的NE之内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5XDOP-PCR缓冲液</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP混合液（不含dTTP）(2 mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP (2 mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物素-16-dUTP 或 地高辛-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOP引物 (20 μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA聚合酶 (1 U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR级水</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：显示DOP-PCR组分及单次反应体积的表格
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>循环次数</td>
			<td>温度（摄氏度）</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>引物退火</td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延伸</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终延伸</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冷却</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>保持</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：显示DOP-PCR循环、温度和时间程序的表格。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x NT缓冲液（0.5 M Tris-HCl pH 8，50 mM MgCl₂，0.5 mg/ml BSA）</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M β-巯基乙醇</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10倍核苷酸储备液（0.5 mM dATP，0.5 mM dCTP，0.5 mM dGTP，0.5 mM dTTP，0.5 mg/ml 生物素-16-dUTP）</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA聚合酶 I</td>
			<td>5U 每 μg DNA的</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA模板 (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC处理水</td>
			<td>为了 50 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：显示单个探针的切口平移组分及体积的表格。

将DNA晕圈制备与荧光原位杂交相结合，可实现对基因组与核骨架相互作用的高分辨率分析。与核骨架结合的基因组会使得杂交的荧光信号位于残留的提取细胞核内部，而未结合的基因组则位于环绕残留细胞核的DNA晕圈区域中。

利用DNA晕圈制备物进行荧光原位杂交揭示整条染色体、端粒及基因位点

基因组与细胞核内的多种结构相关联，以调控其活性并将其锚定在特定位置。这些……

该方案可用于评估与核骨架的连接，而无需使用DamID测序技术，且为单细胞检测方法。该方法的主要优势在于成本低廉且易于实施。该方法能够揭示基因与染色体之间可能存在的功能差异，而这些差异在其他可视化技术中通常难以显现。利用本实验方案，可评估经处理的癌细胞和早衰细胞中基因组的空间与功能组织，以及衰老细胞中基因组行为的差异。该方法可应用于生命周期中任何类型的细胞或组织，以及任何疾病状态下的样本，也可用于已有探针的模式生物。首先，配制 500 毫升 10% 盐酸，倒入一个大烧杯中。将显微镜载玻片逐片放入酸液中，在设定为 2 G 的摇床中室温孵育 1 小时。倒掉烧杯中的酸液，用自来水将载玻片清洗 10 次，再用去离子水额外清洗 10 次。将载玻片用甲醇冲洗两次，并将其保存在甲醇中直至灭菌。将载玻片倾斜置于纸巾上晾干，用铝箔包裹，随后在高压灭菌器或高温烘箱中进行灭菌。在37°C、5% CO₂条件下，于含血清的适当培养基中培养细胞，至少培养48小时，直至细胞融合度达到60%至70%。收获每种细胞类型，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。每张玻片接种1 × 10⁵个细胞，加入10 mL培养基。从培养箱中取出含有玻片及贴壁细胞的培养皿。弃去培养基，用铅笔标记载玻片。然后将载玻片放入含有 50 毫升冰冻细胞骨架缓冲液的考普林瓶中。将瓶子置于冰上或 4 °C 条件下孵育 15 分钟。弃去细胞骨架缓冲液，将载玻片浸入盛有50毫升1倍DNA晕环缓冲液的考普林瓶中，快速冲洗三次，每次冲洗约数秒。将载玻片转移至含有50毫升裂解缓冲液的考普林瓶中，室温孵育4分钟。随后依次将载玻片转移至含有50毫升10倍、5倍、2倍和1倍DNA晕环缓冲液的考普林瓶中，每种缓冲液中各孵育1分钟。完成后，将切片依次浸入10%、30%、70%和95%的乙醇系列溶液中。再将切片依次通过50毫升的70%、90%和100%乙醇系列溶液，每种浓度各5分钟。在加热板上空气干燥。然后在70°C的烘箱中加热5分钟。将载玻片置于70%甲酰胺、2×SSC溶液中，70°C下处理2分钟以进行变性。将变性后的载玻片放入50毫升冰冻的70%乙醇中，5分钟。然后将切片在室温下依次通过90%、95%和100%的乙醇系列溶液，每种浓度各5分钟。完成后，将切片置于加热板上自然晾干。将DNA探针置于金属浴或水浴中，在75摄氏度条件下变性10分钟。然后在37摄氏度下孵育30分钟，再用移液器将10微升样品加至相应的载玻片上。用21毫米×21毫米的盖玻片覆盖探针，并用橡胶胶水密封。将载玻片置于湿化的杂交孵育盒中，在37摄氏度下至少孵育18小时。孵育结束后，用镊子小心去除橡胶胶水。然后将载玻片放入50毫升预热至45摄氏度、pH为7的50%甲酰胺/2×SSC溶液中，重复孵育三次，每次5分钟。接着，将载玻片置于50毫升预热至60摄氏度的0.1×SSC溶液中，但将容器放入45摄氏度的水浴中。孵育5分钟，并更换缓冲液两次，每次孵育5分钟。将切片放入盛有50毫升4倍浓度SSC溶液的考普林瓶中，在室温下孵育15分钟，期间更换缓冲液三次。为防止非特异性抗体结合，向每张切片上加入100微升4% BSA的4倍浓度SSC溶液，并用一片石蜡膜覆盖。室温孵育10分钟。然后将切片与100微升链霉亲和素Cy3工作液（1:200稀释）在室温下孵育1小时，以检测标记的探针。将切片放入盛有50毫升4倍SSC溶液的Coplin染色缸中，在室温下孵育15分钟，期间更换缓冲液三次。用含有 DAPI 的封片液 20 微升封片，并覆盖 22 × 50 毫米的盖玻片。使用配备 100X 油镜的落射荧光显微镜观察 DNA 晕环和染色体区域。DNA 晕环制备技术可使残余细胞核的边缘、残余细胞核内保留的 DNA 以及延伸至周围区域的游离 DNA 清晰可见。通过含有BrdU的人类皮肤成纤维细胞制备了DNA晕轮，并用抗BrdU抗体进行染色。增殖期细胞对BrdU和抗pKi-67呈阳性反应。本方案用于在DNA晕轮中可视化染色体区域。使用针对1、13、17和18号染色体的特异性全染色体臂涂染探针标记单个染色体。采用抗pKi-67抗体标记增殖细胞，并在同一培养物中识别其缺失的细胞。此处展示的是端粒呈绿色的DNA晕圈制备图像。可以观察到DNA晕圈中端粒所占的比例，尤其是在实验二的图像中。静止期细胞中端粒的平均百分比约为17%。在原代对照成纤维细胞以及表达不同Sun1异构体且无Lamin A突变的典型与非典型早衰综合征患者的病变细胞中，检测到了染色体附着方式的差异。与对照DNA晕相比，染色体1和13在残余细胞核内的附着位置显示出统计学上的显著差异。整个染色体区域的位置与残余细胞核及DNA晕相关联。在实施该方案时，务必确保细胞以正确的密度接种，并在合适的时间进行提取。按照此方案，可进行间接免疫荧光和RNA FISH实验。

fluorescence-situ-hybridization-on-dna-halo-preparations-to-reveal

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

DNA晕片制备物的荧光原位杂交揭示整个染色体、端粒和基因位点

一种用于分析染色体复制时间的定量方法。该方法利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入与荧光 原位...

染色体复制时间分析与荧光原位杂交相结合

本文介绍了一种同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案，该方法结合免疫荧光、DNA荧光原位杂交（DNA FISH），并进行三维显微成像与分析（3D 免疫-DNA...

结合免疫荧光与DNA FISH技术对三维保存的间期细胞核进行分析以研究三维核结构的变化

荧光原位杂交（FISH）可在细胞内天然环境中检测核酸。本文介绍一种通过FISH同时联合检测RNA和DNA的实验方案，可用于研究小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活。...

联合DNA-RNA荧光检测 原位 杂交（FISH）技术研究分化后雌性小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活

此处，我们介绍一种进行荧光DNA的简单方法 原位 杂交（DNA...

一种用于压片染色体荧光DNA原位杂交的简易方法

我们报道了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的生殖腺和胚胎中进行荧光原位杂交（FISH）的简明实验流程，用于观察和定量重复序列。...

使用PNA探针通过荧光原位杂交（FISH）在秀丽隐杆线虫中对端粒和重复序列进行观察与定量

本文提供了一种详细的实验方法，用于制备X染色体臂探针，并通过荧光原位杂交（FISH）技术检测处于前中期和中期 I...

使用荧光原位杂交技术可视化果蝇卵母细胞中染色体臂的黏连缺陷 原位 利用荧光原位杂交（FISH）监测早前期I和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞

本方案介绍了一种通过化学诱导的蛋白质二聚化系统，在染色质上形成凝聚体的方法。...

化学诱导二聚化介导的端粒蛋白凝聚体

我们报告了一种DNA-FISH中期染色体铺展实验方案，可直观检测基因组内特定基因座的拷贝数及其位置。该方法能够以单细胞分辨率解析扩增状态，特别适用于含有染色体外DNA和均一染色区的癌细胞系。...

DNA-FISH 中期染色体铺展法用于区分人类癌细胞系中的染色体外DNA与均匀染色区

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。...

斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

了解DNA晕片制备物结合荧光原位杂交技术，用于高分辨率分析基因组与核骨架的相互作用。该方法可在单细胞水平区分附着与非附着的基因组结构，适用于癌症和早衰症细胞研究。

利用DNA晕圈制备物进行荧光原位杂交揭示整条染色体、端粒及基因位点

探索更多视频