酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体基因组表达产物的标记与可视化

线粒体是真核细胞中能够进行有氧呼吸的重要细胞器。其功能障碍是人类疾病的一个众所周知的成因。酿酒酵母的线粒体含有环状基因组，编码八种蛋白质。

在本视频中，我们描述了通过翻译产物的放射性标记及随后的凝胶电泳分离，来检测酵母线粒体中蛋白质生物合成的实验方案。该程序包括以下几个主要步骤：将酵母从冷冻保存的菌种划线接种至含有适当培养基的新鲜平板上。

将培养皿置于30摄氏度的培养箱中培养24至48小时。从新鲜划线平板中挑取菌落，接种于15毫升离心管中含2毫升培养基的液体培养基中，于30摄氏度、200 RPM振荡条件下过夜培养。在600纳米波长下测定该培养物的光密度。

取相当于0.2吸光度单位的体积，加入无菌管中，在室温下以9,000 G离心30秒，收集酵母细胞。弃去上清液。用0.5毫升无菌水重悬细胞，涡旋振荡5秒进行洗涤。

在室温下以 9,000 G 离心酵母细胞 30 秒。弃去上清液。将细胞重悬于 2 毫升新鲜的擦拭琼脂培养基中。

在200 RPM和30摄氏度条件下培养菌液，直至光密度值达到1.5至1.9。转移相当于一个光密度单位的菌液体积至微量离心管中。在3000 ×g条件下离心1分钟。

弃去上清液。加入0.5毫升无菌水，涡旋振荡5秒以洗涤细胞。在室温下以9,000 G离心30秒收集酵母细胞。弃去上清液。

将酵母细胞重悬于 0.5 毫升无菌翻译缓冲液中。将悬液置于 15 毫升离心管中。向细胞悬液中加入环己酰亚胺，使其终浓度达到 0.2 毫克/毫升，在 200 转/分钟、30 摄氏度条件下孵育 5 分钟，以抑制胞质翻译。

向细胞悬液中加入 25 至 30 微居里的 S35 蛋氨酸，于 200 RPM、30 摄氏度条件下孵育 30 分钟。加入未标记的冷蛋氨酸和放线菌素以终止标记反应，于 200 RPM、30 摄氏度条件下继续孵育 10 分钟。在 9,000 G 条件下离心 30 秒收集酵母细胞。

用0.5毫升无菌水重悬细胞，涡旋振荡5秒。在室温下以9,000 G离心30秒收集酵母细胞。弃去上清液。

向样品中加入 75 微升裂解缓冲液，涡旋振荡 5 到 10 秒。加入 500 微升 pH 6.8 的 0.5 摩尔 Tris 缓冲液。pH 值为 6.8。

短暂涡旋。向样品中加入600 µL甲醇。涡旋5秒。

向样品中加入150微升氯仿。涡旋振荡5秒。在12,000 G条件下离心2分钟。小心弃去上清液。

向样品中加入 600 µL 甲醇。通过反复倒置离心管数次，小心混匀。在 12,000 ×g 条件下离心样品 2 分钟。弃去上清液。

在80摄氏度下将凝胶板干燥两分钟。用60 µL Laemmli上样缓冲液溶解沉淀的蛋白质。在14摄氏度下加热样品10分钟。

制备17.5% Laemmli SDS聚丙烯酰胺凝胶。将每个样品15微升加入加样孔中。在低温室中电泳，直至蓝色染料迁移至凝胶长度的约65%处。

用考马斯亮蓝染色凝胶，并进行扫描或拍照，作为上样对照。将凝胶在凝胶干燥仪中干燥。将其与存储磷屏一起置于暗盒中，保存三至五天。

使用磷屏成像仪扫描凝胶。按照上述实验方案，我们鉴定了两种酿酒酵母菌株的线粒体翻译产物：野生型菌株以及编码线粒体翻译起始因子3的Aim23基因缺失突变株。

线粒体翻译产物已在变性聚丙烯酰胺凝胶中进行活性标记并分离。在达到饱和前，每2.5分钟收集一次样品，以构建时间进程。凝胶经染色、干燥后，进行5天曝光检测。

若实验成功，图中会显示八条与标准模式相对应的条带。然而，各条带的强度可能因菌株和实验条件的不同而存在显著差异。每一条带对应一种翻译产物。

数据表明，该突变株具有线粒体蛋白质合成能力，因为野生型中出现的所有产物在该突变株中均可见。然而，条带强度与野生型不同，说明Aim23的缺失影响了线粒体基因表达。Kumasi经蓝色染色后作为上样对照。

可使用 Image G 或 Image Quan 软件对实验数据进行定量分析，以鉴定不同菌株或实验条件之间的差异。具体方法是计算每种产物对应信号占总信号的比值。所有数据均基于至少三次独立重复实验，计算其平均值和标准偏差。

在去年的一项实验中研究了合成蛋白质的周转动力学。在用冷甲硫氨酸和硼霉素终止标记反应后，在指定的时间点收集样品。该对照对于评估产物的稳定性是必要的。

使用抗孔蛋白一抗体进行免疫染色是一种上样对照。我们描述了该方法，该方法常用于研究酵母线粒体中的蛋白质生物合成。本方案相对简单且操作快速。

同时，该方法能够获得有关四种酵母线粒体mRNA翻译速率的宝贵信息，具有显著优势。然而，该方法存在若干局限性，需要进一步开展额外实验，且受限于蛋白质和mRNA在不同状态下的水平差异。该方法可提供线粒体翻译系统中这些功能的相关信息，但需采用更先进的技术来揭示其作用机制。