贝克酵母糖精中线粒体基因组表达产品的标记和可视化
April 11th, 2021
贝克的酵母线粒体基因组编码了八种多肽。当前协议的目标是将所有这些都标记为单独的频段，然后将其可视化为单独的频段。
线粒体是能够有氧呼吸的真核细胞的基本细胞。他们的功能障碍是众所周知的人类疾病来源。贝克的酵母线粒体含有循环基因组编码八种蛋白质。
在这段视频中，我们描述了通过对转化产品进行放射性标记和随后通过凝胶电泳分离来检测酵母线粒体中蛋白质生物合成的协议。该程序包括几个主要步骤。新鲜盘子上冷冻库存培养物中的斯特雷克酵母， 具有适当的介质。
将盘子放在文化孵化器中30度，24至48小时。在 15 毫升管中的新鲜条纹中以两毫升的介质接种这些培养物，并在 30 度的 200 RPM 下一夜之间孵育它们。测量600纳米波长的培养物的光学密度。
在室温下，在 9，000 G 的无菌管调色板酵母细胞中，以相当于 0.2 吸附装置的体积为例，时间为 30 秒。丢弃此超自然。通过涡流5秒钟，用0.5毫升无菌水清洗细胞。
在室温下，9000 G的皮莱特酵母细胞可容纳30秒。丢弃超自然人。在两毫升的新鲜擦拭中稀释细胞。
孵化边缘在 200 RPM 和 30 度，直到光学密度达到 1.5 到 1.9 从 1.5 到 1.9 值。传输相当于微型离心机管中一个光学单元的培养体积。在 3000 G 下旋转管子一分钟。
丢弃超自然人。通过涡流5秒钟，用0.5毫升无菌水清洗细胞。在室温下，在9000G的帕莱特酵母细胞30秒内丢弃超母细胞。
在 0.5 毫升无菌转化缓冲中重新悬浮酵母细胞。将悬架置于 15 毫升管中。在细胞悬浮中加入环氧酰胺，最终浓度为每毫升0.2毫克孵化，在200 RPM和30度下进行5分钟边缘，以抑制细胞溶解。
从 25 到 30 添加 S35 甲氨酸 S35 甲氨酸的 25 到 30 微库到细胞悬浮和孵育 30 分钟边缘在 200 RPM 和 30 度。添加无标签的冷甲基氨酸和博里霉素，停止标签孵化10分钟边缘采取在200 RPM和30度。通过离心收集酵母细胞，在9000G下30秒。
通过涡流5秒钟，用0.5毫升无菌水清洗细胞。在室温下，9000 G的皮莱特酵母细胞可容纳30秒。丢弃超自然人。
在调色板和漩涡中加入 75 微升裂解缓冲器，时间为 5 到 10 秒。添加 500 微升 0.5 摩尔三轮缓冲区 0.5 摩尔三轮缓冲与 pH 6.8。pH 6.8.
漩涡短暂。在样品中加入600微升甲醇。漩涡五秒钟。
在样品中加入150微升氯仿。漩涡五秒钟。在 12，000 G.小心地用取样器丢弃 opaface 时，将样品离心两分钟。
在样品中加入600微升甲醇。通过多次倒置管子小心混合。离心机样品两分钟，在12，000 G.丢弃超自然。
空气在80度下将调色板干燥两分钟。溶解60微升莱姆利样品缓冲器中的沉淀蛋白。在 14 度下加热样品 10 分钟。
导致17.5%莱姆利SDS多丙烯酰胺凝胶。将每个样品的 15 微升装入口袋。在冷室中运行凝胶，直到蓝色染料达到凝胶淋巴的约 65%。
用 Kumasi 亮蓝色染色凝胶，并进行扫描或拍照，这需要作为负载控制。干燥凝胶干燥机中的凝胶。将其与存储磷屏幕一起保存在盒式磁带中三到五天。
在磷成像仪上扫描屏幕。按照上述协议，我们从两个糖精脑菌株中分配线粒体翻译产品。Aim23基因编码线粒体翻译启动因子三的野生类型和突变变种删除。
线粒体翻译产品已经在变性聚丙烯酰胺凝胶中积极标记和分离。样本在饱和前每两分半钟收集一次，以建立时间过程。凝胶在为期五天的展览后被染色、干燥和筛选。
在成功的实验中，图片演示了根据标准模式分配的八个波段。然而，根据应变和实验条件，单个频段的强变程度可能变化很大。每个波段对应于一个翻译产品。
数据表明，突变菌株能够线粒体蛋白合成，因为所有出现在野生类型的产品都可见于这种突变体中。然而，波段的特性不同于野生类型，这意味着Aim23的删除会影响线粒体基因表达。库马西酿造的蓝色污渍，并作为负载控制。
它们的数据结果可以量化，使用图像 G 或图像泉软件识别菌株或实验条件之间的差异。对于这些，与每个产品对应的信号比率与总信号进行计算。平均值和标准偏差至少在三个独立实验中计算。
在去年的实验中，对合成蛋白的动能进行了研究。样品在标签反应被冷甲氨酸和博里霉素停止后，在指示的时间点采集。这种控制对于估计产品的稳定性是必要的。
免疫染色与抗波林一个抗体是一个加载控制。我们描述了这种方法，它经常用于研究酵母线粒体中的蛋白质生物合成。此协议相对简单且操作速度较快。
同时，它允许获得关于四个酵母线粒体mRNA的转化率的宝贵信息，这是非常有利的。然而，它有几个限制，需要额外的实验，并在于这种州际水平的蛋白质和mRNA。它可以在线粒体翻译系统中提供有关这些功能的信息，但应使用更先进的技术来发现该机制。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概览
本文描述了一种用于标记和可视化面包酵母线粒体基因组编码的八个多肽的协议。该方法涉及翻译产物的放射性标记，然后进行凝胶电泳。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 线粒体对于真核细胞的有氧呼吸至关重要。
- 线粒体功能障碍与各种人类疾病有关。
- 面包酵母具有环状的线粒体基因组。
- 该基因组编码八种必需蛋白质。
研究目的
- 标记酵母线粒体基因组编码的所有多肽。
- 将这些多肽可视化为独立的条带。
- 增强对线粒体蛋白质生物合成的理解。
使用的方法
- 翻译产物的放射性标记。
- 使用凝胶电泳分离标记蛋白质。
- 将冷冻酵母菌株涂抹到新鲜培养板上。
- 使用适当的培养基进行酵母生长。
主要结果
- 成功标记所有八个线粒体多肽。
- 在凝胶上将多肽可视化为独立条带。
- 展示该协议在蛋白质生物合成测定中的有效性。
- 对线粒体功能和蛋白质合成的洞察。
结论
- 该协议有效地标记和可视化线粒体蛋白质。
- 该方法可应用于进一步研究线粒体功能。
- 理解这些过程对于解决线粒体疾病至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative labeling and visualization of mitochondrial translation products in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of mitochondrial gene expression and protein biosynthesis. This capability is critical for mechanistic de-risking in early discovery, particularly when evaluating the impact of genetic perturbations on organellar function. The method supports portfolio decisions by providing robust, comparative data on mitochondrial translation across wild-type and mutant strains.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mitochondrial translation rates for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic modifications on mitochondrial protein synthesis.
- Facilitates comparative analysis between wild-type and mutant strains to clarify pathway dependencies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for isolating and quantifying mitochondrial translation products.
- Delivers reproducible, quantitative banding patterns for assay standardization and downstream screening.
- Enables reliable detection of biosynthetic defects for compound or genetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial translation outputs with disease-relevant models when mitochondrial dysfunction is implicated.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling quantitative assessment of mitochondrial gene expression.
- Provides mechanistic insight into translation defects relevant to mitochondrial pathobiology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, where mitochondrial function is a key readout.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying translation of mitochondrial-encoded proteins under different genetic backgrounds.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for comparing biosynthetic rates across conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of band intensities to compare translation efficiency and stability.
- Translational Research: Connects mitochondrial translation data to disease-relevant phenotypes in yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial translation analysis across multiple genetic or pharmacological interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for mitochondrial translation analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, comparative data on mitochondrial biosynthesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on mitochondrial translation outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, radiolabeling, and protein electrophoresis.
- Needs access to phosphorimaging and quantitative gel analysis infrastructure.
- Demands rigorous controls and replication to ensure data reliability and cross-team comparability.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for translation specificity.
- Interpretation of translation rates must consider additional experiments for mechanistic conclusions.
