Name: 一种可重复的重症监护病房导向内毒素模型在大鼠中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学习一种可重复的大鼠内毒素血症模型，用于重症监护导向的脓毒症研究。该模型支持连续生理监测和多次采样，有助于减少实验动物数量并提高研究数据的可靠性。

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作者谨此感谢 Beatrice Beck-Schimmer（医学博士）和 Erik Schadde（医学博士）对本文的审阅以及所做出的宝贵贡献。

本方案中所述的所有实验均获得瑞士苏黎世州兽医管理局的批准（批准编号：134/2014 和 ZH088/19）。此外，本实验中进行的所有操作均遵循瑞士医学科学学会（SAMS）发布的《动物实验指南》以及欧洲实验动物科学联合会（FELASA）的指导原则。
1. 麻醉诱导与动物监测
<ol>
	<li>将体重为250–300克（g）的雄性Wistar大鼠饲养于通风良好的笼具中，维持无病原体环境。保持12小时光照/12小时黑暗的循环，环境温度为22 ± 1 °C，并自由供应食物和饮水。</li>
	<li>通过异氟烷挥发诱导（在麻醉诱导箱中浓度为3–5%）30秒（图1A）进行全身麻醉；或 alternatively，通过单次注射氯胺酮/赛拉嗪（每100 g体重10/1毫克（mg））诱导麻醉。</li>
	<li>将动物转移至操作台，并在整个实验过程中将其置于加热垫上。维持体温在36.5至37 °C之间。</li>
	<li>使用鼻导管提供氧气（600 mL/分钟）。若选择挥发性麻醉维持麻醉状态，则加入2–3%异氟烷。确保动物自主呼吸。</li>
	<li>在实施气管切开术以及动脉和静脉导管置入前，通过脚趾夹捏反射消失&#160;来确认麻醉深度。</li>
	<li>通过外周血氧饱和度监测验证充分的氧合状态（正常血氧饱和度为98–100%）。</li>
	<li>使用眼膏（维生素A眼膏）保护眼睛。</li>
	<li>在侧边操作台上准备无菌外科器械和导管，如图1B所示。</li>
	<li>此外，准备压力和血氧饱和度监测装置，如图1C所示。</li>
</ol>
2. 静脉通路
<ol>
	<li>在大鼠尾部近端绑扎止血带，以方便静脉穿刺（图2A）。</li>
	<li>用酒精对尾部消毒3次。</li>
	<li>将G26静脉导管插入两条侧尾静脉之一。 
	注意：根据我们的经验，在大鼠尾部远端放置静脉通路更为容易，因为此处静脉更靠近皮肤表面。此外，若穿刺失败，仍有足够空间向近端移动进行再次尝试。</li>
	<li>严格避免注入空气。</li>
	<li>放置静脉导管后，松开止血带。</li>
	<li>用胶带固定静脉导管位置（图2B）。</li>
	<li>将注射泵连接至静脉通路，用于持续输注液体和药物。</li>
	<li>使用三通阀进行推注给液、给药以及静脉采血。</li>
</ol>
3. 气管切开术
<ol>
	<li>剃除动物颈部前侧的毛发。</li>
	<li>用聚维酮碘溶液对剃毛后的皮肤消毒3次。</li>
	<li>使用手术刀（10号刀片）进行约2厘米的纵向切口。</li>
	<li>用2-0丝线缝合牵开皮肤。</li>
	<li>用手术剪钝性分离喉部和气管（图 3A).</li>
	<li>务必使用显微外科剪刀切开气管&#160;3-5 处的剪刀th 气管夹</li>
	<li>插入无菌气管插管至气管内。注意避免插入过深，以防发生单侧通气。</li>
	<li>使用2-0丝线缝合固定套管。</li>
	<li>将套管连接至呼吸机，进行压力或容量控制通气（图3B).</li>
</ol>
4. 动脉通路
<ol>
	<li>用聚维酮碘溶液对大鼠尾巴进行三次消毒。</li>
	<li>使用手术刀（10号刀片）在腹侧纵向切开皮肤，长度约1厘米。</li>
	<li>操作时需小心，避免切得过深，以防损伤尾动脉。</li>
	<li>使用手术显微镜仔细暴露动脉，并用显微外科剪剪开动脉周围的筋膜。</li>
	<li>用6-0丝线结扎动脉的远端部分。</li>
	<li>预先准备好近端的6-0丝线，但暂不收紧（图4A）。</li>
	<li>将G-26导管插入远端和近端丝线之间的动脉内。</li>
	<li>导管进入动脉后，收紧近端丝线并固定导管位置（图4B）。</li>
	<li>将导管连接至压力传感器，以实现持续的动脉压监测（正常平均动脉压：60 - 100 mmHg）（图4C）。</li>
	<li>此外，在连接压力传感器的导管与G-26导管之间安装一个三通旋塞阀，用于动脉采血。</li>
</ol>
5. 基线测量、脓毒症诱导及随访测量
<ol>
	<li>当动物达到稳态后，注射脂多糖（LPS）。</li>
	<li>在达到稳态时采集血样（通常在15–30分钟后）。</li>
	<li>以1:4的比例用林格氏液补充因采血造成的液体丢失。</li>
	<li>为诱导脓毒症，可将脂多糖（LPS）作为推注给药或持续输注应用。</li>
	<li>对于推注给药，将1 mg/kg体重（kg）的脂多糖（LPS）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为1 mg/mL，进行注射。</li>
	<li>对于持续输注，使用注射泵在整个实验过程中以300 µg/kg/小时的速度输注脂多糖（LPS）（LPS储备液：1 mg/mL溶于PBS中）。</li>
	<li>务必始终避免空气注射，以防发生空气栓塞。</li>
	<li>在开始实验前，应预先确定液体补充方案、血管收缩剂应用方案以及实验终止标准（例如，尽管进行了液体补充，平均动脉压仍持续低于50 mmHg超过30分钟即定义为低血压）。 
	注意：我们建议以10 mL/kg/小时的速度持续输注林格氏液。</li>
	<li>从输注总量中扣除任何持续给予的液体量（例如用于持续LPS输注的液体），以确保与对照组的结果具有可比性。 
	注意：在实验结束时，若需采集肝脏、肾脏或脾脏等器官进行组织学或生化分析，可通过切开下腔静脉的方式处死动物。如果需要评估器官中的炎症标志物，建议在切开下腔静脉前先使动物达到外科麻醉深度，并向左心室注射冰冻生理盐水，作为推荐的安乐死方法。务必遵守相关法律法规和本地指导原则。为验证脓毒症相关的器官功能障碍，可分析促凋亡标志物如caspase-3，以及α1-微球蛋白以确认肾脏小管损伤。对CINC-1、MCP-1和IL-6等标志物进行器官特异性分析&#160;也可提供有关器官特异性炎症反应的信息。</li>
</ol>

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</ol>

作者们对本研究所述内容无任何利益冲突。Martin Schläpfer 已提交一项专利，旨在减轻患者因使用医用气体（特别是氧气（O2）和二氧化碳（CO2））而产生的手术和/或麻醉的负面影响。他曾获得来自瑞典 Sedana Medical 和瑞士 Roche 公司的非限制性研究资助，但这些资助与本研究无关。

本文所述方案可建立一种高度可重复且易于掌握的脓毒症模型，并可根据具体研究问题进行调整。实验过程中可连续采集与器官功能相关的关键体内数据，如心率、血压和外周动脉血氧饱和度，同时可多次进行血液采样。此外，还可根据需要调整液体复苏方案和血管加压支持措施。由于动物血流动力学状态稳定，实验可持续数小时，如先前报道所述8。
必须指出，为了回答特定的研究问题，应选择合适的脓毒症模型10,11。所有脓毒症模型均有其优势，但也存在局限性。本文介绍了一种内毒素血症模型，可诱导强烈但无菌的炎症反应。该模型具备脓毒症的关键特征，例如强烈的炎症反应12、内皮功能障碍与损伤13以及多器官衰竭14。因此，本研究所采用的模型符合&#34;脓毒症临床前研究国际专家共识&#34;此前发布的动物脓毒症模型定义<su...

脓毒症及其更严重的形态——脓毒性休克，是由感染引发的综合征，可导致过度的炎症反应，伴随细胞因子释放，引起生理和生化改变，造成免疫防御功能受抑，并产生致命后果1,2。这种失衡的炎症反应会导致肺、肾、肝等多个重要器官的功能障碍甚至器官衰竭。脓毒症是患者入住重症监护病房（ICU）最常见的原因之一，占比达37%3。目前，脓毒症的死亡率约为20-30%4。早期且有效的抗生素治疗至关重要5。液体复苏和血管加压药的使用需尽早实施，除此之外，治疗均为支持性措施6。
脓毒症定义为存在明确或疑似由细菌、真菌、病毒或寄生虫引起的感染，并伴有器官功能障碍。当患者出现对单纯液体治疗无反应的进一步心血管衰竭，且乳酸水平超过2毫摩尔/升时，即符合脓毒性休克的标准2。与脓毒症相关的器官衰竭可发生在任何器官，但在心血管系统、脑、肾、肝和肺中尤为常见。大多数脓毒症患者需要进行气管插管，以确保气道通畅、防止误吸，并通过高吸氧浓度实施呼气末正压通气，从而预防或纠正低氧血症。为了耐受气管导管和机械通气，患者通常需要接受镇静治疗。
内毒素（如革兰氏阴性菌细胞膜组分脂多糖（LPS））可通过Toll样受体4（TLR4）7引发强烈的炎症反应。特定信号通路的激活可确保炎症反应的稳定。细胞因子如细胞因子诱导的中性粒细胞趋化蛋白1（CINC-1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和白细胞介素6（IL-6）在此模型中被公认为评估疾病严重程度和预后的预测因子8。静脉注射LPS已成功用于研究大鼠脓毒症的多个方面8,9。
脓毒症的治疗仍然是一个挑战，尤其是由于缺乏可预测的动物模型。内毒素血症是否能够通过激活全身性炎症反应，成为药物治疗研究的合适模型，目前尚存争议。然而，通过众所周知的LPS诱导的TLR4通路，仍可获得重要的科学认识。

<table><tbody><tr><td>2-0 丝线缝合线</td><td>Ethicon, Sommerville, NJ</td><td>K833</td><td>标准外科手术器械</td></tr><tr><td>26 号静脉导管</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>391349</td><td>标准麻醉设备</td></tr><tr><td>6-0 LOOK 黑色编织丝线</td><td>Surgical Specialties Corporation, Wyomissing, PA</td><td>SP114</td><td>标准外科手术器械</td></tr><tr><td>Alaris 注射泵</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（Betadine）</td><td>Mundipharma, Basel, 瑞士</td><td>7.68034E+12</td><td>GTIN 编号</td></tr><tr><td>带弧度精细尖头显微镊</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL</td><td>504513</td><td>便于血管准备</td></tr><tr><td>精细尖头显微镊</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL</td><td>501976</td><td>尖端需定期抛光</td></tr><tr><td>Infinity Delta XL 麻醉监护仪</td><td>Draeger, L&amp;uuml;beck, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，250 mL 瓶装</td><td>Attane, Piramal, Mumbai, 印度</td><td>LDNI 22098</td><td>标准兽医设备</td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketalar）</td><td>Pfizer, 纽约, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; 血清型 055:B5 的脂多糖（LPS）</td><td>Sigma, Buchs, 瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小号棉签</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, 德国</td><td>EH11.1</td><td>标准外科手术器械</td></tr><tr><td>林格氏液（Ringerfundin）</td><td>B. Braun, Melsungen, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tec-3 异氟烷蒸发器</td><td>Ohmeda, GE-Healthcare, 芝加哥, IL</td><td>已不再供应</td><td>标准兽医设备</td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylazin Streuli）</td><td>Streuli AG, Uznach, 瑞士</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种可重复的面向重症监护病房的大鼠内毒素模型

A Reproducible Intensive Care Unit-Oriented Endotoxin Model in Rats

脓毒症和脓毒性休克仍然是重症监护病房死亡的首要原因。尽管脓毒症管理已取得显著进展，但病死率仍介于20%至30%之间。迫切需要新的治疗方法以减少脓毒症相关的多器官功能衰竭和死亡。可靠的动物模型可用于一种或多种治疗方案，并可检测其对生理和分子参数的影响。本文介绍了一种简单的动物模型。
首先，通过使用挥发性麻醉剂或腹腔注射麻醉剂对动物实施全身麻醉。放置静脉导管（尾静脉）、进行气管切开术以及插入动脉导管（尾动脉）后，开始机械通气。记录平均动脉血压、动脉血氧饱和度和心率的基线值。
将脂多糖（1 毫克/千克体重）溶解于磷酸盐缓冲液中注射，可通过Toll样受体4诱导强烈且可重复的炎症反应。液体纠正以及去甲肾上腺素的应用均依据已建立完善的方案进行。
本文介绍的动物模型易于掌握，且高度贴近重症监护病房中临床脓毒症治疗的实际情境，包括镇静、机械通气、持续血压监测以及重复采血等操作。此外，该模型具有良好的可靠性，能够在符合动物研究“3R”原则（减少、替代、优化）的前提下，使用较少数量的动物获得可重复的实验数据。尽管脓毒症研究中的动物实验尚难以完全替代，但通过重复测量可减少所需动物数量，同时使脓毒症动物在麻醉状态下维持实验过程，从而减轻其痛苦。

如先前报道所述9，本系统可在血流动力学稳定的动物中建立内毒素血症模型。尽管给予脂多糖（LPS）刺激与未给予LPS刺激的动物其平均动脉压均保持稳定，但LPS处理的动物表现出脓毒症的特征，例如出现负碱剩余以及通过血浆细胞因子（给药后6小时测定）反映的强烈炎症反应，如CINC-1（867 ng/mL）、MCP-1（5027 ng/mL）和IL-6（867 ng/mL）8，图5。
<img alt="用于生理监测和手术准备的监护仪与外科器械的医疗装置示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62024/62024fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：设备准备...

本文介绍了一种可重复的大鼠重症监护病房导向型内毒素模型。

脓毒症和脓毒性休克仍然是重症监护病房患者死亡的主要原因。尽管脓毒症管理已取得显著进展，但死亡率仍然……

该方案是一种稳定且可重复的内毒素血症模型，可对生理学和分子参数进行多次评估。该方法有助于回答脓毒症研究中的相关问题。尽管我们的模型不能替代动物实验，但通过持续镇静优化了脓毒症模型，并通过重复取样减少了动物使用数量。初学者可能在动脉和静脉导管插入过程中遇到困难，但只需有限的训练即可掌握这些技术。通过可视化整个实验装置，研究人员能够更顺利地搭建或调整模型，以更贴近重症监护室（ICU）中的实际情况。首先将麻醉后的动物转移至加热垫上。将体温维持在36.5至37摄氏度之间。通过鼻罩提供氧气，确保动物自主呼吸。在进行气管造口术以及动脉和静脉插管前，通过检查脚趾夹捏反射是否消失来确认麻醉深度。使用眼膏保护眼睛。准备无菌手术器械和导管，并进行压力和血氧饱和度监测，以确保充分氧合。在大鼠尾部近端使用止血带以方便静脉穿刺，并用酒精对尾部消毒三次。将26号静脉导管插入两条侧尾静脉之一，避免注入空气。放置静脉导管后松开止血带，并用胶带固定导管位置。将注射泵通过三通旋塞连接至静脉通路，用于持续输注液体和药物。开始气管切开术时，先剃除动物颈部前侧区域的毛发，然后用聚维酮碘溶液对剃毛后的皮肤消毒三次。使用10号手术刀片做一道2厘米长的纵向切口。用2-0丝线缝合线牵开皮肤。然后用手术剪 bluntly 准备好喉部和气管以便切开。将一根无菌气管插管插入气管，注意不要插入过深，以避免单侧通气。使用 2-O 丝线缝合固定插管，然后将插管连接至呼吸机，进行压力或容量控制通气。在开始实验前，定义液体补充方案、血管收缩剂应用方案以及终止实验的标准。用聚维酮碘溶液对大鼠尾部消毒三次，然后使用手术刀在腹侧纵向切开皮肤，长度为1厘米，注意不要切得过深，以免损伤尾动脉。使用手术显微镜小心暴露动脉。使用手术显微剪剪开动脉周围的筋膜。然后在远端动脉处进行近端6-0丝线结扎，但暂不收紧丝线。将一根26号导管插入远端与近端丝线结扎之间的动脉内，随后收紧近端丝线，以固定导管位置。将导管连接至压力传感器，以实现连续的动脉压测量。此外，在连接至压力传感器的导管与26号导管之间安装一个三通旋塞，用于动脉采血。在动物达到稳态后，通过注射LPS诱导脓毒症，并采集血样。按照1比4的比例用林格氏液补充血液样本流失的液体，操作过程中应始终避免注入空气，以防发生空气栓塞。无论是否接受LPS刺激，动物的平均动脉压均保持稳定。经LPS处理的动物会出现脓毒症的特征性表现，例如负碱剩余。经LPS处理的动物也出现了强烈的炎症反应，可通过血浆细胞因子（如趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-1和白细胞介素-6）进行检测。在实施该方案时，务必预先设定液体治疗和血管加压药物使用方案，并明确定义终止实验的标准，以获得可靠且可重复的研究数据。该方案可适用于其他脓毒症模型。因此，研究问题通过最合适的方法得到解答，并遵循动物福利的“减少、优化、替代”原则。

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一种可重复的重症监护病房导向内毒素模型在大鼠中的应用

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静脉注射内毒素可稳定地引发剂量依赖性的生理和免疫学改变，这些改变与多种病理状态一致。这种简化论方法可用于研究、模拟以及实验性调控人体全身性炎症及其后续效应。...

健康人群中静脉注射内毒素挑战：一种用于研究和调控全身性炎症的实验平台

本文介绍了一种在免疫功能健全的啮齿类动物中建立肺部感染的方法。熟练掌握后，该方法可快速、简便地用于诱导由多种S. pneumoniae、H. influenzae、P. aeruginosa、K. pneumoniae和A.

一种用于评估抗菌疗效的免疫健全啮齿类动物肺炎稳健模型S. pneumoniae,H. influenzae,K. pneumoniae,P. aeruginosa或A. baumannii

本方案描述了一种用于模拟长期危重症的中心静脉插管小鼠模型。我们结合盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症，并通过中心静脉导管给予液体、药物和营养物质，以模拟人类临床环境。...

在重症小鼠模型中利用中心静脉置管进行液体、药物和营养输注

新生小鼠感染发光的 E. coli O1:K1:H7...

一种革兰氏阴性菌败血症的新生儿影像学模型

我们提供了一种通过输注脂多糖建立猪实验性内毒素血症休克模型的实验方案。...

脂多糖输注作为猪内毒素血症休克模型

本方案描述了一种新生仔猪急性肺损伤模型的建立方法，该模型模拟早产肺中发生的早期致病事件，包括表面活性物质不足、高氧暴露、高压通气以及炎症反应，旨在促进对支气管肺发育不良分子触发机制的理解，并推动治疗策略的转化应用。...

建立一种新生仔猪急性肺损伤模型以重现早产儿肺部早期环境

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。...

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

学习一种可重复的大鼠内毒素血症模型，用于重症监护导向的脓毒症研究。该模型支持连续生理监测和多次采样，有助于减少实验动物数量并提高研究数据的可靠性。

一种可重复的面向重症监护病房的大鼠内毒素模型

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