Name: 单细胞阵列的活细胞成像 （LISCA） - 量化细胞动力学的多功能技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解单细胞阵列活细胞成像技术，通过微图案阵列和扫描延时显微镜追踪数百个独立细胞的荧光时间进程。该方法可在相同微环境中高效分析细胞响应，为定量研究细胞动力学提供系统化方案。

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本工作得到了德国科学基金会（DFG）对协同研究中心（SFB）1032的资助。同时感谢德国联邦教育、研究与技术部（BMBF）在合作项目05K2018-2017-06716 Medisoft以及巴伐利亚州研究基金会资助项目中的支持。安妮塔·赖泽尔（Anita Reiser）得到了德国科学基金会通过慕尼黑定量生物科学研究生院（QBM）提供的博士后奖学金资助。

<img alt="采用μPIPP微图案的微流控细胞培养过程；接种、管道设置和延时成像示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：结合单细胞微阵列（A）与扫描延时显微镜（B）的数据采集。 延时实验的准备工作包括：制备具有二维黏附方格微图案的单细胞阵列（1），随后进行细胞接种，并使细胞在微图案上排列对齐（2），以及将灌流系统连接至六通道载玻片，从而在延时成像过程中实现液体操控（3）。设置扫描延时实验（4），并在延时实验过程中，通过灌流系统向显微镜下的细胞注入mRNA脂质复合物溶液以完成转染（5）。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 微结构单细胞阵列的制备（图2A）
<ol>
	<li>准备用于制备 µPIPP 阵列的材料。
	<ol>
		<li>制备 pH 7.4 的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）。</li>
		<li>制备电阻率至少为 18 MΩ·cm（25 °C 时）的无菌超纯水。</li>
		<li>制备 PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa)（PLL-PEG）工作液：将 PLL-PEG 溶于含 150 mM NaCl 和 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的超纯水中，终浓度为 2 mg/mL。</li>
		<li>制备用于表面包被的细胞外基质蛋白溶液：将纤连蛋白（FN）溶于 PBS 中，终浓度为 1 mg/mL。</li>
		<li>准备一块通过光刻技术制备微图案的硅片8，作为可重复使用的母模。该微图案由边长为 30 µm、深度为 12 µm、间距为 60 µm 的正方形组成，排列成六条条带，每条条带宽 6 mm，高 18 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用硅弹性体试剂盒将聚二甲基硅氧烷（PDMS）单体与 9% 交联剂（质量百分比）混合，并在真空干燥器中脱气约 30 分钟，直至无气泡。在硅片上浇铸一层约 3–5 mm 厚的 PDMS 层，并再次脱气约 30 分钟，直至无气泡。
	<ol>
		<li>将带有 PDMS 的硅片放入 50 °C 的烘箱中，固化 PDMS 至少 4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切割 PDMS 印模。
	<ol>
		<li>使用手术刀从 PDMS 层中切下一整块包含六条微图案条带的 PDMS 母模。</li>
		<li>将 PDMS 母模放置于实验台上，使微图案面朝上。</li>
		<li>使用剃刀片将 PDMS 母模上的每条微图案条带分别切割成独立的 PDMS 印模。切割时需切除部分图案区域，确保 PDMS 印模边缘开放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 PDMS 印模放置于六通道载玻片的盖玻片上（图 3-1）。
	<ol>
		<li>使用未包被的盖玻片，通过轻轻刮擦盖玻片保护膜的方式标记六通道载玻片的通道位置。然后将盖玻片放置于实验台上，保护膜面朝下。</li>
		<li>使用镊子将 PDMS 印模微图案面朝下放置于盖玻片上已标记的通道位置。</li>
		<li>在显微镜下检查 PDMS 印模的附着情况。若 PDMS 印模完全贴附于盖玻片，则接触区域的正方形会比间隙区域颜色更深。PDMS 印模与盖玻片的贴附质量对微图案的完整性至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将带有六个 PDMS 印模的盖玻片放入等离子清洗仪中，用氧气等离子体处理（压力 0.2 mbar，功率约 40 W，时间 3 分钟），使 PDMS 印模与盖玻片之间的表面变为亲水性（图 3-2）。</li>
	<li>在生物安全柜中进行后续所有微图案制备步骤。取 15 µL PLL-PEG 溶液，用移液器在每个 PDMS 印模旁滴加一滴，使 PLL-PEG 溶液被 PDMS 印模的亲水区域吸收（图 3-3）。室温孵育 20 分钟。</li>
	<li>用 1 mL 超纯水冲洗带有 PDMS 印模的盖玻片，并用镊子移除 PDMS 印模（图 3-4）。再用 1 mL 超纯水冲洗盖玻片一次，并使其自然干燥。</li>
	<li>待盖玻片完全干燥后，将六通道粘性垫片贴附于盖玻片上（图 3-4）。注意确保微图案区域与各通道底部对齐。</li>
	<li>用 FN 功能化黏附正方形区域。
	<ol>
		<li>向每个通道中加入 40 µL PBS。</li>
		<li>在 PBS 中配制浓度为 100 µg/mL 的 FN 溶液。</li>
		<li>向每个通道中加入 40 µL FN 溶液（图 3-5）。通过从一个储液端吸出 40 µL 溶液并加入同一通道的对侧储液端，重复三次，充分混匀 FN 溶液与通道内的 PBS，以获得均一溶液。室温孵育 45 分钟。</li>
		<li>用 120 µL PBS 洗涤每个通道三次（图 3-6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为检测图案质量，可在步骤 9.2 中使用荧光标记的 FN（图 4A）。 
	​注：建议在细胞接种前不超过一天内制备 µPIPP 阵列，因为 PLL-PEG 和 FN 并未共价结合于基底，图案质量可能随时间下降。制备好的 µPIPP 阵列应保存于冰箱中。</li>
</ol>
<img alt="微加工示意图；三维PDMS印章，O₂等离子体处理，细胞外基质蛋白包被用于细胞图案化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：通过µPIPP技术制备单细胞微阵列。 （1）将表面具有三维微结构图案的PDMS印章排列在六通道载玻片的盖玻片上。（2）对带有PDMS印章的盖玻片进行氧气等离子体处理，使其表面具有亲水性。（3）加入PLL-PEG，其通过毛细作用被吸附至微结构中，并使未被PDMS印章覆盖的区域具有抗细胞黏附性。（4）用去离子水冲洗盖玻片以去除残留的PLL-PEG，随后移除PDMS印章，并将六通道粘性载玻片贴附于该盖玻片上。（5）加入细胞外基质蛋白纤连蛋白（fibronectin），使未被PLL-PEG覆盖的区域具有促细胞黏附性。（6）用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline）清洗六通道载玻片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 细胞接种（图2A）
注意：在以下洗涤步骤中，向一个储液池中加入相应的液体，然后从通道相对一侧的储液池中移除等体积的液体。
<ol>
	<li>用 120 µL 37 °C 的完全添加补剂的细胞培养基洗涤每个通道。在加入细胞悬液前，确保只有通道内充满培养基，而储液池中没有。</li>
	<li>按照您常规的细胞传代操作流程，将 HuH7 细胞从细胞培养瓶中消化下来，并将细胞悬液浓度调整至 4 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>向通道中加入 40 µL 细胞悬液，通过从一个储液池中吸出 40 µL 并加入同一通道的对侧储液池中，重复操作 3 次，使细胞悬液与培养基充分混合，以实现均匀的细胞分布（图 4B）。</li>
	<li>从通道中移除 40 µL 悬液，使仅通道内充满细胞悬液。</li>
	<li>将载片放入培养箱中，在接种后 1 小时使用相差显微镜观察细胞贴壁情况。</li>
	<li>加入 120 µL 37 °C 的预温细胞培养基。</li>
	<li>将载片重新放回培养箱中继续孵育 3 小时，以促进细胞在微图案上的自组织（图 4C）。</li>
</ol>
<img alt="显微分析、细胞在微阵列上的培养生长、荧光、延时成像，1小时至4小时比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：细胞自组织及µPIPP阵列的质量控制。（A）微结构表面由红色显示的方形纤连蛋白（FN）包被的黏附点组成，周围为抗细胞黏附的聚合物。（B）接种细胞后，HuH7细胞呈随机分布，（C）在4小时的时间内主要黏附于黏附点上。经许可转载7。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 灌注系统（图2A）
注意：仅当需要在延时成像过程中添加试剂或荧光标记物时，才需使用灌流系统。根据具体需求，可将每个通道连接至独立的灌流系统，或将多个通道串联至同一灌流系统。灌流系统的数量应与独立实验条件的数量相对应。在生物安全柜内以无菌条件连接管路，并避免在灌流系统中引入气泡。若不使用灌流系统，则应在延时成像开始前于生物安全柜内加入试剂或标记物。该灌流系统为实验室自制，所用材料列于材料表中。灌流系统的组装方法已有文献报道9。
<ol>
	<li>使用1 mL注射器（带替换用的sporn）并吸入1 mL 37 °C的细胞培养基。</li>
	<li>通过阀门将注射器连接至进液管，并用培养基填充管道。</li>
	<li>将进液管连接至某一通道的储液端，确保无气泡残留。</li>
	<li>若需将另一通道以串联方式接入该灌流系统，请将串联连接器连接至当前通道进液管对侧的储液端。接着连接下一个通道，将串联连接器的自由端连接至该通道的其中一个储液端。</li>
	<li>重复上述步骤，直至所需数量的通道均以串联方式连接完毕。</li>
	<li>将出液管直接连接至当前通道的空闲储液端。用培养基填充已连接的管道，以检查灌流系统是否泄漏。</li>
	<li>重复上述步骤，直至载玻片上的全部六个通道均连接至灌流系统。</li>
	<li>将连接好灌流系统的载玻片放回培养箱备用，或直接置于已预热至37 °C的显微镜加热腔内，进行活细胞延时成像。</li>
</ol>
4. 时间序列显微镜观察（图2B）
注意：进行长期测量时，应维持 37 °C 的稳定温度和稳定的 CO2 水平。作为依赖 CO2 的细胞培养基的替代方案，可使用 L15 培养基，该培养基无需气体培养系统。
注意：进行定量成像时，在延时成像测量期间应使用不含酚红的细胞培养基以减少背景荧光，并且技术重复实验应采用相同的延时成像程序设置以及相同的显微镜。
<ol>
	<li>使用10倍物镜和适当的荧光滤光片，设置延时摄影方案，以750 ms（根据相机而定）的曝光时间记录相差图像和荧光图像，连续循环扫描位置列表的时间间隔为10分钟，总观察时间为30小时。</li>
	<li>将带有细胞单细胞阵列的六通道载玻片放入37 °C恒温加热腔的样品架中。若六通道载玻片连接了灌流系统，请用胶带将管路固定在载物台上，以确保液体交换过程中六通道载玻片不会移动。将出口管的自由端穿过一个15 mL离心管上的孔洞，用于收集废液。</li>
	<li>设置扫描延时测量的位置列表。确保在设定的连续循环时间间隔内能够完成所有位置的扫描。使用10倍物镜时，根据相机芯片尺寸，每个通道可设置10至30个位置，以覆盖整个微图案区域。</li>
	<li>启动延时测量。为获得长期测量更佳的图像质量，建议使用自动对焦校正系统。</li>
</ol>
5. 荧光标记——mRNA 转染（图 2B）
注意：对于通过管路系统连接的两个通道的转染，需要总共 600 µL 转染混合液（每个通道 300 µL）。所指示的体积适用于两个相连通道的转染。
<ol>
	<li>将1 µL转染试剂加入200 µL低血清培养基中稀释，配制转染试剂溶液，并在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将编码eGFP的300 ng mRNA加入150 µL低血清培养基中稀释，配制mRNA溶液。</li>
	<li>将150 µL转染试剂溶液加入mRNA溶液中，混匀，制备转染混合液。在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>在转染混合液孵育期间，使用注射器向管路系统中注入1 mL 37 °C预热的PBS进行冲洗。冲洗管路时，确保显微镜载物台不发生移动。如有必要，暂停延时成像测量。</li>
	<li>加入300 µL低血清培养基，将转染混合液稀释至最终mRNA浓度为0.5 ng/µL。</li>
	<li>使用注射器将转染混合液注入管路系统，使mRNA脂复合物孵育1小时（如有必要，暂停延时成像测量）。</li>
	<li>终止转染孵育，使用注射器以1 mL 37 °C预热的完全添加补剂的细胞生长培养基冲洗，去除未结合的mRNA脂复合物（如有必要，暂停延时成像测量）。</li>
</ol>
6. 图像分析与荧光检测
<ol>
	<li>首次运行图像分析时，根据引用位置提供的说明10，安装开源软件“Automated Microstructure Analysis in Python”（PyAMA）的 0.1.6 版本。</li>
	<li>确保图像通道（相差和荧光）以多图像 16 位 TIFF 文件格式提供。如有必要，请相应地进行格式转换。</li>
	<li>启动 PyAMA，点击 打开堆栈… 以打开用于分析的图像。</li>
	<li>对于每个要打开的多图像 TIFF 文件，点击 打开 并选择文件，使其显示在对话框左侧的已加载文件列表中（图 5-1）。</li>
	<li>标记要包含在分析中的通道。对每个通道执行以下步骤：
	<ol>
		<li>在已加载文件列表中选择包含该通道的 TIFF 文件。</li>
		<li>在 添加新通道 区域中，选择该通道在 TIFF 文件中的索引。索引从零开始；第一个通道索引为 0，第二个通道索引为 1，依此类推。</li>
		<li>选择通道类型。对于相应的图像通道，选择 相差 或 荧光 ，对于表示细胞轮廓的二值通道，则选择 分割。</li>
		<li>可选：输入通道标签以区分不同的荧光通道，例如 eGFP 和 DAPI。</li>
		<li>配置完通道后，点击 添加。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当所有已添加的通道均显示在对话框右侧的通道列表中后，点击 确定 以加载图像堆栈。</li>
	<li>要使用 PyAMA 内置的基于相差图像的细胞识别分割算法进行分割（图 5-2），请转至 工具 | 二值化…，并输入用于保存二值化通道的 NumPy 文件的文件名。 
	注意：在当前版本中，加载二值化通道需要重新加载所有通道。</li>
	<li>要对荧光通道进行背景校正11（图 5-3），请确保已加载荧光通道和一个分割通道。若未加载分割通道，请确保已加载相差通道以进行自动分割。转至“工具 &gt; 背景校正…”，并为校正后的荧光通道结果 TIFF 文件指定文件名。 
	注意：在当前版本中，加载背景校正后的通道需要重新加载所有通道。</li>
	<li>通过滚动时间帧、查看左侧通道菜单中列出的通道，并点击细胞以高亮其荧光时间轨迹（图 1C），检查预选细胞（图 5-4）及其积分荧光信号（图 5-5）。利用细胞选择功能，将非活性细胞、未局限于黏附位点的细胞或与其他细胞黏附的细胞排除在后续分析之外。按住 Shift 键并点击细胞，或选中细胞后按 Enter 键，可切换细胞的读出选择状态。</li>
	<li>点击 文件 | 保存，选择保存目录，以保存单细胞的时间轨迹数据，包括细胞面积和积分荧光信号（图 5-6）。</li>
</ol>
<img alt="细胞分析工作流程：图像堆栈导入、细胞识别、追踪、荧光积分、时间过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：使用PyAMA对延时图像序列进行自动图像处理。（1）导入每个成像位置的相差图像和荧光图像序列。（2）通过对相差图像堆栈进行分割确定细胞轮廓。（3）对荧光图像进行背景校正。（4）随时间追踪细胞轮廓，并预选用于导出。（5）基于追踪得到的细胞轮廓对荧光强度进行积分。（6）分析单个细胞的细胞面积和积分荧光强度，并导出每个细胞的时间过程数据。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>为分析mRNA转染后的翻译动力学，采用Reiser等人先前描述的方法12，将基于生物化学速率方程的翻译模型拟合至每个单细胞的时间过程数据。该研究所用的数据和代码已公开提供13。</li>
	<li>针对每个单细胞的时间过程数据，提取翻译模型拟合所得的参数估计值，这些参数代表mRNA降解速率以及翻译起始的时间点。代表性结果部分将讨论一个示例数据集。</li>
	<li>对不同实验条件下参数最佳估计值的分布进行进一步分析，以研究细胞群体内单个细胞之间的变异性。</li>
</ol>

<ol><li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity%3A+do+differences+make+a+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity: do differences make a difference.</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li>
<li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells on chips.</a> Nature. 442 (7101), 403-411 (2006).</li>
<li>Segerer, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+method+to+generate+multiple+types+of+micropatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Versatile method to generate multiple types of micropatterns.</a> Biointerphases. 11 (1), 011005(2016).</li>
<li>Piel, M., Théry, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiel%2C+M+%22Micropatterning+in+cell+biology%2C+part+A%2FB%2FC%22">Micropatterning in cell biology, part A/B/C</a>. , Elsevier. (2014).</li>
<li>Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReiser%2C+A+%22Cell-Based+Microarrays%3A+Methods+and+Protocols%22">Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols</a>. Ertl, P., Rothbauer, M. , Springer. New York. 41-54 (2018).</li>
<li>Picone, R., Baum, B., McKendry, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPicone%2C+R+%22Methods+in+cell+biology%22">Methods in cell biology</a>. 119, Elsevier. 73-90 (2014).</li>
<li>Reiser, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-cell+time+courses+of+mRNA+transport+and+translation+kinetics%22">Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics</a>. , Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).</li>
<li>Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama">https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama</a> (2020).</li>
<li>Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773">https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773</a> (2020).</li>
<li>Reiser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+delivery+timing+and+protein+expression+in+lipid-based+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection.</a> Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).</li>
<li>Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supplementing+data+and+code+for%3A+%22Correlation+of+mRNA+delivery+timing+and+protein+expression+in+lipid-based+transfection%22%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection".</a> Zenodo. , Version 1.0 (2019).</li>
<li>Ferizi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+analysis+of+chemically+modified+mRNA+using+micropattern-based+single-cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).</li>
<li>Fröhlich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-experiment+nonlinear+mixed+effect+modeling+of+single-cell+translation+kinetics+after+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+systems+biology+and+applications%22%5BJournal%5D)">Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection.</a> NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Krzysztoń, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+kinetics+of+siRNA-mediated+mRNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077(2019).</li>
<li>Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-organization+on+micro-structured+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Cellular self-organization on micro-structured surfaces.</a> Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).</li>
<li>Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+study+of+nanoparticle+induced+apoptosis+using+microfabricated+single+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays.</a> Microarrays. 5 (2), 8(2016).</li>
<li>Murschhauser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+microscopy+method+for+single-cell+analysis+of+event-time+correlations+in+nanoparticle-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Chatzopoulou, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+platform+for+dynamic+analysis+of+NK+cell+cytolysis+mediated+by+a+triplebody%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody.</a> Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).</li>
<li>Sztilkovics, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+adhesion+force+kinetics+of+cell+populations+from+combined+label-free+optical+biosensor+and+robotic+fluidic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了LISCA作为一种多功能技术，可用于在单细胞水平上追踪细胞内荧光标记物的细胞动力学。为了成功实施LISCA实验，必须首先分别建立方案部分所述的每一个步骤，然后将所有步骤整合起来。LISCA的三个主要方面各自包含关键步骤。
单细胞微阵列的制备 
微阵列的质量至关重要，因为细胞在微阵列上的排列不仅影响后续所有实验步骤，还直接影响数据质量。因此，图案的几何形状和制备方法必须根据所使用的细胞类型进行优化。本文讨论的代表性结果是使用肝癌细胞系HuH7在(30 µm)2的方形图案上排列获得的。该图案几何结构也适用于其他细胞系，如A549或HEK293。对于体积较大的细胞，例如BEAS-2B，可采用边长为35 µm、方格间距为80 µm的较大方形图案。所述接种程序已针对HuH7细胞优化，但也可适用于多种其他贴壁细胞17。例如，某些细胞系需要不同尺寸的黏附点，或需要更大的黏附点间距，以避免因细胞伸长而导致的细胞间接触。
微图案应调整至黏...

近年来，单细胞实验的重要性日益凸显。单细胞数据可用于研究细胞间的异质性、解析细胞内参数的相关性，并检测在群体测量中难以察觉的细胞动力学特征1,2,3。为了并行研究成千上万个单细胞的细胞动力学，亟需开发新方法，以实现在标准化条件下对细胞进行数小时至数天的持续监测，并随后进行定量数据分析4。本文介绍了单细胞阵列活细胞成像技术（Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays, LISCA），该技术结合了微结构化阵列、延时显微成像和自动图像分析方法。
已有多种用于构建微结构化单细胞阵列的方法被建立并发表于文献中5,6。本文简要介绍微尺度等离子体引发的蛋白质图案化技术（Microscale Plasma-Initiated Protein Patterning, µPIPP）。使用µPIPP制备单细胞阵列的详细实验方案可参见文献7。单细胞阵列的应用可使数千个细胞精确排列在标准化的黏附位点上，每个位点为细胞提供明确定义的微环境，从而减少实验变异性的一个来源（图1A）。单细胞阵列可用于监测旨在指示多种细胞过程的荧光标记物的时间动态变化。通过扫描式延时成像模式进行长期显微观察，可覆盖单细胞阵列的大面积区域，从而在数小时甚至数天的观察时间内实现高通量的单细胞数据采集。该过程会生成来自阵列每个位置的时间序列图像堆栈（图1B）。为了高效地减少海量图像数据，并提取所需的单细胞荧光时间轨迹，需要采用自动化的图像处理方法，充分利用细胞在阵列中的精确定位信息（图1C）。
LISCA 的挑战在于调整实验方案和计算工具，以建立一种高通量检测方法，从而获得细胞动力学的定量且可重复的数据。本文详细描述了各个方法的具体步骤以及它们在 LISCA 检测中的整合方式。以人工 mRNA 递送后增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达的时间过程为例，说明该技术的应用。mRNA 递送后的 eGFP 表达可通过描述 mRNA 翻译与降解过程的反应速率方程进行建模。通过将 eGFP 浓度随时间变化的模型函数拟合到 LISCA 所测得的单个细胞荧光强度随时间变化的数据，可获得如 mRNA 降解速率等模型参数的最佳估计值。作为代表性结果，我们讨论了两种不同脂质转染试剂的 mRNA 递送效率，以及它们参数分布的差异。
<img alt="基于芯片的荧光显微镜；动态成像；延时数据处理；实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：LISCA工作流程示意图，结合了（A）微图案化单细胞阵列、（B）扫描式延时显微镜和（C）记录图像序列的自动图像分析。 单细胞阵列由二维排列的细胞黏附方格组成，其间为抗细胞黏附区域，从而引导细胞在微图案上有序排列，如相位对比图像及表达eGFP细胞的荧光图像所示（A）。整个微结构区域通过扫描延时模式进行成像，依次在多个位置重复采集图像（B）。记录的图像序列经处理后，可提取每个细胞随时间变化的荧光强度信息（C）。比例尺：500 µm（A），200 µm（C）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Adtech Polymer Engineering PTFE 微管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10178071</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor DL 10x</td><td>Nikon</td><td>MRH20100</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Roth</td><td>NX07.1</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eGFP mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头转管连接器</td><td>MEDNET</td><td>FTL210-6005</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Yo Proteins</td><td>663</td><td></td></tr><tr><td>eGFP滤光片组</td><td>AHF</td><td>F46-002</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;透明铂金固化硅胶管</td><td>Fisher Scientific</td><td>11768088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Okolab</td><td>OKO-H201</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Binder</td><td>9040-0012</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的L-15培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>雄性鲁尔接头</td><td></td><td></td><td>实验室自制，由聚四氟乙烯制成</td></tr><tr><td>雄性鲁尔接头转管连接器</td><td>MEDNET</td><td>MTLS210-6005</td><td>替代实验室自制的雄性鲁尔接头</td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>无针阀转雄性鲁尔接头</td><td>MEDNET</td><td>NVFMLLPC</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>成像软件版本 5.02.00</td></tr><tr><td>NOA81</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>用于管路系统组装的快速固化光学胶</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO</td><td>pco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td></td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Diener Femto</td><td>Pico-BRS</td><td></td></tr><tr><td>PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带微结构的硅晶圆</td><td></td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>Sola 光源引擎</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sticky slide VI 0.4&amp;nbsp;</td><td>ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Tango 2</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;user</td><td>00-24-626-0000</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>未包被的盖玻片</td><td>ibidi</td><td>10813</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Solo, 1 mL</td><td>Omilab</td><td>9166017V</td><td>带替换活塞</td></tr></tbody></table>

活细胞成像单细胞阵列（lisca）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

单细胞阵列活细胞成像（Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays, LISCA）是一种高通量获取单个细胞荧光信号时间序列的多功能方法。通常，从培养细胞中获取单细胞时间序列数据受到细胞运动性和细胞形态多样性的限制。黏附性微阵列可标准化单细胞的生长条件，并有助于图像分析。LISCA 将单细胞微阵列与扫描式延时显微镜技术及自动图像处理相结合。本文描述了以 LISCA 格式获取单细胞荧光时间序列的实验步骤。我们将编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）的 mRNA 转染至黏附于微图案化阵列上的细胞，并通过扫描式延时显微镜并行监测数百个细胞的 eGFP 表达动力学。图像数据堆由新开发的软件自动处理，该软件通过对选定的细胞轮廓区域积分荧光强度，生成单细胞的荧光时间序列。我们证明，转染 mRNA 后 eGFP 表达的时间过程可被一个简单的动力学翻译模型很好地描述，该模型能够揭示 mRNA 的表达速率和降解速率。本文还讨论了 LISCA 在信号传导与凋亡背景下对多个标记物事件时间相关性分析的进一步应用。

LISCA 方法能够高效地采集单个细胞的荧光时间序列。作为代表性示例，我们概述了如何应用 LISCA 方法测量转染后单细胞中 eGFP 的表达。LISCA 实验的数据可用于评估 mRNA 递送动力学，这对于高效 mRNA 药物的开发具有重要意义。
特别是，我们展示了两种基于脂质的mRNA递送系统在翻译起始时间点以及单细胞水平上的表达速率方面的不同影响。我们将培养的细胞分为两个群体：一个亚群按照方案部分所述使用脂质复合物（lipoplexes）进行转染；另一个亚群则使用相同mRNA、相同的终浓度mRNA，但以脂质纳米颗粒（LNP）作为递送系统进行转染，该脂质纳米颗粒通过微流控混合法制备。12由于脂质复合物和脂质纳米颗粒（LNP）的脂质组成不同，且其mRNA递送系统的制备方式不同，我们预期这将影响翻译动力学，因为摄取动力学会受到影响。利用LISCA方法，我们对时间点进行定量分析 t0 转染后翻译起始的时间以及细胞表达eGFP的强度，取决于转染的mRNA分子数量的乘积 m0...

我们介绍一种利用微图案阵列获取单细胞荧光报告信号时间序列的方法。本方案详细描述了单细胞阵列的制备、活细胞扫描式延时显微镜的设置与操作，以及一个开源图像分析工具，用于对每个黏附位点的细胞整合荧光时间序列进行自动预筛选、可视化质控和追踪分析。

活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

活细胞成像单细胞阵列（Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays，LISCA）是一种多功能方法，可用于高通量采集单个细胞的荧光信号时间序列数据。

称为LISCA的单细胞阵列活细胞成像技术还可自动记录数百个单个细胞的荧光时间过程。该方法的优势在于，可从空间上隔离但处于相同微环境中的单个细胞记录其响应，从而实现具有优良统计学意义的高效发射分析。要制备单细胞阵列，可使用手术刀从PDMs层中切割出一块包含六条微粉条纹的PDMs杰作，并将该杰作放置在实验台上，使微图案面朝上。使用剃刀刀片将六个微图案条带分别切割成PDMs印模，切去部分图案区域，以确保印模边缘开放。接着，用刀尖小心刮除六孔载玻片盖玻片上的保护膜，标记出各通道的位置，并将盖玻片放置于实验台上，使保护膜面朝下。使用镊子将印模放置在盖玻片上已标记的通道位置处，确保微图案面朝下，然后在显微镜下检查印模的附着情况。与载玻片接触的方格将比间隙区域颜色更深。若方格未能正确附着在载玻片上，会导致图案质量下降。如果印章已牢固附着，则将盖玻片和印章置于0.2毫巴压力下，以约40瓦功率进行三分钟的氧等离子体处理，以使PDMs印章与盖玻片之间的表面具有亲水性。等离子清洗结束后，将盖玻片放入生物安全柜中，并向每个印章上加入15微升聚乙二醇化聚-L-赖氨酸溶液，使溶液被印章的亲水性图案吸收。20分钟后，用一毫升超纯水冲洗印章。用镊子将印章从载玻片上取下，并用第二毫升超纯水再次冲洗盖玻片。当盖玻片完全干燥后，将一个六通道粘性载玻片贴附到盖玻片上，注意微图案区域需与通道底部对齐。向每个通道中加入 40 µL PBS 和 40 µL 纤连蛋白溶液。为混合这两种溶液，从同一通道的一端储液池中移取 40 µL 溶液并加入另一端储液池，重复三次，以形成均一的溶液。当所有通道混合完毕后，将载玻片在室温下孵育45分钟，然后用120微升PBS对每个通道各清洗三次。将通道中的PBS更换为37摄氏度的完全培养基，方法是在一个储液池中加入120微升培养基，并从相对的储液池中移除液体。向每个通道中加入40微升浓度为400,000个细胞/毫升的目标细胞悬液和40微升细胞培养基，并按照演示方式将细胞溶液与培养基充分混匀。混匀后，从每个通道中移除40微升悬浮液，使只有通道内充满细胞悬浮液，然后将载玻片放入细胞培养箱中。一小时后，通过相差显微镜检查细胞贴壁情况，并向每个通道加入120微升37摄氏度的细胞生长培养基，随后将载玻片放回细胞培养箱继续培养三小时。为建立灌流系统，将装有37摄氏度细胞生长培养基的1毫升注射器连接至系统的进液管，并使用阀门将培养基充满管道。将进样管连接至一个通道的储液池，注意避免产生气泡，并将串联连接器连接至该通道进样管相对一侧的储液池。按照示范方式连接其余通道，直至所需数量的通道完成串联。最后将出样管直接连接至最后一个通道的游离储液池。然后用培养基填充连接的管道，以确认灌注系统无泄漏。对于细胞的延时成像，需设置延时成像程序以记录相差图像和荧光图像，配置相差成像和荧光成像的光学参数。使用10倍物镜、合适的荧光滤光片以及自动对焦校正系统，以确保长期测量过程中获得更佳的图像质量。为相差成像选择10毫秒的曝光时间，为记录EGFP荧光强度选择750毫秒的曝光时间。设置时间程序，在连续循环遍历位置列表之间设置10分钟的时间间隔，总观察时间为30小时。接着，将六通道载玻片放置在显微镜37摄氏度加热室样品架的单细胞培养腔内，并用胶带将灌流系统管路固定在载物台上。将出口管的自由端插入一个15毫升的锥形管中，以收集液体废液。然后设置扫描延时测量的位置列表，注意确保在连续循环位置列表的定义时间间隔内能够完成所有位置的扫描。接着开始延时测量。为了用荧光标记物转染细胞，使用注射器以一毫升37摄氏度的PBS冲洗管路系统，注意避免显微镜载物台移动。冲洗后，向系统中加入300微升含目的mRNA的减血清培养基，mRNA终浓度为每微升0.5纳克，并让脂复合物孵育一小时。孵育结束后，用一毫升37摄氏度的完全细胞培养基冲洗系统，以去除未结合的mRNA。分析结束后，查看通道菜单中列出的通道，并滚动浏览时间帧，以检查预选的细胞及其整合的荧光信号。单击感兴趣的细胞可突出显示其荧光时间过程，或单击某条时间过程曲线以定位对应的细胞。单击细胞时按住 shift 键，可选择或取消选择该细胞。取消选择所有不可存活、未局限于黏附位点或与其他细胞相黏附的细胞，以将其排除在后续分析之外。当所有细胞均被正确选择或取消选择后，将单个细胞的细胞面积和整合荧光强度的时间序列数据保存至适当的目录中。为了量化转染后的翻译起始时间以及细胞中EGFP表达的强度，可采用三阶段翻译模型进行分析。EGFP 的模型解可以拟合单细胞的时间过程，如图所示。此处可观察到脂质体转染细胞的翻译起始时间与表达速率的直方图。由于这两个参数是针对每个细胞分别估算的，因此可以分析这些参数之间的相关性，如散点图所示，并与脂质纳米颗粒转染的细胞进行比较。如图所示，使用脂质纳米颗粒转染的细胞相比使用脂质复合物转染的细胞，细胞间变异性更小。同时，其群体平均表现出更快的翻译起始速度以及更高的表达水平。我们的方法也可适用于其他微图案化技术。LISCA 中最关键的是良好的细胞限制以及自动图像分析与便捷的用户监督相结合。如您所见，细胞行为具有异质性，而单细胞延时成像能够揭示内在生化网络的无偏动态过程。例如，在绿色表达中，进行细胞凋亡或细胞杀伤检测。

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单细胞阵列的活细胞成像 （LISCA） - 量化细胞动力学的多功能技术

展示了无需透镜的片上细胞成像与表征技术。这种片上细胞成像方法为医学诊断和高通量细胞生物学应用提供了一种紧凑且成本效益高的工具，特别适用于资源匮乏的环境。...

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长时间实时成像胚胎组织具有挑战性。本文介绍一种可在较长时间内以高空间和时间分辨率监测鸡胚脊髓中细胞及亚细胞水平变化的检测方法。该技术可适用于神经系统及其他胚胎发育区域的研究。...

发育中的神经上皮内细胞行为的高分辨率活体成像

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在本视频中，我们介绍了一种晶格光片显微镜技术，用于可视化活体T细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用。该方法通过将超薄的晶格光片聚焦于正在相互作用的细胞对上，获取一系列二维图像，并将这些图像进行整合，从而获得高分辨率的四维图像，揭示细胞间相互作用的空间-时间动态过程。...

使用晶格光片显微镜可视化活细胞中受体-配体相互作用

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活体成像联合单细胞示踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学与谱系进展

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无透镜视频显微技术用于贴壁细胞培养的动态定量分析

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一种基于延时、无标记、定量相位成像的休眠与活跃人癌细胞研究

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长期活细胞成像评估细胞对紫杉醇处理的细胞命运响应

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使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

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多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

了解单细胞阵列活细胞成像技术，通过微图案阵列和扫描延时显微镜追踪数百个独立细胞的荧光时间进程。该方法可在相同微环境中高效分析细胞响应，为定量研究细胞动力学提供系统化方案。

活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

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