活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

称为LISCA的单细胞阵列活细胞成像技术还可自动记录数百个单个细胞的荧光时间过程。该方法的优势在于，可从空间上隔离但处于相同微环境中的单个细胞记录其响应，从而实现具有优良统计学意义的高效发射分析。要制备单细胞阵列，可使用手术刀从PDMs层中切割出一块包含六条微粉条纹的PDMs杰作，并将该杰作放置在实验台上，使微图案面朝上。

使用剃刀刀片将六个微图案条带分别切割成PDMs印模，切去部分图案区域，以确保印模边缘开放。接着，用刀尖小心刮除六孔载玻片盖玻片上的保护膜，标记出各通道的位置，并将盖玻片放置于实验台上，使保护膜面朝下。使用镊子将印模放置在盖玻片上已标记的通道位置处，确保微图案面朝下，然后在显微镜下检查印模的附着情况。

与载玻片接触的方格将比间隙区域颜色更深。若方格未能正确附着在载玻片上，会导致图案质量下降。如果印章已牢固附着，则将盖玻片和印章置于0.2毫巴压力下，以约40瓦功率进行三分钟的氧等离子体处理，以使PDMs印章与盖玻片之间的表面具有亲水性。

等离子清洗结束后，将盖玻片放入生物安全柜中，并向每个印章上加入15微升聚乙二醇化聚-L-赖氨酸溶液，使溶液被印章的亲水性图案吸收。20分钟后，用一毫升超纯水冲洗印章。用镊子将印章从载玻片上取下，并用第二毫升超纯水再次冲洗盖玻片。

当盖玻片完全干燥后，将一个六通道粘性载玻片贴附到盖玻片上，注意微图案区域需与通道底部对齐。向每个通道中加入 40 µL PBS 和 40 µL 纤连蛋白溶液。为混合这两种溶液，从同一通道的一端储液池中移取 40 µL 溶液并加入另一端储液池，重复三次，以形成均一的溶液。

当所有通道混合完毕后，将载玻片在室温下孵育45分钟，然后用120微升PBS对每个通道各清洗三次。将通道中的PBS更换为37摄氏度的完全培养基，方法是在一个储液池中加入120微升培养基，并从相对的储液池中移除液体。向每个通道中加入40微升浓度为400,000个细胞/毫升的目标细胞悬液和40微升细胞培养基，并按照演示方式将细胞溶液与培养基充分混匀。

混匀后，从每个通道中移除40微升悬浮液，使只有通道内充满细胞悬浮液，然后将载玻片放入细胞培养箱中。一小时后，通过相差显微镜检查细胞贴壁情况，并向每个通道加入120微升37摄氏度的细胞生长培养基，随后将载玻片放回细胞培养箱继续培养三小时。为建立灌流系统，将装有37摄氏度细胞生长培养基的1毫升注射器连接至系统的进液管，并使用阀门将培养基充满管道。

将进样管连接至一个通道的储液池，注意避免产生气泡，并将串联连接器连接至该通道进样管相对一侧的储液池。按照示范方式连接其余通道，直至所需数量的通道完成串联。最后将出样管直接连接至最后一个通道的游离储液池。

然后用培养基填充连接的管道，以确认灌注系统无泄漏。对于细胞的延时成像，需设置延时成像程序以记录相差图像和荧光图像，配置相差成像和荧光成像的光学参数。使用10倍物镜、合适的荧光滤光片以及自动对焦校正系统，以确保长期测量过程中获得更佳的图像质量。

为相差成像选择10毫秒的曝光时间，为记录EGFP荧光强度选择750毫秒的曝光时间。设置时间程序，在连续循环遍历位置列表之间设置10分钟的时间间隔，总观察时间为30小时。接着，将六通道载玻片放置在显微镜37摄氏度加热室样品架的单细胞培养腔内，并用胶带将灌流系统管路固定在载物台上。

将出口管的自由端插入一个15毫升的锥形管中，以收集液体废液。然后设置扫描延时测量的位置列表，注意确保在连续循环位置列表的定义时间间隔内能够完成所有位置的扫描。接着开始延时测量。

为了用荧光标记物转染细胞，使用注射器以一毫升37摄氏度的PBS冲洗管路系统，注意避免显微镜载物台移动。冲洗后，向系统中加入300微升含目的mRNA的减血清培养基，mRNA终浓度为每微升0.5纳克，并让脂复合物孵育一小时。孵育结束后，用一毫升37摄氏度的完全细胞培养基冲洗系统，以去除未结合的mRNA。

分析结束后，查看通道菜单中列出的通道，并滚动浏览时间帧，以检查预选的细胞及其整合的荧光信号。单击感兴趣的细胞可突出显示其荧光时间过程，或单击某条时间过程曲线以定位对应的细胞。单击细胞时按住 shift 键，可选择或取消选择该细胞。

取消选择所有不可存活、未局限于黏附位点或与其他细胞相黏附的细胞，以将其排除在后续分析之外。当所有细胞均被正确选择或取消选择后，将单个细胞的细胞面积和整合荧光强度的时间序列数据保存至适当的目录中。为了量化转染后的翻译起始时间以及细胞中EGFP表达的强度，可采用三阶段翻译模型进行分析。

EGFP 的模型解可以拟合单细胞的时间过程，如图所示。此处可观察到脂质体转染细胞的翻译起始时间与表达速率的直方图。由于这两个参数是针对每个细胞分别估算的，因此可以分析这些参数之间的相关性，如散点图所示，并与脂质纳米颗粒转染的细胞进行比较。

如图所示，使用脂质纳米颗粒转染的细胞相比使用脂质复合物转染的细胞，细胞间变异性更小。同时，其群体平均表现出更快的翻译起始速度以及更高的表达水平。我们的方法也可适用于其他微图案化技术。

LISCA 中最关键的是良好的细胞限制以及自动图像分析与便捷的用户监督相结合。如您所见，细胞行为具有异质性，而单细胞延时成像能够揭示内在生化网络的无偏动态过程。

例如，在绿色表达中，进行细胞凋亡或细胞杀伤检测。