Name: 使用上格拉夫方法估计植物生物质的晶体纤维素含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学习上格拉夫方法测定植物生物质中晶体纤维素含量的完整实验流程。本视频演示了从样品制备、粗细胞壁提取、酸处理去除半纤维素和木质素，到蒽酮比色法定量分析的五个关键阶段。该方法广泛应用于植物生物学和生物质能研究领域。

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我们感谢植物系 &amp;#38; 土壤科学与棉花公司对本研究提供的部分资助。

1. 实验准备
<ol>
	<li>将干燥的植物材料研磨成细粉。</li>
	<li>蛋白溶解缓冲液（PSB）：配制1 M Tris（pH 8.8）和0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的储备液，并进行高压灭菌。使用这些储备液新鲜配制PSB缓冲液，终浓度为50 mM Tris、0.5 mM EDTA和10%十二烷基硫酸钠（SDS），溶于无菌水中。</li>
	<li>配制100 mL 70%乙醇（v/v）：取70 mL 100%乙醇与30 mL无菌水混合。</li>
	<li>配制100 mL甲醇：氯仿（1:1，v/v）：取50 mL甲醇与50 mL氯仿混合。</li>
	<li>配制82.5 mL Updegraff试剂。将75 mL 80%乙酸加入7.5 mL硝酸中，使水：乙酸：硝酸的最终体积比为2:8:1。配制80%乙酸时，将80 mL冰乙酸与20 mL无菌水混合（v/v）。</li>
	<li>每批实验前新鲜配制1 mg/mL葡萄糖溶液。称取10 mg葡萄糖溶于10 mL水（w/v）中。</li>
	<li>配制100 mL 67%硫酸（v/v）：将67 mL浓硫酸缓慢加入33 mL水中。务必使用玻璃瓶，并将酸缓慢加入水中。该过程为放热反应（释放热量），因此应在冰上配制，并在使用前于冰箱中冷却至少2小时。</li>
	<li>每次实验批次均需新鲜配制0.2%蒽酮溶液（w/v）。称取0.2 g蒽酮，溶于100 mL预冷的浓硫酸中，使用铝箔包裹的玻璃瓶溶解。使用前在冰箱中静置1–2小时。 
	&#8203;注意：为准确测定葡萄糖含量，强烈建议在实验当天将浓硫酸预先冷却，并新鲜配制蒽酮溶液。</li>
</ol>
2. 植物生物质材料的制备
<ol>
	<li>从温室中生长条件相同、发育阶段相同、植株部位相同以及组织类型相同（叶片/茎秆/根）的两个月大棉花实验品系中采集植物生物量样品。 
	注意：每份样品至少采集三个生物学重复。用清水彻底清洗样品，以去除根组织上的所有污物。</li>
	<li>将根组织在室温下置于纸巾上风干2天，以去除水分含量（图1）。 
	注意：为防止真菌污染，用于纤维素测定的组织应进行风干处理。</li>
	<li>将根样品分别放入独立容器中，标记后于49 °C恒温培养箱中烘干10天（材料表）。 
	注意：也可使用冷冻干燥机在较短时间内（1至2天）干燥植物组织，且不会引起植物生物量材料的化学变化。</li>
	<li>将干燥后的样品切割成小块，用液氮速冻后，使用研钵和研杵、冷冻研磨仪或生物质研磨器研磨成均匀的细粉（图1）。 
	注意：冷冻研磨仪的使用参数为每秒10个循环，共进行3个循环。</li>
	<li>收集研磨后的组织（图2），并继续进行细胞壁提取。 
	&#8203;注意：此时可将样品储存在密闭容器中，于室温下保存，以暂停实验流程。</li>
</ol>
3. 从植物生物质中提取粗细胞壁
注意：植物细胞壁含有纤维素、木质素、非纤维素组分、果胶、基质蛋白、酚类化合物和水26。由于纤维素存在于细胞壁中，第一步是将植物生物量中的细胞壁组分与非细胞壁组分分离26。
<ol>
	<li>在开始细胞壁提取过程之前，标记并称量各个空白的 2 mL 离心管。</li>
	<li>在继续下一步操作前，将空管的重量记录在实验记录本中。</li>
	<li>称取 2.5 步骤中得到的 20 mg 粉末组织，转移至已预称重的 2 mL 离心管中，并做好标记。</li>
	<li>向样品中加入 1 mL 蛋白质溶解缓冲液（PSB）（50 mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（HCl）缓冲液，pH 8.8，0.5 mM EDTA 和 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）），以溶解蛋白质。涡旋混匀后，在室温（RT）下以 25,200 × g 离心 5 分钟。离心后弃去上清液，保留沉淀。 
	注：如果需要分析蛋白质组分，可保存上清液。</li>
	<li>重复步骤 3.4 两次。</li>
	<li>向保留的沉淀中加入 1 mL 蒸馏水，涡旋混匀。在室温（RT）下以 25,200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 3.6 两次。</li>
	<li>向保留的沉淀中加入 1 mL 70% 乙醇，涡旋混匀后置于 70 °C 水浴/加热块中加热 1 小时，以去除样品中的可溶性成分和淀粉。再次涡旋并以 25,200 × g 在室温（RT）下离心 5 分钟。弃去上清液，保留沉淀。</li>
	<li>重复步骤 3.8 一次。</li>
	<li>向沉淀中加入 1 mL 100% 甲醇，涡旋混匀。在室温（RT）下以 25,200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入 1 mL 氯仿/甲醇（氯仿与甲醇按 1:1 比例混合），涡旋混匀。在室温（RT）下以 25,200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。甲醇和氯仿溶剂的加入可溶解并去除生物量中的脂质组分27。</li>
	<li>向沉淀中加入 1 mL 100% 丙酮，涡旋混匀。室温孵育 5 分钟。在室温（RT）下以 25,200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。丙酮可去除生物量中的色素（如叶绿素）和游离脂肪酸28,29。</li>
	<li>在 37 °C 下过夜干燥沉淀，或进一步采用真空干燥。 
	&#8203;注：干燥后的沉淀即为用于结晶纤维素测定的粗制细胞壁。此步骤可在此暂停，或继续使用真空干燥仪对样品进行干燥。</li>
</ol>
4. 使用Updegraff试剂（乙酸和硝酸）去除非纤维素组分
注意：该实验方案涉及使用酸类及其他化学品。在整个操作过程中需佩戴个人防护装备（PPE）。
<ol>
	<li>称取5 mg干燥的粗细胞壁沉淀物，放入一支新的2 mL螺口离心管中。记录准确重量（图3)30.</li>
	<li>在此步骤中加入阳性对照。使用 2 mg 滤纸（材料表作为阳性对照，其纤维素含量可达80%。</li>
	<li>向称重的 5 mg 细胞壁提取物和阳性对照中加入 1.5 mL Updegraff 试剂，涡旋混匀。 
	注意：从本步骤开始，阳性对照应与实验样本以相同方式处理。此步骤应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。 
	注意：此步骤应在螺口盖管中进行，以防止样品飞溅和管盖弹出。每个样品应设置三个生物学重复，同时设置三个阳性对照重复。</li>
	<li>将悬浮液在沸水浴中加热至100 °C，持续30分钟，随后在室温下冷却10分钟。在室温下以25,200 x g离心10分钟。通过离心去除上清液，保留沉淀。 
	注意：应分别收集有机溶剂、硫酸和Updegraff试剂（乙酸和硝酸）所产生的废液。含乙酸和硝酸的废液应置于低温环境中，并使用通风盖保存，严禁与其他有机溶剂或其他酸类混合，以防发生爆炸。</li>
	<li>向沉淀中加入1 mL水，在25,200 x g条件下离心&#160;室温孵育10分钟。移除500 µL上清液，向管中加入1 mL丙酮。</li>
	<li>在室温下以 25,200 x g 离心 5 分钟。移除 1 mL 上清液，向管中加入 1 mL 丙酮，再次在 25,200 x g 离心&#160;室温下孵育5分钟。</li>
	<li>离心后，弃去全部上清液，将沉淀重悬于1 mL丙酮中。室温孵育5分钟，然后在室温下以25,200 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，保留沉淀。将沉淀在37 °C下干燥过夜（图3). 
	注意：此时可暂停该流程，或继续使用真空干燥仪进行干燥，随后进入下一步。</li>
</ol>
5. 通过酸水解纤维素以产生葡萄糖单体单元
<ol>
	<li>向干燥的沉淀物中加入1 mL 67%的硫酸。涡旋振荡，使沉淀物在酸中完全混匀。</li>
	<li>在室温下振荡试管1小时，以使纤维素沉淀物溶解于67%硫酸中。 
	注意：作为替代方法，在振荡器中孵育30分钟后，可通过超声处理每个样品10分钟来提高纤维素沉淀物在67%硫酸中的溶解性。超声处理后，样品可在室温下重新放入振荡器中继续孵育。然而，当起始粗细胞壁提取物为5 mg时，我们观察到无需超声处理即可实现纤维素沉淀物的完全溶解（图3）。该方法适用于多种植物生物质样品3。</li>
</ol>
6. 使用蒽酮法测定葡萄糖含量及纤维素含量的估算
<ol>
	<li>此时，纤维素已转化为游离的葡萄糖单体。通过分光光度法测定样品中葡萄糖的含量，从而确定纤维素的量。</li>
	<li>从步骤5中取10 µL样品，加入490 µL无菌蒸馏水中，将每份样品稀释至500 µL。将稀释后的样品与水的混合液涡旋振荡10秒。</li>
	<li>向每个试管中加入1 mL新配制的0.2%蒽酮试剂，并立即涡旋混匀。</li>
	<li>将样品在100 °C下煮沸10分钟，然后在冰上冷却5分钟。将每份样品各200 µL转移至96孔板的三个孔中。将96孔板放入分光光度计中，于620 nm处测定吸光度。 
	&#8203;注意：高温煮沸时，请使用带螺旋盖的试管，以防止有害化学物质飞溅并避免样品损失。</li>
</ol>
7. 葡萄糖标准曲线的制备
<ol>
	<li>配制葡萄糖标准品：将 10 mg 葡萄糖溶解于 10 mL 无菌蒸馏水中，新鲜配制 1 mg/mL 的葡萄糖储备液。将该 1 mg/mL 储备液以 20 µL 为增量（0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 µL）加入无菌蒸馏水中（总体积为 1 mL），配制浓度范围为 0 µg 至 180 µg/mL 的葡萄糖标准品（图 3）。每次加入无菌水后，用涡旋振荡器充分混匀各葡萄糖标准品。</li>
	<li>从上述 10 种不同浓度中，分别取 500 µL 每种葡萄糖浓度溶液，分装至新的 2 mL 螺口离心管中。</li>
	<li>向每根试管中加入 1 mL 新鲜配制的 0.2% 蒽酮试剂，立即涡旋混匀。冰上孵育后，在 100 °C 下煮沸 10 分钟，随后再次冰上孵育 5 分钟23。</li>
	<li>将每种标准品各 200 µL 转移至 96 孔微孔板中的三个孔，进行三次技术重复，于 620 nm 处测定吸光度（图 3）。</li>
	<li>通过绘制不同葡萄糖浓度（0 至 180 µg/mL）与 620 nm 处归一化吸光度值的关系曲线，建立标准葡萄糖曲线（图 7）。利用由吸光度值生成的回归直线 Y = mx + c 计算所制备样品中的纤维素含量。 
	注意：每次实验均需新鲜配制葡萄糖标准品。若吸光度值过高或过低，应调整葡萄糖浓度，使其落在标准曲线吸光度值范围内。不同批次样品所用的葡萄糖标准品将产生不同的斜率 m 和截距 c 值。加入蒽酮试剂后应立即混匀各试管23。由于该反应为放热反应，蒽酮试剂、稀释样品及配制好的标准品在进行蒽酮比色测定前始终需保持低温保存。</li>
</ol>

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<li>Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Biopolymer+thin+films+and+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li>
<li>Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+aerogels%3A+Synthesis%2C+applications%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623(2018).</li>
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作者声明不存在利益冲突。

棉纤维是由棉籽产生的天然纤维。棉纤维为单细胞结构，纤维素含量约为95%2，具有较高的结晶纤维素含量，在纺织工业中具有广泛应用31。由于棉纤维含有约95%的纤维素，我们采用棉花根组织作为示例，用于展示结晶纤维素含量的测定方法。棉花根组织的结晶纤维素含量适中，代表了一种常见的植物生物量材料。测定结晶纤维素含量所需的总细胞壁材料仅为5 mg，因此该方法可用于不同发育阶段或组织特异性纤维素含量的测定。硫酸的浓度（67%）在将纤维素分解为葡萄糖单体并完全溶解纤维素的过程中起着关键作用23，且无需超声处理。在Updegraff处理后，样品损失较为常见，因为在测定过程的不同步骤中，结晶纤维素沉淀物并未牢固地沉积在管底。可通过在Updegraff处理后的每一步水洗和丙酮洗涤中移除少量上清液来尽量减少损失。此外，在加入蒽酮后立即对样品和标准品进行涡旋振荡，对显色反应及提高标准品的准确性具有重要作用，从而获得高达99.5%的决定系数（R2）&#160;值（<strong class="xfig...

纤维素是细胞壁中的主要承重成分，存在于初生细胞壁和次生细胞壁中。细胞壁是包围植物细胞的胞外基质，主要由纤维素、木质素、半纤维素、果胶和基质蛋白组成。植物生物量中约三分之一为纤维素1，其在植物生长发育过程中发挥重要作用，包括提供机械强度和刚性、调控细胞生长的速率与方向、维持细胞形态，以及抵御生物和非生物胁迫。棉纤维的纤维素含量高达95%2，而树木的纤维素含量则因植物种类和器官类型的不同，介于40%至50%之间3。纤维素由重复的纤维二糖单元构成，纤维二糖是一种通过β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖二糖4。纤维素乙醇是通过植物细胞壁中纤维素来源的葡萄糖发酵生产的5。纤维素纤维由多个微纤丝组成，每个微纤丝作为基本结构单元，包含500至15000个葡萄糖单体1,6。纤维素同多聚物由嵌入质膜的纤维素合酶复合体（CSC's）合成1,7。单个纤维素合酶A（CESA）蛋白合成葡聚糖链，相邻的葡聚糖链通过氢键连接形成结晶态纤维素1,8。纤维素存在多种结晶形态，其中以纤维素Iα和纤维素Iβ为主要的天然形态9。在高等植物中，纤维素以Iβ型存在，而在低等植物中则以Iα型存在10,11。总体而言，纤维素在赋予植物细胞壁强度和刚性方面具有重要作用。
第一代生物燃料主要由玉米淀粉、甘蔗糖和甜菜糖等食物来源生产，而第二代生物燃料则专注于利用非食物来源的植物生物质细胞壁材料生产生物燃料12。准确测定结晶纤维素含量不仅对纤维素生物合成和细胞壁动态的基础研究至关重要，也对生物燃料及生物基产品的应用研究具有重要意义。目前已开发并优化了多种用于植物生物质中纤维素含量测定的方法，其中Updegraff法是应用最广泛的纤维素测定方法。最早报道的纤维素测定方法由Cross和Bevan于1908年提出13，该方法基于交替使用氯化和硫酸钠提取的原理。然而，采用原始或改良后的Cross-Bevan法所获得的纤维素中，除含有大量木聚糖和甘露聚糖外，还存在少量木质素污染14。尽管对该方法进行了多次改进以去除纤维素组分中的木质素和半纤维素，Cross-Bevan法仍会保留相当量的甘露聚糖。随后，Kurschner法采用硝酸和乙醇提取纤维素15，该方法声称可完全去除木质素并去除75%的戊聚糖，但所得真实纤维素结果与Cross和Bevan的氯化法测定结果相同。另一种方法（Norman和Jenkins法）使用甲醇-苯混合液、硫酸钠和次氯酸钠提取纤维素16，但该方法仍残留约3%的木质素以及大量戊聚糖，导致纤维素含量测定不准确。之后，Kiesel和Semiganowsky采用不同的方法，使用80%浓硫酸水解纤维素，并通过Bertrand法测定水解产生的还原糖17。基于Kiesel和Semiganowsky法发展而来的另外两种方法——Waksman和Stevens法18以及Salo法14,19——测得的纤维素含量比早期方法低4-5%20。
Updegraff 法是目前最广泛使用的测定结晶纤维素含量的方法。该方法最早由 Updegraff 于 1969 年提出，用于纤维素的测定21。Updegraff 法结合了 Kurschner 法（使用硝酸）、Kiesel 和 Seminowsky 法（使用硫酸将纤维素水解为葡萄糖单体）并进行了若干改进，同时引入了 Viles 与 Silverman 提出的蒽酮比色法，用于简便地测定葡萄糖及结晶纤维素含量22。该方法的原理是利用乙酸和硝酸（Updegraff 试剂）处理匀浆化的植物组织，以去除半纤维素和木质素，从而保留对乙酸/硝酸具有抗性的纤维素，供后续处理与测定15。将乙酸/硝酸抗性纤维素用 67% 硫酸处理，使其分解为葡萄糖单体，再通过蒽酮法测定所释放的葡萄糖单体21,23。针对原始 Updegraff 法已有多种改进，以简化操作流程并优化蒽酮法对纤维素的测定24。总体而言，该方法可分为五个阶段：第一阶段为植物材料的准备；第二阶段从总生物量中分离粗细胞壁，因为纤维素是植物细胞壁的主要组分；第三阶段使用 Updegraff 试剂处理，将纤维素从非纤维素细胞壁组分中分离出来；第四阶段通过硫酸处理将乙酸/硝酸抗性纤维素分解为葡萄糖单体，此过程中葡萄糖单体与硫酸反应生成 5-羟甲基糠醛化合物；最后在第五阶段，蒽酮与前一阶段生成的糠醛化合物共沸，形成蓝绿色复合物25。这种基于蒽酮的比色法最早由 Dreywood 于 1942 年使用。蒽酮是一种染料，在酸性条件下可识别戊糖和己糖脱水产物（如 5-羟甲基糠醛）形成的糠醛化合物。与戊糖相比，己糖反应产生的颜色更深，响应更强25。通过分光光度计在 620 nm 处测定吸光度来定量结合态葡萄糖的含量，蓝绿色复合物的颜色强度与样品中糖的含量成正比。将测得的吸光度值与葡萄糖标准曲线回归线进行比较，计算出样品的葡萄糖浓度，并据此估算植物生物量中的纤维素含量。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18-500</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>蒽酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90-44-8</td><td>用于比色测定</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>用于离心</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Mallinckrodt</td><td>67-66-3</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>EM-EX0276-4S</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1004-090</td><td>阳性对照</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma</td><td>SKU A6283</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>加热金属浴/ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>用于控制温度</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fisherbrand</td><td>150152633</td><td>用于干燥植物样品</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>30243386</td><td>用于精确称量</td></tr><tr><td>100% 甲醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A412-500</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>微孔板（96 孔）</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td>用于蒽酮测定</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695041</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>聚丙烯微量管（2 mL）/螺口管</td><td>BioSpec Products</td><td>10831</td><td>用于高温处理</td></tr><tr><td>多功能酶标仪（分光光度计）</td><td>Beckmancoulter DTX880</td><td>1000814</td><td>用于测定吸光度</td></tr><tr><td>Spex SamplePrep 6870 冷冻研磨仪</td><td>Spex Sample Prep</td><td>68-701-15</td><td>用于将植物组织研磨成细粉</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>J.T.Baker</td><td>02-004-382</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151-21-3</td><td>用于 PSB 缓冲液</td></tr><tr><td>离心管（2 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>Tris 盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;1185-53-1</td><td>用于 PSB 缓冲液</td></tr><tr><td>超纯去离子水</td><td>Invitrogen</td><td>10977</td><td>用于本方案</td></tr><tr><td>真空干燥仪（Vacufuge plus）</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>用于样品干燥</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisherbrand</td><td>14-955-151</td><td>用于混匀</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Thermoscientific</td><td>TSGP02PM05</td><td>用于特定步骤的温度控制</td></tr><tr><td>称量纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12A</td><td>用于本方案</td></tr></tbody></table>

利用updegraff法测定植物生物质中的结晶纤维素含量

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

纤维素是地球上通过光合作用生成的最丰富的聚合物，也是细胞壁的主要承重成分。细胞壁通过提供强度、刚性、细胞生长的速率和方向、细胞形态的维持以及对生物和非生物胁迫的防护，在植物生长和发育中发挥着重要作用。细胞壁主要由纤维素、木质素、半纤维素和果胶组成。近年来，植物细胞壁已成为第二代生物燃料和生物能源生产的靶标。特别是植物细胞壁中的纤维素成分被用于生产纤维素乙醇。准确测定生物质中纤维素含量对于基础和应用的细胞壁研究至关重要。Updegraff法是一种简单、稳健且被广泛用于测定植物生物质中结晶纤维素含量的方法。将酒精不溶性粗细胞壁组分用Updegraff试剂处理后，可去除半纤维素和木质素组分。随后，将耐Updegraff试剂的纤维素组分用硫酸处理，使纤维素均聚物水解为单体葡萄糖单位。通过配制不同浓度的葡萄糖建立回归曲线，并用于估算实验样品中纤维素水解所释放的葡萄糖量。最后，通过比色蒽酮法根据葡萄糖单体的含量来估算纤维素含量。

本研究选取在温室中种植的棉花植株。为比较纤维素含量，选用了两种不同的棉花实验品系。对于每个实验品系，分别采集三个生物学重复的根组织。总共取500 mg组织进行匀浆处理，并从中取20 mg用于粗细胞壁的提取。随后，取5 mg粗细胞壁提取物，用Updegraff试剂处理，以去除半纤维素和木质素，保留纤维素。纯化后的纤维素通过硫酸处理进行水解，将纤维素分解为葡萄糖单元。在620 nm处测得的吸光度读数结果（补充表1）用于通过蒽酮法测定葡萄糖浓度并估算纤维素含量。三个技术重复的平均吸光度值通过减去0 µg葡萄糖浓度的空白吸光度值进行校正。葡萄糖标准曲线采用散点柱状图生成（图4）。
利用该标准曲线所得的回归直线 y = mx + c，结合归一化吸光度读数，用于计算提取测试样品中未知的葡萄糖浓度。为计算 x（未知葡萄糖浓度，单位为 µg/µL），采用公式（x = (归一化吸光度 - c)/m）。其中，c 和 m 的数值来源于标准葡萄糖曲线的回归直线（R2 = 0.99），用于测定...

Updegraff 法是用于纤维素测定的最广泛使用的方法。本演示的主要目的是提供一种详细的 Updegraff 方案，用于测定植物生物量样品中的纤维素含量。

利用Updegraff法测定植物生物质中的结晶纤维素含量

纤维素是地球上通过光合作用生成的最丰富的聚合物，也是细胞壁的主要承重成分。细胞壁在...

本文展示了Updegraff法，这是目前全球最广泛使用的测定结晶纤维素含量的方法。纤维素主要由通过β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖单体构成。我们将该实验方案分为五个阶段。在第一阶段，我们准备植物生物质材料。在第二阶段，提取粗细胞壁。在第三阶段，我们采用Updegraff法处理，其中Updegraff试剂由乙酸和硝酸组成，有助于从样品中去除半纤维素和木质素。在第四阶段，我们借助硫酸进行酸水解，从而产生葡萄糖单体。最后，在第五阶段，我们采用蒽酮法测定结晶纤维素的含量。从温室中采集植物材料，用清水彻底清洗，室温下晾干两天，分离组织后将组织转移至分别标记的容器中，并在49摄氏度的培养箱中孵育10天。最后，使用剪刀或刀片将组织切成小块。将组织冷冻后放入研钵中，用研杵充分研磨成均匀的粉末；或者也可使用冷冻研磨仪（Freezer/Mill）。此处我们以冷冻研磨仪为例进行演示，因此将组织样品放入这些研磨管中，置于冷冻研磨仪内，以10 CP的速度运行三个循环。将组织粉末收集到 Falcon 管中，如图所示。称取 20 mg 组织粉末，转移至已预称重的 2 mL 离心管中。加入 1 mL 蛋白质溶解缓冲液以去除蛋白质。涡旋振荡。在15,000 RPM下离心五分钟。弃去上清液。重复此步骤两次。向保留的沉淀中加入1 mL无菌水。充分涡旋。在15,000 RPM条件下离心5分钟。重复此步骤再两次。向保留的沉淀物中加入1 mL 70%乙醇，涡旋振荡。转移至预热至70°C并同时振荡的金属浴中，孵育1小时。孵育结束后，在15,000 RPM条件下离心5分钟。再重复此步骤一次。向保存的沉淀中加入 1 mL 100% 甲基乙二酮。涡旋混匀。在 15,000 RPM 条件下离心 5 分钟。加入1 mL氯仿-甲醇。涡旋振荡。在15,000 RPM下离心5分钟。弃去上清液，加入1 mL丙酮。涡旋振荡。室温孵育5分钟。在15,000 RPM下离心5分钟。弃去上清液，于37摄氏度下空气干燥过夜，或通过真空干燥继续处理。将样品放入真空干燥器中，风干两到三小时，或直至沉淀完全干燥。称取上一步骤获得的细胞壁提取物 5 mg，转移至 2 mL 螺口管中。此时还需加入阳性对照。为此目的，使用两毫克的沃特曼滤纸。转移至一个两毫升的螺旋盖管中。向每份称重的细胞壁提取物中加入 1.5 mL Updegraff 试剂。涡旋混匀后，在预热的金属浴中 100 摄氏度孵育 30 分钟。孵育 30 分钟后，转移至试管架中。室温静置冷却10分钟。以15,000 RPM离心10分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。加入1 mL无菌水。涡旋振荡。在15,000 RPM下离心10分钟。弃去500微升上清液。加入 1 mL 丙酮。涡旋振荡。在 15,000 RPM 条件下离心 5 分钟。弃去 1 mL 上清液。加入1 mL丙酮。涡旋振荡。在15,000 RPM下离心5分钟。完全弃去上清液。加入 1 mL 丙酮。涡旋振荡。在 15,000 RPM 条件下离心 5 分钟。弃去上清液。在37摄氏度下干燥过夜。孵育一晚后，转移至试管架。加入1 mL 67%硫酸。涡旋振荡。在25摄氏度下孵育一小时，同时振荡。孵育一小时后，确保沉淀物完全溶解。转移至试管架中。这是纤维素提取的最后一步。现在样品已准备好进行样品稀释。进行样品稀释时，取上一步骤中每份样品的10 µL，加入490 µL无菌水。对所有实验样品重复此步骤。用于制备葡萄糖标准曲线时，配制新鲜的1 mg/mL葡萄糖储备液，并通过以20 µL递增的方式加入1 mg/mL葡萄糖，配制0 µg至200 µg的不同浓度，再用无菌水定容至1 mL。取每种已配制的标准品500 µL至带螺旋盖的试管中，加入1 mL 0.2%蒽酮溶液。现在样品已准备好进行蒽酮测定。加入1 mL新配制的蒽酮试剂，立即涡旋混匀，然后置于冰上。以相同方法对所有标准品和样品进行重复操作。然后转移至预热至100摄氏度的金属浴中，孵育10分钟。10分钟孵育结束后，立即转移至冰上，于冰中继续孵育5分钟。孵育后，取各样品200微升，设三个重复。对标准品和样品均以相同方式重复操作。将加样完毕的96孔板放入多功能酶标仪中。使用 Smart Max Pro 程序，将滤光片设置为 620 纳米，选择 96 孔板类型，并选中全部读取区域。单击“确定”。读取。读取酶标板。您将获得标准品和样品的吸光度读数，这些数据将被收集到 Excel 表格中，用于进一步分析和纤维素含量的估算。葡萄糖标准曲线的制备方法是：以葡萄糖浓度（单位为微克/毫升）作为横坐标，以相应浓度在620纳米处的归一化吸光度值作为纵坐标。在绘制的散点图中，我们得到一条回归直线，并获得其斜率（m）和截距（c）值，用于估算样品中结晶纤维素的含量。第一步，我们计算了620纳米处的光密度（OD）值的平均值。然后通过减去空白值对数据进行归一化。我们使用公式 x 等于（OD 减去 c）除以 m 来计算葡萄糖浓度，其中 c 和 m 的值来自标准曲线中回归直线前一步骤的结果。由于蒽酮测定所用的总体积为 500 微升，我们再除以稀释倍数 2。由于所用样品体积仅为10微升，因此需进一步除以10，以获得每微升微克浓度的葡萄糖，该浓度等于每毫升毫克浓度。然后，我们使用了1.11的水分校正因子，该因子代表此过程中的水分增加量。最后，将结果除以细胞壁重量（约5毫克），再乘以100，即可计算出结晶纤维素含量的百分比。然后，我们对三个生物学重复样本的结晶纤维素含量取平均值，以获得单个样本的数值，并将其与另一实验组三个生物学重复样本的平均值进行比较。可采用 t 检验来评估两者之间的显著性水平。在表 A 中，我们列出了浓度及其在 620 纳米处对应的吸光度（OD）值，这些数据进一步用于绘制散点图和回归线，并利用所得的斜率（m）和截距（c）值代入公式 C，以计算两个实验组之间的纤维素含量差异。总之，两个样本均显示出纤维素的差异。感谢观看。

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