利用Updegraff法测定植物生物质中的结晶纤维素含量

本文展示了Updegraff法，这是目前全球最广泛使用的测定结晶纤维素含量的方法。纤维素主要由通过β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖单体构成。我们将该实验方案分为五个阶段。

在第一阶段，我们准备植物生物质材料。在第二阶段，提取粗细胞壁。在第三阶段，我们采用Updegraff法处理，其中Updegraff试剂由乙酸和硝酸组成，有助于从样品中去除半纤维素和木质素。

在第四阶段，我们借助硫酸进行酸水解，从而产生葡萄糖单体。最后，在第五阶段，我们采用蒽酮法测定结晶纤维素的含量。从温室中采集植物材料，用清水彻底清洗，室温下晾干两天，分离组织后将组织转移至分别标记的容器中，并在49摄氏度的培养箱中孵育10天。

最后，使用剪刀或刀片将组织切成小块。将组织冷冻后放入研钵中，用研杵充分研磨成均匀的粉末；或者也可使用冷冻研磨仪（Freezer/Mill）。此处我们以冷冻研磨仪为例进行演示，因此将组织样品放入这些研磨管中，置于冷冻研磨仪内，以10 CP的速度运行三个循环。

将组织粉末收集到 Falcon 管中，如图所示。称取 20 mg 组织粉末，转移至已预称重的 2 mL 离心管中。加入 1 mL 蛋白质溶解缓冲液以去除蛋白质。涡旋振荡。

在15,000 RPM下离心五分钟。弃去上清液。重复此步骤两次。

向保留的沉淀中加入1 mL无菌水。充分涡旋。在15,000 RPM条件下离心5分钟。重复此步骤再两次。

向保留的沉淀物中加入1 mL 70%乙醇，涡旋振荡。转移至预热至70°C并同时振荡的金属浴中，孵育1小时。孵育结束后，在15,000 RPM条件下离心5分钟。

再重复此步骤一次。向保存的沉淀中加入 1 mL 100% 甲基乙二酮。涡旋混匀。在 15,000 RPM 条件下离心 5 分钟。

加入1 mL氯仿-甲醇。涡旋振荡。在15,000 RPM下离心5分钟。弃去上清液，加入1 mL丙酮。涡旋振荡。

室温孵育5分钟。在15,000 RPM下离心5分钟。弃去上清液，于37摄氏度下空气干燥过夜，或通过真空干燥继续处理。

将样品放入真空干燥器中，风干两到三小时，或直至沉淀完全干燥。称取上一步骤获得的细胞壁提取物 5 mg，转移至 2 mL 螺口管中。

此时还需加入阳性对照。为此目的，使用两毫克的沃特曼滤纸。转移至一个两毫升的螺旋盖管中。

向每份称重的细胞壁提取物中加入 1.5 mL Updegraff 试剂。涡旋混匀后，在预热的金属浴中 100 摄氏度孵育 30 分钟。孵育 30 分钟后，转移至试管架中。

室温静置冷却10分钟。以15,000 RPM离心10分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。

加入1 mL无菌水。涡旋振荡。在15,000 RPM下离心10分钟。弃去500微升上清液。

加入 1 mL 丙酮。涡旋振荡。在 15,000 RPM 条件下离心 5 分钟。弃去 1 mL 上清液。

加入1 mL丙酮。涡旋振荡。在15,000 RPM下离心5分钟。完全弃去上清液。

加入 1 mL 丙酮。涡旋振荡。在 15,000 RPM 条件下离心 5 分钟。弃去上清液。

在37摄氏度下干燥过夜。孵育一晚后，转移至试管架。加入1 mL 67%硫酸。涡旋振荡。

在25摄氏度下孵育一小时，同时振荡。孵育一小时后，确保沉淀物完全溶解。转移至试管架中。

这是纤维素提取的最后一步。现在样品已准备好进行样品稀释。进行样品稀释时，取上一步骤中每份样品的10 µL，加入490 µL无菌水。

对所有实验样品重复此步骤。用于制备葡萄糖标准曲线时，配制新鲜的1 mg/mL葡萄糖储备液，并通过以20 µL递增的方式加入1 mg/mL葡萄糖，配制0 µg至200 µg的不同浓度，再用无菌水定容至1 mL。取每种已配制的标准品500 µL至带螺旋盖的试管中，加入1 mL 0.2%蒽酮溶液。

现在样品已准备好进行蒽酮测定。加入1 mL新配制的蒽酮试剂，立即涡旋混匀，然后置于冰上。

以相同方法对所有标准品和样品进行重复操作。然后转移至预热至100摄氏度的金属浴中，孵育10分钟。10分钟孵育结束后，立即转移至冰上，于冰中继续孵育5分钟。

孵育后，取各样品200微升，设三个重复。对标准品和样品均以相同方式重复操作。将加样完毕的96孔板放入多功能酶标仪中。

使用 Smart Max Pro 程序，将滤光片设置为 620 纳米，选择 96 孔板类型，并选中全部读取区域。

单击“确定”。读取。读取酶标板。您将获得标准品和样品的吸光度读数，这些数据将被收集到 Excel 表格中，用于进一步分析和纤维素含量的估算。

葡萄糖标准曲线的制备方法是：以葡萄糖浓度（单位为微克/毫升）作为横坐标，以相应浓度在620纳米处的归一化吸光度值作为纵坐标。在绘制的散点图中，我们得到一条回归直线，并获得其斜率（m）和截距（c）值，用于估算样品中结晶纤维素的含量。第一步，我们计算了620纳米处的光密度（OD）值的平均值。

然后通过减去空白值对数据进行归一化。我们使用公式 x 等于（OD 减去 c）除以 m 来计算葡萄糖浓度，其中 c 和 m 的值来自标准曲线中回归直线前一步骤的结果。由于蒽酮测定所用的总体积为 500 微升，我们再除以稀释倍数 2。

由于所用样品体积仅为10微升，因此需进一步除以10，以获得每微升微克浓度的葡萄糖，该浓度等于每毫升毫克浓度。然后，我们使用了1.11的水分校正因子，该因子代表此过程中的水分增加量。最后，将结果除以细胞壁重量（约5毫克），再乘以100，即可计算出结晶纤维素含量的百分比。

然后，我们对三个生物学重复样本的结晶纤维素含量取平均值，以获得单个样本的数值，并将其与另一实验组三个生物学重复样本的平均值进行比较。可采用 t 检验来评估两者之间的显著性水平。在表 A 中，我们列出了浓度及其在 620 纳米处对应的吸光度（OD）值，这些数据进一步用于绘制散点图和回归线，并利用所得的斜率（m）和截距（c）值代入公式 C，以计算两个实验组之间的纤维素含量差异。

总之，两个样本均显示出纤维素的差异。感谢观看。