Name: 增强分子化合物输送到细胞的声透流体装置的组装和操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学习组装和操作声透流体装置，利用超声空化效应实现生物分子向细胞的高效递送。该方法可在维持细胞活性的前提下快速完成分子导入，适用于癌症治疗等细胞疗法研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了美国国家科学基金会（#1827521、#1827521、#1450370）&#160;和美国国立卫生研究院（U01HL127518）资助。光刻服务由路易斯维尔大学微/纳米技术中心提供。

根据路易斯维尔大学机构审查委员会批准的方案，从健康献血者采集全血。
1.&#160;制备&#160;的&#160;声流控&#160;设备
<ol>
	<li>获取具有同心螺旋结构的光掩模，其中通道直径为 500 µm。补充文件中提供了一个 CAD 文件作为示例。可从商业供应商处订购定制光掩模，或使用掩模写入设备自行制备。</li>
	<li>使用标准光刻技术在涂有光刻胶的硅片上制备同心螺旋结构的模具。
	<ol>
		<li>在 100 mm 硅片上加入约 2 汤匙（~30 mL）SU-8 2100。</li>
		<li>将硅片置于匀胶机上，以 150 rpm 的速度旋转 30 秒以铺展光刻胶，然后将速度提高至 1,200 rpm 持续 60 秒，形成厚度为 200 µm 的涂层。</li>
		<li>将涂有光刻胶的硅片放入聚酰亚胺真空烘箱中，在 115 °C 下进行固化：先升温 30 分钟，保温 30 分钟，再降温 30 分钟。</li>
		<li>使用掩模对准器，通过步骤 1.1 中的光掩模对涂有光刻胶的硅片曝光 130 秒。</li>
		<li>曝光后，按照步骤 1.2.3 中所述相同过程对硅片进行烘烤。</li>
		<li>将光刻胶在 SU-8 显影液中显影约 8 分钟。 
		注意：仅可在通风良好的化学通风橱中使用显影液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对模具进行硅烷化处理，使其表面更具疏水性。将涂有光刻胶的硅片放入干燥器中，并加入 20 µL 氯硅烷（C8H4Cl3F13Si）液滴。对腔体抽真空 30 秒，然后密封并静置过夜。 
	注意：氯硅烷具有高度危险性和易燃性，接触可导致严重灼伤和眼部损伤。</li>
	<li>在杯子中混合 54 g 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基体与 6 g 固化剂，用刮刀剧烈且充分搅拌至少 1 分钟。</li>
	<li>将盛有 PDMS 溶液的杯子放入干燥器中约 30 分钟，或直至溶液中残留的气泡完全去除。</li>
	<li>将带有图案面朝上的光刻胶硅片放入 150 mm 培养皿中。</li>
	<li>将 PDMS 溶液倒入 150 mm 培养皿内的模具上。</li>
	<li>如有需要，将 150 mm 培养皿放入干燥器中并抽真空，直至残留气泡消失。</li>
	<li>将 150 mm 培养皿转移至实验室烘箱中，在 60 °C 下烘烤 2 小时以固化 PDMS。</li>
	<li>固化完成后，使用剃刀刀片沿硅片边缘切割，小心地将 PDMS 从培养皿中取出。</li>
	<li>使用刀片或剃刀刀片切割出每个独立的装置。</li>
	<li>使用 2.5 mm 活检打孔器在每个装置的进样口和出样口处打孔。</li>
	<li>将每个 PDMS 装置的通道面朝上（暴露）放入等离子体灰化仪中。进行氧气等离子体处理（100 W，45 秒，500 mbar O2），然后立即将每个 PDMS 装置通道面向下贴合到洁净的钠钙玻璃载玻片（75 mm × 25 mm × 1 mm）表面。</li>
	<li>让装置在室温下静置过夜以完成键合。</li>
	<li>在直径为 1 cm 的压电换能器表面均匀涂抹厚度约为 1–2 mm 的硅胶，然后仔细对准同心螺旋结构，并轻轻将其压在玻璃载玻片底部（与 PDMS 装置相对的一侧）。</li>
</ol>
2.&#160;组装&#160;和&#160;操作&#160;的&#160;声流控&#160;系统
<ol>
	<li>使用 USB A 转 B 数据线将微控制器连接到计算机。绿色电源指示灯（标有 PWR）应亮起。</li>
	<li>在计算机上使用配套程序上传生成 8 MHz 信号的程序。示例程序见&#160;补充&#160;文件。程序上传后将存储在微处理器内存中，无需再次上传。</li>
	<li>将一段 1&#34; 长的 22 号导线焊接到压电换能器每根导线的末端。</li>
	<li>通过焊接好的导线将压电换能器的负极（黑色）端子导线连接至接地引脚（GND）。</li>
	<li>通过焊接好的导线将压电换能器的正极（红色）端子导线连接至输出引脚（在提供的示例程序中为 #9 引脚）。</li>
	<li>可选：将声流控装置和微控制器安装在一个 3D 打印外壳中。示例 CAD 文件见&#160;补充&#160;文件&#160;。可根据需要将额外导线连接至微控制器的其他引脚，以控制外部 LED 指示灯和开关按钮。</li>
	<li>截取 3–6&#34; 长的 Tygon PVC 软塑料管（内径 1/16&#34;，外径 1/8&#34;），将其推入进样口和出样口。插入时可能需要边施加压力边旋转软管，直至其完全嵌入开口。可选：在将软管插入各端口后，可在连接处涂抹胶水，以使 PDMS 与软管粘合。</li>
	<li>根据制造商说明组装微流控储液装置。</li>
	<li>截取一段 3–6&#34; 长的 Tygon PVC 软塑料管（内径 1/16&#34;，外径 1/8&#34;），将其套在微流控储液装置出口管路的 1/32&#34; 内径管上。可选：在连接处缠绕一层石蜡膜，以防止泄漏。</li>
	<li>用环境空气填充一支 60 mL 注射器（可选：使用 0.2 µm 滤膜过滤空气），并将其连接至微流控储液装置一侧的 Tygon PVC 管（内径 1/16&#34;，外径 1/8&#34;）。</li>
	<li>将注射泵设置为 200 mL/h 的流速，以 50 mL/h 的体积流速推动细胞/超声造影剂溶液通过声流控装置，并将装置出口的样品收集至 50 mL 离心管中。可选：在进行声流控处理前，用 15 mL 70% 乙醇溶液冲洗通道，以提高流体通道的无菌性。此外，在向系统中泵入细胞前，可用 15 mL 去离子水冲洗通道，以去除装置中残留的乙醇。</li>
</ol>
3.&#160;超声造影剂的制备
注意：超声造影剂通过暂时增加邻近细胞膜的通透性，显著增强分子化合物的声流体递送效率19。在该系统中，若无超声造影剂，分子递送效果极为有限。
<ol>
	<li>在20 mL闪烁瓶中配制磷脂溶液，包含以下混合物：
	<ol>
		<li>加入25 mg的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）。</li>
		<li>加入11.6 mg的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（DSEPC）。</li>
		<li>加入0.26 mg的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DSPG）。</li>
		<li>加入0.88 mg的聚氧乙烯40硬脂酸酯。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入氯仿直至所有磷脂完全溶解（例如，加入3 mL氯仿）。</li>
	<li>在干燥器中蒸发氯仿48小时，形成干燥的脂质膜（也可在氩气氛围下或使用旋转蒸发仪加速干燥过程）。</li>
	<li>用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重新水合脂质膜。</li>
	<li>将脂质溶液在40%振幅下超声处理3分钟，形成阳离子胶束溶液。</li>
	<li>超声处理后，将磷脂溶液在2–6 °C保存，可稳定保存长达1个月。</li>
	<li>为制备超声造影剂，向2 mL玻璃密封小瓶中加入200 µL阳离子胶束溶液和600 µL无菌PBS。</li>
	<li>通过压紧瓶盖密封小瓶。</li>
	<li>使用1.5&#34; 20G针头向小瓶顶部空间充入十氟丁烷气体30秒。</li>
	<li>以4,350 cpm速度振荡小瓶45秒，形成填充全氟丁烷气体的超声造影剂。</li>
	<li>在将造影剂/细胞混合物泵入声流控装置前，立即向每1 mL细胞溶液中加入25 µL超声造影剂溶液。细胞溶液可根据用户需求进行调整，但在本研究中，步骤4.21使用的是原代T细胞，步骤5.7使用的是A549肺癌细胞。</li>
</ol>
4.&#160;原代T细胞的制备
<ol>
	<li>从全血溶液中分离外周血单个核细胞（PBMCs），并在 -150 °C 下保存。通常采用含有基质的密度梯度离心法从全血中分离 PBMCs24,25,26。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中解冻冻存的细胞管。</li>
	<li>在 15 mL 离心管中用 PBS 将解冻后的 PBMCs 按 1:10 比例稀释。每 1 mL 细胞管中约含有 1000 万个 PBMCs。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 580 x&#160;g&#160;离心 11 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并加入 13 mL MACs 洗涤缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对 PBMCs 进行计数。</li>
	<li>再次在 4 °C 条件下，以 580 x&#160;g&#160;离心 11 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>每 1000 万个 PBMCs 加入 40 µL 冷却的洗涤缓冲液。</li>
	<li>为分离 T 细胞，每 1000 万个 PBMCs 加入 10 µL Pan T 细胞生物素抗体混合液。</li>
	<li>轻轻振荡混匀 PBMCs，并在 4 °C 下孵育 5 分钟（每 1000 万个细胞）。</li>
	<li>每 1000 万个 PBMCs 加入 30 µL 洗涤缓冲液和 20 µL Pan T 细胞 MicroBead 混合液。</li>
	<li>充分混匀 PBMCs 与磁珠，并在 4 °C 下继续孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入洗涤缓冲液，使总体积达到 500 µL。</li>
	<li>使用市售的台式磁性分选仪器，按照制造商说明书中的“耗竭式分离&#34;depletes separation&#34;设置分离初始 T 细胞。此步骤在细胞分选后应获得 500 万至 1000 万个 T 细胞。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对 T 细胞进行计数。</li>
	<li>将 T 细胞用 10 mL 无菌 PBS 稀释，在 4 °C 条件下以 580 x g 离心 10 分钟以收集细胞。</li>
	<li>吸除上清液，并将 T 细胞重悬于 1 mL PBS 中。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对 T 细胞进行计数，并将细胞分装为每毫升含 100 万个细胞用于实验。</li>
	<li>在 PBS 中配制浓度为 1 mg/mL 的荧光素溶液。</li>
	<li>在处理前立即向每 1 mL T 细胞悬液中加入 100 µL 的 1 mg/mL 荧光素溶液（终浓度 = 100 µg/mL）。</li>
	<li>加入 25 µL 超声造影剂溶液，操作同步骤 3.11 中所述。</li>
	<li>使用声流控系统处理 1 mL 细胞分装液（参见步骤 2.10–2.11）。此步骤可增强荧光素向初始 T 细胞内的递送。</li>
	<li>处理后立即用 500 µL PBS 以 580 x&#160;g&#160;离心 10 分钟，洗涤细胞三次，以去除胞外荧光素。应在加入荧光素溶液后 10 分钟内完成细胞洗涤。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将细胞重悬于 250 µL PBS 中，并在流式细胞仪上检测荧光强度。</li>
</ol>
5.&#160;制备&#160;A549&#160;肺癌细胞
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2&#160;条件下，将A549（人肺腺癌肺泡基底上皮）细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的完全DMEM培养基中，使用平底组织培养瓶。</li>
	<li>当A549细胞融合度达到70–90%时进行收获。吸除培养瓶中的培养基，并用PBS洗涤细胞一次，以去除血清蛋白。</li>
	<li>向培养瓶中加入0.25% EDTA胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5分钟。胰蛋白酶是一种消化酶，可使细胞从组织培养瓶底部脱离。</li>
	<li>将胰蛋白酶溶液转移至15 mL离心管中，并按1:3比例加入完全DMEM培养基以中和酶活性。</li>
	<li>在4 °C下以1,500 x&#160;g&#160;离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀重悬于含有200 mM海藻糖的PBS溶液中，调整细胞浓度为100,000/mL，置于15 mL锥形管中。</li>
	<li>加入25 µL超声造影剂溶液，操作同前3.11步骤所述。</li>
	<li>使用声流控系统处理1 mL细胞分装样品（参见步骤2.10–2.11）。此步骤可增强海藻糖向A549肺癌细胞内的递送。</li>
	<li>处理后立即通过离心用500 µL PBS洗涤细胞三次，以去除胞外海藻糖。应在加入海藻糖溶液后10分钟内完成细胞洗涤。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将细胞重悬于100 µL PBS中。</li>
	<li>加入11 µL 1% Triton X-100溶液，裂解细胞以释放胞内海藻糖。</li>
	<li>涡旋振荡15秒，然后在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>再次涡旋振荡15秒，随后按照制造商说明书，使用市售海藻糖检测试剂盒测定海藻糖浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Gardlik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+and+delivery+systems+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Vectors and delivery systems in gene therapy.</a> Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).</li>
<li>Wahlers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+multiplicity+of+infection+and+protein+stability+on+retroviral+vector-mediated+gene+expression+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells.</a> Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).</li>
<li>Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+nonviral+delivery+systems+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Viral and nonviral delivery systems for gene delivery.</a> Advanced Biomedical Research. 1, 27(2012).</li>
<li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+theories%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation theories: a review.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li>
<li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+theory+and+methods%2C+perspectives+for+drug+delivery%2C+gene+therapy+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).</li>
<li>Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+and+experimental+demonstration+of+the+electric+field+assisted+electroporation+microchip+for+in+vitro+gene+delivery+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement.</a> Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).</li>
<li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Electroporation.+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stochastic model for electric field-induced membrane pores.</a> Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+a+general+phenomenon+for+manipulating+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).</li>
<li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315(2015).</li>
<li>Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+contrast+agents%3A+targeted+ultrasound+imaging+and+ultrasound-assisted+drug-delivery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Radiology%22%5BJournal%5D)">Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications.</a> Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).</li>
<li>Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-triggered+release+of+materials+entrapped+in+microbubble-liposome+constructs%3A+a+tool+for+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).</li>
<li>Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+microbubble-facilitated+sonoporation+for+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Delivery%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery.</a> Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).</li>
<li>Secomski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultrasound+experiments%3A+Standing+wave+and+multiple+reflections+influence+on+the+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics%22%5BJournal%5D)">In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome.</a> Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).</li>
<li>Gedge, M., Hill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidics+17%3A+theory+and+applications+of+surface+acoustic+wave+devices+for+particle+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+tweezers%3A+patterning+cells+and+microparticles+using+standing+surface+acoustic+waves+%28SSAW%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).</li>
<li>Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+particle+separation+in+a+microfluidic+channel+via+standing+surface+acoustic+waves+%28SSAW%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).</li>
<li>Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+operation+of+acoustofluidic+devices+supporting+bulk+acoustic+standing+waves+for+sheathless+focusing+of+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53861(2016).</li>
<li>Belling, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidic+sonoporation+for+gene+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).</li>
<li>Centner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-induced+molecular+delivery+to+erythrocytes+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024114(2020).</li>
<li>Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+developing+CAR+T-cell+therapy+for+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure.</a> Frontiers in Immunology. 11, 361(2020).</li>
<li>Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+and+future+of+CAR+T+cells+for+B-Cell+Acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).</li>
<li>Hand, S. C., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+for+improving+desiccation+tolerance%3A+insights+from+the+brine+shrimp+Artemia+franciscana%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana.</a> Planta. 242 (2), 379-388 (2015).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-drying+of+mammalian+cells+using+trehalose%3A+preservation+of+DNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6198(2017).</li>
<li>Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+isolation+techniques+for+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+Cell+recovery+and+viability%2C+population+composition%2C+and+cell+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality.</a> Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).</li>
<li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).</li>
<li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMC%29+by+density+gradient+centrifugation+on+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li>
<li>Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perforation+and+recovery+dynamics+in+microbubble-mediated+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).</li>
<li>Kopechek, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+targeted+microbubble+destruction-mediated+delivery+of+a+transcription+factor+decoy+inhibits+STAT3+signaling+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth.</a> Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).</li>
<li>Bhutto, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+molecular+weight+on+sonoporation-mediated+uptake+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medical+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells.</a> Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).</li>
<li>Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+evaluation+of+the+role+of+definity+in+producing+sonoporation+of+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).</li>
<li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li>
<li>Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonoporation+of+cultured+cells+in+the+rotating+tube+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system.</a> Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).</li>
</ol>

共同作者 MAM 和 JAK 持有 DesiCorp 的所有权，该公司可能从与本研究相关的產品中获得经济利益。

本方案描述了一种低成本声流控系统的组装与操作方法，该系统可增强生物分子向细胞内的递送，适用于科研应用。在组装和操作该系统时，需考虑若干重要因素。声流控装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，这是一种生物相容性材料，可方便地模塑成型，并保持通道尺寸的一致性27。在进行声流控处理前，可用15 mL的70%乙醇溶液冲洗装置通道，以提高与培养细胞操作时的无菌性。乙醇清洗后，可使用15 mL去离子水冲洗装置，以在加入细胞溶液前清除通道中残留的乙醇。微小的声流控通道容易被碎屑或细胞聚集体堵塞，这限制了装置的频繁使用。每次样品处理后彻底冲洗通道有助于防止通道堵塞问题。此外，每批次可制备多个PDMS装置，以便在必要时快速更换。对于基于超声的应用，制备具有均匀厚度的PDMS装置至关重要，因为PDMS厚度的差异会影响流体通道内的超声压力。超声波在装置中持续传播，透射波与反射波相互作用形成稳定的声波模式，该模式对PDMS厚度的差异极为敏感17。PDMS的厚度主要由加入模具中的PDMS量决定（步骤1.7），本方案所得PDMS厚度为3.5 mm。
<p clas...

病毒性和非病毒性递送平台已被用于增强分子向细胞的递送。病毒递送（转导）是一种常用于需要基因组修饰的细胞治疗中的技术。病毒递送的局限性包括潜在的插入突变、转基因容量有限以及非预期的多重感染1,2。因此，非病毒性分子递送技术正在被开发，以适用于广泛的生物医学和科研应用。常见技术包括机械法、电穿孔法、流体动力法，或利用基于激光的能量来促进生物分子进入细胞&#160;3。电穿孔是一种常用的非病毒性分子递送平台，能够诱导细胞膜产生瞬时穿孔，从而实现分子化合物的胞内递送4,5,6,7,8,9。然而，细胞膜的瞬时穿孔是一个随机过程，通过电穿孔实现的分子摄取通常依赖于分子被动扩散穿过瞬时形成的膜孔4,7,8。
另一种方法是利用超声波，通过超声造影剂（即充满气体的微泡）的空化作用，增强分子向细胞内的递送。微泡空化在其周围介质中引发微流效应，可导致邻近细胞质膜发生瞬时穿孔（&#34;声孔效应&#34;），从而通过被动或主动转运机制实现生物分子快速进入细胞内10,11,12。声孔效应是一种高效的细胞分子递送技术，但该方法通常需要昂贵的设备和批量处理方式，且受限于通量较低以及超声暴露条件的较高变异性13。为克服这些局限，目前正致力于开发声流控装置，以实现对悬浮细胞进行稳定一致的声孔处理。
声流控技术是一个不断发展的领域，它将超声波与微流控技术相结合，适用于多种应用。此前，该方法已用于颗粒分离，通过施加连续的超声能量在流体通道内激发驻波14,15,16,17。颗粒根据其尺寸、密度以及相对于介质的可压缩性等多种特性被分选到装置的不同区域16。声流控技术还正在开发中，以实现向多种细胞类型快速递送分子，用于科研应用及细胞治疗产品的生产18。最近，我们展示了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的声流控装置，可增强对红细胞的分子递送效率19。在该声流控平台上，可通过调控细胞与微泡的动力学行为，诱导物理相互作用，从而增强生物分子的递送效果。通过优化细胞与微泡之间的距离，有望进一步提高细胞内分子递送的效率和一致性。
声流控介导的声穿孔技术的一个重要应用是将生物分子导入原代人T细胞。基于过继性T细胞转移的免疫疗法，例如嵌合抗原受体T细胞（CAR T）疗法，正在迅速发展，用于治疗包括癌症和HIV病毒在内的多种疾病20。CAR T疗法在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中尤其有效，完全缓解率可达70-90%21。然而，这些疗法的T细胞制备通常依赖于病毒转导，而该方法存在插入突变风险、制备周期长，以及难以递送蛋白质或小分子等非遗传性生物分子等局限性1。声流控介导的分子递送方法有望克服这些限制，提升T细胞疗法的生产效率。
声流控介导的声穿孔另一项重要应用是向细胞内递送保护性化合物（如海藻糖），以在冷冻和干燥过程中保护细胞。自然界中某些生物能够产生海藻糖，并通过其保护细胞膜来耐受冷冻和干燥过程22,23。然而，哺乳动物细胞不能合成海藻糖，且海藻糖无法透过哺乳动物细胞膜。因此，必须采用有效的分子递送技术（如声穿孔），才能实现保护细胞内膜所需的足够胞内海藻糖浓度。目前，该方法正在开发用于多种细胞类型的干燥保存。
本方案详细描述了一种由微控制器驱动的、成本相对较低的声流控系统的组装与操作。利用超声造影剂在流体通道内诱导声孔效应，实现向多种细胞类型（包括T细胞和癌细胞）的快速分子递送。该声流控系统可用于多种科研应用，也可作为原型系统，用于评估改进细胞治疗生产工艺的声孔效应方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;声流控装置的制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOW SYLGARD 184 硅胶封装剂，透明，0.5 kg 套件</td><td>埃尔斯沃思粘合剂</td><td>4019862（SKU）</td><td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core（2.5 mm）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>69039-25</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon管微型储液器 - S型（2/4端口）</td><td>达尔文微流控</td><td>LVF-KPT-S-2（货号）</td><td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td></tr><tr><td>三氯硅烷</td><td>Gelest</td><td>105732-02-3（Cas号）</td><td>氯硅烷具有高度危险性和易燃性。接触会导致严重灼伤和眼部损伤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tygon PVC 软塑料管（1/16&quot; ID，1/8&quot; OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233K51（部件编号）</td><td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;声流控系统的组装&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno</td><td>Arduino</td><td>7630049200050（条形码）</td><td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;超声造影剂的制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（DSEPC）</td><td>Avanti Lipids</td><td>890703P-25mg（货号）</td><td>https://avantilipids.com/product/890703</td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DSPC）</td><td>Avanti Lipids</td><td>850365P-25mg（货号）</td><td>https://avantilipids.com/product/850365</td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油（DSPG）</td><td>Avanti Lipids</td><td>840465P-25mg（货号）</td><td>https://avantilipids.com/product/840465</td></tr><tr><td>APF-140HP（十氟丁烷气体）</td><td>FlouroMed</td><td>355-25-9（Cas No.）</td><td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td></tr><tr><td>DB-338 混合器&amp;nbsp;</td><td>COXO</td><td></td><td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td></tr><tr><td>聚氧乙烯40硬脂酸酯&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440-250G（货号）</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=zh&amp;&region=US&amp;amp;gclid=&lt;br/&gt;Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj&lt;br/&gt;高效递送生物分子进入细胞内是广泛生物医学研究和细胞治疗应用所必需的。超声介导的声致孔技术是一种新兴的生物分子胞内递送方法。当充满气体的微泡发生空化时，会在邻近细胞膜上形成瞬时孔隙，从而使细胞快速摄取周围液体中的生物分子。目前针对悬浮细胞体外声致孔的技术受限于通量低、各细胞所受超声暴露条件不一致以及成本高昂等问题。为克服这些局限，已开发出一种低成本声流控装置，该装置将超声换能器集成于基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片中，结合超声造影剂，在细胞流经通道时实现稳定一致的声致孔效应。该装置采用标准光刻技术制备PDMS微流控芯片，将压电超声圆盘换能器连接至装置并由微控制器驱动。整个组件可集成于3D打印外壳中以提供额外保护。通过连接PVC管路的注射泵或蠕动泵推动细胞与微泡流经装置。该声流控系统已成功实现向人源T细胞和肺癌细胞高效递送生物分子。与传统的批量处理方法相比，该系统提高了通量并降低了实验变异性，有助于优化生物医学研究中的细胞处理方法以及细胞治疗产品的生产制备。&lt;br/&gt;vID64X-1KbO3LUKGjVUwb&lt;br/&gt;PDAaAqvOEALw_wcB</td></tr><tr><td>Q125 超声波破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110（参考）</td><td>https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&amp;&_sid=406df3776&amp;amp;_ss=r</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;原代T细胞的制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACs 运行缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221（订单号）</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td></tr><tr><td>人泛T细胞分离试剂盒（泛T细胞生物素抗体混合液） &amp;& Pan T细胞微珠混合液）&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-535（订单号）</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td></tr><tr><td>磁性细胞分选仪（autoMACS Pro 分离器）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545（订单号）</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;A549 肺癌细胞的制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>海藻糖检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-TREH（货号）</td><td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td></tr><tr><td>台盼蓝（0.4% 水溶液，即用型，无菌）</td><td>VWR</td><td>97063-702（货号）</td><td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td></tr></tbody></table>

用于增强分子化合物向细胞递送的声流控装置的组装与操作

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

生物分子的有效细胞内递送对于广泛的生物医学研究和基于细胞的治疗应用至关重要。超声介导的声孔效应是一种新兴的生物分子快速细胞内递送技术。当充满气体的微泡发生空化时，会在邻近细胞膜上形成瞬时孔隙，从而使细胞快速摄取周围液体中的生物分子。目前针对悬浮细胞的体外声孔处理技术受限于通量低、每个细胞所受超声暴露条件不一致以及成本高昂等问题。为克服这些局限，已开发出一种低成本的声流控装置，该装置将超声换能器集成于基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片中，结合超声造影剂，在细胞流经通道时实现稳定一致的声孔效应。该装置采用标准的光刻技术制备基于PDMS的微流控芯片，将一个超声压电圆盘换能器连接至装置，并由微控制器驱动。整个组件可集成于一个3D打印外壳中以提供额外保护。通过连接PVC管路的注射泵或蠕动泵推动细胞和微泡流经装置。本声流控系统已成功实现了向人源T细胞和肺癌细胞高效递送生物分子。与整体处理方法相比，该声流控系统提高了处理通量并降低了实验变异性，有助于改进生物医学研究中的细胞处理方法以及细胞治疗产品的生产制备。

图1展示了组装在3D打印外壳内的声流控系统的图像。本方案构建的声流控系统可用于在多种细胞系中利用超声造影剂增强细胞内分子递送。
图2 显示，与未处理的对照组相比，采用声流控处理可显著增强荧光化合物荧光素向原代人T细胞的胞内递送（p&lt;0.05，n=3/组）。将T细胞以1×10⁶个/mL的浓度悬浮于含100 µg/mL荧光素溶液和25 µL/mL超声造影剂溶液的PBS中，混合液经声流控装置进行超声处理。处理后通过离心洗涤去除胞外荧光素，再通过流式细胞术检测胞内荧光素的递送效率及细胞活力。未处理对照组的T细胞同样以1×10⁶个/mL的浓度悬浮于含100 µg/mL荧光素溶液的PBS中，但未添加超声造影剂溶液，且未经过声流控装置处理。经声流控处理后，T细胞的荧光强度较未处理对照组提高了5倍，表明荧光素的递送效率显著增强。声流控处理后细胞活力略有下降，但仍保持在80%以上（p&lt;0.05，n=3/组）。
...

本方案描述了一种低成本声流控装置的组装与操作方法，该装置通过超声造影剂诱导的声孔效应，实现分子对细胞的快速递送。

高效的生物分子胞内递送对于广泛的生物医学研究和基于细胞的治疗应用至关重要。

本方案描述了一种声流控系统的组装与操作方法，该系统可高效地将生物分子递送至多种研究及基于细胞的治疗应用中。该系统的主要优势在于，能够在保持细胞活性的同时，实现生物分子向细胞的快速递送。这是一种平台型技术，可用于改造细胞，进而应用于多种细胞治疗领域，例如癌症治疗。首先，在烧杯中加入54克PDMS基底和6克固化剂。用刮刀充分且彻底地搅拌至少一分钟，然后将装有PDMS溶液的烧杯放入真空干燥器中约30分钟，直至残留的气泡完全去除。将带有光刻胶涂层且图案面朝上的硅片放入直径150毫米的培养皿中，随后将PDMS溶液浇注到模具上。如有需要，将培养皿放入干燥器中，并抽真空直至残留的气泡消失。将培养皿转移至实验室烘箱中，在60°C下烘烤两小时以固化PDMS。固化完成后，用剃刀刀片沿晶圆边缘切割，小心地将PDMS从培养皿中取出。使用刀片或剃刀逐个切下每个装置，然后使用2.5毫米活检打孔器在入口和出口端口处打孔。将PDMS装置经氧气等离子体处理后，立即将其通道面向玻璃表面，放置于洁净的钠钙玻璃显微镜载玻片上。让装置在室温下过夜固化，完成键合。将硅胶轻轻涂抹在直径为1厘米的压电换能器表面，厚度为1至2毫米，然后仔细将换能器与同心螺旋对齐，并轻柔地压在玻璃显微镜载玻片底部。使用USB A至B线缆将微控制器连接到计算机。绿色电源LED指示灯应亮起。使用计算机上的配套软件上传一个生成八兆赫信号的程序。将一根一英寸长的22号导线焊接到PZT换能器每根导线的末端。然后将PZT换能器的负极端导线连接到GND引脚。将PZT换能器的正极端导线通过焊接的导线连接到输出引脚。截取三到六英寸长的Tygon PVC软塑料管，将管子插入进液口和出液口。在施加压力的同时可能需要旋转管子，直至其完全嵌入开口。可选择在连接处涂抹胶水，以将PDMS和管路粘合在一起。也可选择将声流控装置和微控制器安装在3D打印的外壳中。根据制造商的说明组装微流控储液池。截取一段3至6英寸长、内径为1/16英寸的Tygon PVC软塑料管，套在微流控储液池出口的内径为1/32英寸的管子上。可选择用石蜡膜包裹连接处，以防止泄漏。在微流控储液池一侧，用60毫升注射器吸入环境空气。将注射泵设置为200毫升/小时的流速，以50毫升/小时的体积流速推动造影剂溶液通过声流控装置，并将装置出口处的样品收集到50毫升离心管中。在20毫升闪烁瓶中配制磷脂溶液：加入25毫克DSPC、11.6毫克DSEPC、0.26毫克DSPG和0.88毫克聚氧乙烯40硬脂酸酯，再加入氯仿直至所有磷脂完全溶解。在干燥器中蒸发氯仿48小时，形成干燥的脂质膜。用10毫升无菌PBS重新水化脂质膜，然后在40%振幅下超声处理脂质溶液3分钟，以形成阳离子胶束溶液。超声处理后，该磷脂溶液可在2至6摄氏度下保存长达一个月。制备超声造影剂时，将200微升阳离子胶束溶液加入600微升无菌PBS中，置于2毫升玻璃密封小瓶内。通过压紧瓶盖密封小瓶。使用1.5英寸20号针头向小瓶顶部空间注入十氟丁烷气体30秒。将小瓶中的物质混合，形成全氟丁烷气体填充的超声造影剂。每1毫升细胞溶液中加入25微升超声造影剂溶液。随后立即通过声流控装置泵送造影剂与细胞的混合物。本方案构建了一种可用于增强多种细胞系中细胞内分子递送的声流控系统。与未经处理的对照组相比，经声流控处理后，荧光化合物荧光素向原代人T细胞内的递送效果得到提升。处理后T细胞的荧光强度增加了五倍，表明荧光素的递送效率显著提高。经过声流控处理后，细胞活力略有下降，但仍保持在80%以上。与仅流动处理及未处理对照组相比，声流控处理显著增强了保护性化合物海藻糖向人A549肺癌细胞内的递送效率。将阳离子微泡添加至细胞溶液中至关重要。若溶液中缺乏阳离子微泡，生物分子的细胞内递送将受到限制。该平台可实现多种生物分子的细胞内递送，从而改变细胞功能，用于研究或治疗目的。完成此操作后，可进行进一步的细胞表征分析，以评估递送不同生物分子所产生的影响。

assembly-operation-an-acoustofluidic-device-for-enhanced-delivery

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

增强分子化合物输送到细胞的声透流体装置的组装和操作

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。...

用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。...

用于力学动态细胞培养的微加工平台

来源：Choi, H. J., et al. 利用适配体亲和微珠通过微流控声泳实现革兰氏阴性菌的流通分离。J. Vis. Exp.

适配体辅助声泳法用于微流控分离革兰氏阴性菌

在本视频中，我们首先介绍表面声波（SAW）声学对流装置的 fabrication 和操作流程。随后，我们展示了一种实验装置，该装置能够同时实现对 SAW...

利用表面声波驱动的声学逆流微流控器件的制备、操作与流场可视化

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于将大分子和纳米材料递送至细胞内。本方案详细介绍了如何将该系统应用于多种不同场景的操作步骤。...

细胞挤压作为一种稳定且基于微流控的细胞内递送平台

我们展示了一种基于微流控的检测方法，用于测量细胞通过一系列微米级狭窄通道的通过时间尺度。...

一种用于探测细胞变形能力的微流控技术

本方案描述了一种利用微流控装置实现小体积（0.15–1.5...

用于精确小体积样品处理的微流控平台及其在声学微装置中按尺寸分离生物颗粒的应用

声流控器件利用微流控通道内的超声波来操控、富集和分离悬浮的微米及纳米级微粒。本方案描述了一种支持体声驻波的此类器件的制备与操作方法，可在无需鞘流液辅助的情况下将颗粒聚焦于中心流线。...

用于无鞘聚焦颗粒的体声驻波声流控器件的制备与操作

细胞球体已被视为生物应用领域中一种潜在的模型。本文介绍了一种利用三维声学组装装置可扩展地生成细胞球体的实验方案，该方法能够高效、稳健且快速地制备均一的细胞球体。...

用于大规模制造细胞球体的三维声学组装装置

学习组装和操作声透流体装置，利用超声空化效应实现生物分子向细胞的高效递送。该方法可在维持细胞活性的前提下快速完成分子导入，适用于癌症治疗等细胞疗法研究。

用于增强分子化合物向细胞递送的声流控装置的组装与操作

探索更多视频