Name: 微殖器的高通量实时成像，测量生长和基因表达中的异质性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学习高通量实时成像技术，用于追踪酵母微菌落的生长动态与基因表达异质性。该方法可量化遗传与环境因素对细胞行为的影响，为细胞生物学研究提供精确数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Naomi Ziv、Sasha Levy和Shuang Li在本实验方案开发过程中的贡献，感谢David Gresham提供共享设备，以及Marissa Knoll在视频制作方面的帮助。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目R35GM118170支持。

1. 随机化平板的制备（实验日前）
<ol>
	<li>规划将在生长实验中测试的菌株和培养条件。在此阶段，可将菌株和条件随机分配至任意孔中。 
	注意：在考虑板式设计时，建议在同一块板上为每种菌株和生长条件设置多个重复，以消除因孔间差异导致的测量噪声。详见“讨论”部分。</li>
	<li>对将在不同日期运行的板重复实验，通过计算方法对每种菌株和环境条件的位置进行随机化处理。</li>
	<li>将实验中使用的所有细胞在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YEPD；2% 葡萄糖）培养基中，于30 °C（或其他适当温度）摇床培养至饱和状态。</li>
	<li>通过手动或液体处理机器人制备随机化的储备板。将指定的饱和培养细胞各10 µL加入无菌U型底组织培养板的每个孔中。若单个孔中需测试多个菌株，此时不要混合；这些菌株的混合应在实验当天进行细胞稀释前完成，以确保所有菌株在作为微菌落起始细胞点板时处于正确浓度。</li>
	<li>向每块板的每个孔中加入10 µL的30%甘油。用移液器吹打混匀，使细胞与甘油充分混合。</li>
	<li>用铝箔封膜密封每块板，并立即在-70 °C下冷冻保存，直至使用。 
	&#8203;注意：务必在同一天制备所有随机化板并立即冷冻，以确保各板中细胞的预培养条件完全一致，避免在生长速率测定中引入技术性变异。</li>
</ol>
2. 酵母预培养
注意：通常在实验开始前进行，具体时间高度依赖于实验问题。详见讨论部分。
<ol>
	<li>从 -70 °C 冰箱中取出一块储备板（每孔含 10 µL 酵母和 10 µL 甘油），并向其中每孔加入 180 µL 实验所用培养基。若实验将使用营养限制性培养基，则不要在营养限制性培养基中将酵母预培养至饱和状态，因为这可能导致酵母发生孢子形成。相反，应在非限制性培养基中进行预培养。</li>
	<li>在 30 °C 条件下振荡培养酵母。需考虑实验起始时使用对数生长期还是稳定期的细胞，以确定是否需要在实验前对细胞进行多次稀释。如果实验中的酵母菌株或条件预期具有显著不同的生长速率，则需要进行为期两天的预培养，以使所有不同条件下的细胞均达到稳定期。</li>
</ol>
3. 显微镜设置
<ol>
	<li>显微镜载板准备
	<ol>
		<li>确保显微镜培养箱已开启，并将显微镜腔室加热至实验所需的目标生长温度。对于使用 Saccharomyces cerevisiae 细胞的标准实验，培养箱应将显微镜腔室加热至 30 °C，以确保在生长速率测定期间细胞的生长条件正确。</li>
		<li>使用 70% 乙醇对工作台、移液器及其他工具进行消毒。取出一块显微镜载板，将其放置在无尘且防静电的擦拭布上。 
		注意：切勿用手（即使戴手套）触碰显微镜载板的底部，且每次载板接触任何表面时，都必须将其放置在无尘且防静电的擦拭布上。这可以防止污渍或划痕影响实验成像期间的生长速率测量。</li>
		<li>解冻 5 mL 的 5 倍浓度刀豆蛋白 A（concanavalin A）溶液，用水稀释至 1 倍浓度，并使用装有 0.2-µm 滤膜的注射器过滤除菌。</li>
		<li>使用 0.2 µm 滤膜对实验中使用的其他所有液体（包括实验培养基）进行过滤除菌，以去除溶液中可能形成的晶体或碎屑。晶体的存在会降低显微镜图像的质量。</li>
		<li>向显微镜载板的每个孔中加入 200 µL 刀豆蛋白 A 溶液。</li>
		<li>将载板置于离心机中，在载板下方垫上无尘且防静电的擦拭布，以 411 × 重力加速度（g）离心 2 分钟，确保刀豆蛋白 A 溶液均匀覆盖每个孔的底部，并排除气泡。</li>
		<li>盖上载板盖，静置 1–2 小时。静置时间可灵活调整，但在不同实验运行之间应保持一致。</li>
		<li>通过抽吸或强力吹出的方式将载板中的刀豆蛋白 A 溶液全部移除至水槽或容器中。操作时注意不要触碰载板的玻璃部分。允许少量刀豆蛋白 A 溶液残留在孔中。</li>
		<li>通过向显微镜载板各孔加入 400 µL 无菌水进行洗涤，并按上一步骤中移除刀豆蛋白 A 的方式移除水分。切勿让载板干燥。</li>
		<li>立即向载板中加入 185 µL 实验生长培养基。随后将向其中加入 15 µL 正确稀释的细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母细胞稀释 
	注意：以下步骤描述了将酵母从饱和培养物（约 108 个细胞/mL）稀释 400 倍，以获得 250,000 个细胞/mL 的浓度。取 15 µL 该稀释液加入含 400 µL 培养基的玻璃底板中，最终在 96 孔板中每孔约含 4000 个细胞。若使用 384 孔板，则每孔最终细胞数应约为 700，需相应调整稀释比例。对于处于对数生长期、在更丰富或更贫瘠的预培养基中生长或来自不同菌株的细胞，该比例应进行相应调整。当生长速率测定实验持续时间超过 10 小时时，应降低每孔细胞的最终密度。
	<ol>
		<li>准备两个 96 孔培养板用于系列稀释：标记为板 1 和板 2，并向每个系列稀释板的各孔中加入 90 µL 实验生长培养基。 
		注意：无论最终稀释倍数如何，建议至少进行两步系列稀释，每步均将少量酵母加入较大体积的实验培养基中，再用移液器剧烈混合（如步骤 3.2.5 和 3.2.6 所示）。</li>
		<li>取出预培养的细胞板，以 411 × g 离心 2 分钟。 
		注意：必须严格避免板中不同孔之间的交叉污染。在揭开铝箔封膜前进行此离心步骤，是为了防止某一孔中的酵母液滴从铝箔上飞溅并落入其他孔中。离心后应小心避免倾斜或晃动板，以防酵母接触铝箔封膜。</li>
		<li>小心揭开铝箔，用移液器吸取约等于板中总体积一半的液体，反复吹打混匀，同时在孔内移动移液器头以充分混合。检查是否所有细胞均已从孔底重新悬浮。</li>
		<li>若实验中需使用单个孔内的多个菌株，此时应按实验所需比例混合菌株。若使用参考菌株进行生长速率测量，则参考菌株与测试菌株的比例应为 1:1。</li>
		<li>从生长培养基中吸取 10 µL 酵母加入稀释板 1 中。向每孔加入 100 µL 实验生长培养基，使每孔终体积为 200 µL，并剧烈吹打混匀。</li>
		<li>从板 1 中吸取 10 µL 酵母加入板 2 中。向每孔加入 100 µL 实验生长培养基，并剧烈吹打混匀。 
		注意：这些稀释步骤至关重要，有助于分离预培养阶段末期聚集在一起的酵母细胞团块，确保每个孔中最终含有大致相等数量的酵母细胞。各孔中酵母数量的一致性有助于减少生长速率测量中的实验噪声和偏差（参见代表性结果）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声处理 
	&#8203;注意：超声处理为可选步骤，仅针对易发生细胞粘连的酵母菌株（例如某些野生型菌株）进行。对于实验室常用菌株，通常无需超声处理，可直接进入步骤 3.4。
	<ol>
		<li>将 96 针超声探头放入盛有 70% 乙醇的 96 孔板中，用 70% 乙醇消毒，再用无尘且防静电的擦拭布擦干。</li>
		<li>设置一个足够强的超声程序，以打散聚集的酵母细胞，但不会杀死细胞或引发过度的应激反应。可能需要预先测试以确定特定实验的最佳超声参数。本实验所用超声程序为：振幅 = 10，处理时间 = 10 秒，脉冲开启 = 1 秒，脉冲关闭 = 1 秒。该具体参数可能不适用于所有超声仪，建议在实验前进行测试。</li>
		<li>再次用移液器剧烈吹打 5 次，充分混匀系列稀释板 2 中的酵母细胞。</li>
		<li>将稀释板 2 放置在平台上，并用超声探针固定，确保探针插入细胞悬液中但不接触板底。运行超声程序时需佩戴适当的耳部防护装置。</li>
		<li>程序结束后，用 70% 乙醇清洁超声探头，再用水冲洗，然后立即进入显微镜载板准备步骤，以防细胞再次聚集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜载板准备：
	<ol>
		<li>从系列稀释板 2 中吸取 15 µL 酵母加入显微镜载板中，使终体积为 200 µL。向每孔加入 200 µL 实验生长培养基，使每孔终体积为 400 µL，并剧烈吹打混匀。</li>
		<li>用透气膜封盖载板。必须使用密封良好的方法（例如使用橡胶滚轮）将载板密封严实。</li>
		<li>为使酵母细胞粘附于玻璃表面的刀豆蛋白 A 上，将载板置于离心机中，在其下方垫上无尘且防静电的擦拭布，以 411 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>在显微镜处，用无尘且防静电的擦拭布擦拭载板的顶部和底部，并用压缩空气吹扫以去除碎屑。</li>
		<li>将载板放置于显微镜载物台上，确保其水平放置，并使 A1 孔位于左上角。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 延时显微镜生长速率测量
注意：在延时显微成像过程中，以下参数由计算机控制：x、y 和 z 方向的位置、快门以及荧光滤光片。建议使用基于硬件的自动对焦系统，以防止延时成像期间焦平面漂移；也可采用基于软件的自动对焦循环。为维持显微镜培养室内的湿度，建议在整个实验过程中于培养室内放置一个盛有纯水的烧杯。
<ol>
	<li>创建一个成像位置列表（x, y），以确保每个显微镜板孔都被完整成像。避免图像重叠，以防同一细胞被多次分析。</li>
	<li>使用透射明场照明（DIA）以15倍放大倍数进行成像，曝光时间设置为约5 ms。</li>
	<li>对图像进行数字放大，使细胞清晰可见。使用调焦旋钮确定板上四个角落孔和中心一个孔的最佳焦平面。调焦时应使细胞对比度最大化。</li>
	<li>将实验的z轴位置（或自动对焦位置）设置为上述各孔所确定的z轴/自动对焦位置的平均值。如果显微镜板制作良好且玻璃底无缺陷，则每个孔的最佳对焦位置应相近。 
	注意：在使用Processing Images Easily（PIE）图像分析流程11, 12分析图像时，将细胞在显微镜下略微失焦是有帮助的，这样细胞外部会呈现暗边，内部颜色较亮，有助于准确识别菌落并估算其大小。</li>
	<li>若使用荧光菌株，需确定成像所用的荧光通道及曝光参数，确保无像素过曝。在设置荧光通道的曝光时间时，应关闭显微镜上的&#34;实时预览&#34;模式，以避免细胞长时间暴露于荧光激发光下，从而防止光漂白和细胞应激。</li>
	<li>设置时间序列采集程序，以在所需时间段内按设定的时间间隔捕获图像。</li>
	<li>运行实验。</li>
</ol>

<ol><li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320(2013).</li>
<li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+diversity%2C+population+growth%2C+and+information+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+population+biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li>
<li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li>
<li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325(2012).</li>
<li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972(2015).</li>
<li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li>
<li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744(2018).</li>
<li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Siegallab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://github.com/Siegallab/PIE">http://github.com/Siegallab/PIE</a> (2020).</li>
<li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li>
<li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concanavalin+A%3A+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+microbial+technology%22%5BJournal%5D)">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li>
<li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+details+in+the+distributions%3A+why+and+how+to+study+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+a+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
<li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exemplary+and+surrogate+models%3A+two+modes+of+representation+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Perspectives+in+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的实验方案是一种多功能检测方法，可同时在单个微菌落水平上监测细胞生长和基因表达。结合这两种检测模式能够获得独特的生物学见解。例如，先前的研究利用该方法同时测量了同基因型野生型细胞中TSL1基因的表达水平与微菌落生长速率，发现二者呈负相关关系7,10。此外，该检测方法还可用于监测生长速率与荧光标记蛋白亚细胞定位动态之间的关系。例如，在启动生长检测前，每分钟对细胞进行一次荧光成像，持续30分钟，由此发现生长速率与RFP标记的转录因子Msn2&#160;在细胞核中的占据程度之间存在负相关关系10。最后，本方案还允许监测细胞对环境胁迫和干扰的响应。例如，可在生长检测进行到中途时施加热激等处理。此类研究已发现，高表达Tsl1且生长缓慢的细胞对热激具有更强的耐受性7,10。
除了代表性结果...

生长表型对酵母适应性具有关键影响。自然选择能够有效区分生长速率差异达到有效种群大小倒数的谱系，而有效种群大小可超过108个个体1。此外，种群内个体间生长速率的变异性也是一个具有进化意义的参数，因为它可作为生存策略（如博弈对冲）的基础2,3,4,5,6。因此，能够高精度测量生长表型及其分布的实验方法对于微生物研究至关重要。本文所述的微菌落生长实验每轮可获得约105个微菌落的个体生长速率数据。该实验方法为研究酵母的进化遗传学与基因组学提供了强有力的工具，尤其适用于探究基因型相同的单细胞种群内部变异性的产生机制、维持方式及其对种群适应性的贡献7,8,9,10。
本文所述方法（图1）利用周期性采集的低倍明场图像，对在96孔或384孔玻璃底板中液体培养基内生长的细胞形成微菌落的过程进行追踪。细胞黏附于涂覆在显微镜板底部的刀豆球蛋白A（concanavalin A）上，并形成二维菌落。由于微菌落以单层形式生长，微菌落面积与细胞数量高度相关7。因此，可通过定制的图像分析软件，追踪各微菌落面积变化速率，从而准确估算微菌落的生长速率和滞后期。此外，该实验装置还可监测这些微菌落中表达的荧光标记蛋白的丰度，甚至其亚细胞定位。该微菌落生长实验所产生的数据，可通过定制分析程序或现有的图像分析软件进行后续处理，例如“轻松处理图像”（Processing Images Easily, PIE）11——一种可从GitHub获取的算法12，能够从低倍明场图像中稳健识别菌落面积并实现高通量生长分析。
由于微菌落生长实验所获得的生长速率估计值源自大量单菌落的测量，因此其准确性极高，对于规模合理的实验而言，标准误差比估计值本身小数个数量级。因此，该实验在检测不同基因型、处理方式或环境条件之间的生长速率差异方面具有很高的灵敏度。多孔板格式使得在单次实验中可以比较多种不同的环境与基因型组合。如果菌株组成型表达不同的荧光标记物，则可将其混合接种于同一孔中，并通过后续图像分析加以区分，从而通过孔间数据归一化进一步提高检测效能。
<img alt="细胞生长与显微镜观察流程。随机化培养板设置、稀释、孵育步骤示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验方案的示意图。 本方案包括两个主要步骤：实验用培养板的制备和待成像细胞的制备。培养板的随机化处理及细胞培养应在实验日前及临近实验日时完成。在稀释过程中的每一步均必须充分混匀细胞，直至铺板结束。因此，建议优先制备实验用培养板，以便在细胞稀释完成后立即进行铺板操作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;通用材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL 瓶顶滤器，0.22 &amp;micro;m PES，无菌，低蛋白结合，带45 mm 接口</td><td>Fisher</td><td>CLS431154</td><td>用于过滤培养基</td></tr><tr><td>BD Falcon* 组织培养板，微孔U型底</td><td>Fisher</td><td>08-772-54</td><td>96孔培养管，用于细胞冻存、预培养及稀释</td></tr><tr><td>BD 无针注射器，50 mL</td><td>Fisher</td><td>13-689-8</td><td>用于过滤刀豆蛋白A（Concanavalin A）</td></tr><tr><td>Costar 一次性无菌试剂储液槽</td><td>Fisher</td><td>07-200-127</td><td>试剂储液槽，用于多通道移液器加样</td></tr><tr><td>Costar Thermowell 铝箔密封膜</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>用于预培养和冻存的96孔板密封膜</td></tr><tr><td>无尘且防静电Kimwipes擦拭纸</td><td>Fisher</td><td>06-666A</td><td>无尘防静电擦拭纸，用于保持显微镜用培养板底部无碎屑和划痕</td></tr><tr><td>Nalgene 注射式滤器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>199-2020</td><td>孔径0.2 &amp;mu;m，直径25 mm；用于过滤刀豆蛋白A溶液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>最低化学成分定义培养基（MD；含2%葡萄糖）</td><td></td><td></td><td>用于酵母预培养及显微镜观察期间生长的替代显微镜培养基</td></tr><tr><td>合成完全培养基（SC；含2%葡萄糖）</td><td></td><td></td><td>用于酵母预培养及显微镜观察期间生长的显微镜培养基</td></tr><tr><td>酵母提取物-蛋白胨-右旋糖（YEPD；含2%葡萄糖）培养基</td><td></td><td></td><td>在冻存随机化培养板前用于细胞生长</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy 透气密封膜</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z380059-1PAK</td><td>用于显微镜实验期间密封培养板的透气膜。此阶段推荐使用透气膜，因其可防止孔内冷凝并获得更佳的显微图像</td></tr><tr><td>Brooks 96孔平底透明玻璃底显微镜培养板</td><td>Dot Scientific</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td>显微镜专用培养板</td></tr><tr><td>来自刀豆（Canavalia ensiformis，Jack Bean）的刀豆蛋白A（Concanavalin A），冻干粉末</td><td>Millipore Sigma</td><td>45-C2010-1G</td><td>配制5倍浓度的刀豆蛋白A溶液，并将5 mL 5倍溶液分装至50 mL离心管中，于-80 &amp;deg;C冻存</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;所用菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td><td></td><td></td><td>实验室背景下的单倍体突变累积菌株，详见Hall和Joseph 2010年文献</td></tr><tr><td>EP026.2A-2C</td><td></td><td></td><td>源自Hall和Joseph 2010年突变累积菌株的后代，转化了YFR054c&amp;Delta;::Scw11P::GFP</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misonix S-4000 超声仪，配备96针附件</td><td></td><td></td><td>超声仪 https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E 配备完美聚焦系统（Perfect Focus System）</td><td></td><td></td><td>带自动载物台和自动对焦系统的倒置显微镜</td></tr></tbody></table>

高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

准确测量菌株间和菌株内微生物生长速率的异质性，对于理解遗传和环境因素对胁迫耐受性、致病性及其他适合度关键组分的影响至关重要。本文描述了一种基于显微镜的检测方法，每次实验可追踪约105&#160;Saccharomyces cerevisiae微菌落。通过自动化的延时成像技术对固定在多孔板中的酵母进行成像后，可利用定制的图像分析软件轻松分析微菌落的生长速率。对于每个微菌落，还可同时监测荧光蛋白的表达与定位以及对急性胁迫的存活情况。该检测方法不仅能够精确估算菌株的平均生长速率，还可全面测量克隆群体内生长、基因表达和胁迫耐受性方面的异质性。

本方案的创新之处在于，通过延时成像追踪单个细胞生长形成微菌落的过程，可计算出群体内每个细胞的生长速率（图2A）。由于存在刀豆球蛋白A（concanavalin A），微菌落在生长过程中呈平面扩展并持续数小时，因此可在整个实验过程中追踪其面积变化，并通过对面积自然对数随时间变化进行线性拟合，从而计算出每个被观察微菌落的生长速率7,9,10,13。在同一环境中，同基因型单个细胞的微菌落生长速率差异可被清晰记录（图2A、2B）。应使用图像分析软件自动追踪微菌落大小和荧光信号的变化（图2C）；图2A中所示的菌落追踪是使用PIE软件完成的11</s...

通过高通量延时成像技术，对固定化的酵母细胞在微菌落生长过程中的生长表型进行精确测量。同时，可监测其胁迫耐受性、蛋白质表达及蛋白质定位，从而生成整合型数据集，用于研究环境差异、遗传差异以及同基因型细胞间基因表达异质性如何调控细胞生长。

精确测量菌株间和菌株内微生物生长速率的异质性，对于理解遗传和环境因素……

本方案可实现高通量酵母细胞培养，能够同时追踪数千个微菌落的生长情况和基因表达。可量化不同菌株之间、不同环境之间，甚至在同一环境中生长的遗传背景完全相同的细胞之间的差异。该方案可精确估算细胞的平均生长速率以及基因表达报告系统的平均荧光强度。此外，由于检测了大量单个微菌落，因此能够获得生长和表达值整体分布的精确估计。本实验方案包括两个主要步骤：实验平板的制备以及用于成像的细胞准备。细胞在稀释和混合后必须立即接种到平板上。因此，我们建议首先设置好实验用的培养板。您会注意到，在本实验方案中，细胞在接种前需要多次重复混匀，这一步骤至关重要。在实验当天，所有用于检测的培养基和其他溶液都必须使用2微米滤器进行过滤，即使这些溶液已经处于无菌状态，以去除可能在显微镜图像中出现的任何晶体。这包括实验用培养基和刀豆蛋白A溶液。接下来，准备显微镜用培养板。为了保持孔板玻璃表面无碎屑和划痕，始终应在培养板下方放置一块无尘且防静电的擦拭布。在已灭菌的实验台上采用无菌操作技术。将25毫升1X刀豆蛋白A溶液过滤后，用移液器向显微镜板的每孔中加入200微升。建议固定移液器以确保合适的高度。将显微镜板置于无绒且防静电的擦拭布上，以411 ×g离心两分钟，以去除可能阻碍刀豆蛋白A均匀包被孔底的气泡。让含有刀豆蛋白A溶液的板静置1至2小时。在实验过程中保持操作一致。Concanavalin A 孵育后，使用吸液装置或用力将溶液从 96 孔板中倒出（如图所示），以去除 Concanavalin A。部分液滴会残留。接下来，向每个孔中加入 400 µL 无菌水，洗涤孔板。在移除刀豆蛋白A溶液后立即加入水。切勿让培养板干燥。操作时应避免移液枪头接触包被的板底，以免将刀豆蛋白A从孔的玻璃表面移位或去除。以与去除刀豆蛋白A溶液相同的方式除去水，并立即向显微镜板中加入185微升实验培养基。切勿让板子干燥。此时，该板已准备好加入50微升稀释的细胞。取出您预先培养的随机排列的96孔板。您的实验问题将决定细胞应处于饱和期还是对数生长期，以及在检测中应使用的随机重复孔数量。以411 × g离心2分钟，以尽量减少在移除铝箔封膜时发生交叉污染的风险。操作时切勿倾斜培养板。如果酵母和培养基接触到覆盖培养板的封口膜，可能导致不同孔之间的污染。首先准备好用于进行梯度稀释的培养板。向每个稀释板中加入 90 µL 实验培养基。接下来准备细胞。从 96 孔板上取下箔膜时需格外小心，防止一个孔中的液滴进入另一个孔。由于离心作用，酵母将集中在培养板底部。为确保在稀释过程中细胞充分混匀，始终将少量细胞加入较大量培养基中，然后再向混合物中加入另一份大量培养基。每一步都务必用力吹打混匀。在本视频中，我们对处于饱和状态的酵母细胞和合成完全培养基进行了稀释，将进行 10,000 倍稀释，以达到显微镜板中每孔约 4,000 个细胞的最终浓度。为重悬细胞，需用力上下吹打，并将移液枪头在孔内以环形运动方式移动。混匀后，各孔中均不应残留可见的沉淀酵母，如 A1 孔所示。图中其他各孔均未重新悬浮，以供对比。使用血细胞计数板等方法对预培养平板中的细胞进行计数，并将不同菌株按等比例混合后加入同一孔中。此处，我们将预培养平板中的细胞与一种荧光标记参考菌株按 1:1 的比例混合。在细胞浓度标准化后，向第一块连续稀释板中加入10 µL细胞。然后加入100 µL培养基，使最终体积达到200 µL。在加入细胞和培养基后，均需使用移液器充分混匀，将移液器吸头在孔内以环形轨迹移动。从此时起，直到将细胞加入显微镜载板之前，需迅速完成后续操作步骤。接下来，从第一个梯度稀释平板中取10 µL酵母加入第二个梯度稀释平板中。然后向其中加入100 µL实验培养基。充分混匀。如果您的酵母没有明显的絮凝倾向，则在此步骤后可直接用于显微镜载片。请立即进行点样。然而，如果你所使用的酵母菌株具有中等程度的絮凝倾向，则需要进行以下可选的超声处理步骤。如果进行超声处理，应首先再次用移液器充分混匀酵母溶液，然后再进行超声。将稀释后的酵母样品置于超声仪上，将96孔板的探针浸入每个孔的溶液中，但不要接触孔底。设置超声处理程序，其强度应足以打散成团的酵母细胞，但不会杀死细胞或引发明显的应激反应。可能需要进行一些测试，以确定特定实验的最佳超声处理程序。程序完成后，立即取出细胞并马上进行下一步操作。取15微升来自第二级连续稀释平板的酵母加入显微镜用培养板中。轻轻吹打混匀，注意避免扰动附着在培养板孔底部的刀豆蛋白A。随后，向显微镜用培养板中加入200微升实验培养基，使最终体积达到400微升。小心移液混匀。用透气膜覆盖培养板，确保培养板边缘密封良好。将显微镜载板底部朝下，用无绒且防静电的擦拭布垫在下方，以411 ×g离心两分钟，使酵母细胞附着于载板底部的刀豆蛋白A（Concanavalin A）上。此时载板已准备好用于成像。在显微镜下，用无绒且防静电的擦拭布擦拭载板的顶部和底部，并向载板底部吹入压缩空气以去除碎屑。将培养板放置在显微镜载物台上。确保 A1 孔位于左上角，并且显微镜已加热至细胞生长所需的合适温度。同时确保培养板整齐地放入显微镜中，且培养板底部平整贴合。如果培养板带有塑料盖，则在开始显微成像前应先将其移除。这对于获取高质量的图像以进行后续分析至关重要。我们加载一个自动生成的文件，其中包含X和Y坐标以及焦平面位置，用于对整个显微镜培养板进行成像。若使用预先生成的文件，需在显微镜载板上随机抽查若干位置，以确保细胞位于正确的焦平面上。焦平面应略高于细胞，使细胞周围呈现暗边，且细胞亮度高于背景，这将有助于观察。设置实验所需的时间点数量及时间点间隔。如果需要同时采集生长速率和荧光强度数据，则还需设置荧光成像程序。调整每个待成像通道的亮度，确保显微镜载板上任何位置均无过曝现象。在非实时成像模式下测试您将要使用的曝光参数。对于荧光图像，荧光信号应能用肉眼观察到。但除此之外，我们建议设置较低的曝光值。由单个细胞接种形成的、间距适当的菌落会沿培养板表面以单层形式生长。因此，可利用自动图像分析准确计算多个单个微菌落的生长速率。荧光标记可用于区分在同一孔中生长的不同菌株。由此，可计算出在相同环境中生长的单个微菌落的完整生长速率分布。本实验可实现较大的样本量，从而能够精确估计不同菌株或培养条件之间的平均差异。此处展示了从一组突变累积系中在单孔内培养的成对菌落及其孔内GFP参考对照菌落的生长速率。若在显微镜平板上观察到细胞发生聚集，须在接种前通过超声处理将聚集体打散。成团且未充分分散的细胞无法在培养皿表面形成平面的微菌落，从而导致无法准确计算生长速率。并非所有培养基都适用于微菌落生长速率检测。某些类型的培养基，包括含有酵母提取物或pH值较低的培养基，会阻碍细胞与刀豆蛋白A的结合，导致实验过程中细胞从正在生长的微菌落中漂浮脱落，进而产生错误的生长速率测量结果。避免细胞铺板过密非常重要。当细胞铺板过于密集时，生长较快的微克隆会较早地相互融合，如图中所示的颜色追踪丢失。这种效应可能导致生长速率估计出现偏差，因为在收集到足够时间点的数据之前，生长较慢的克隆与邻近克隆融合的可能性较小。根据培养条件的不同，部分细胞在开始生长前可能会经历一个滞后期。在利用菌落面积计算生长速率时，需要考虑这一因素，而不是将所有可用的时间点都拟合到一条生长曲线中。本方案可用于研究与酵母生长及进化相关的多种问题。其灵活的微孔板格式意味着该方法可适用于其他酵母物种、不同的生长条件、其他微生物，甚至可能适用于培养中的其他细胞。

high-throughput-live-imaging-microcolonies-to-measure-heterogeneity

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微殖器的高通量实时成像，测量生长和基因表达中的异质性

我们介绍一种荧光显微镜方法——翻译偶联切割激活法（Co-Translational Activation by Cleavage, CoTrAC），可在不干扰蛋白质功能的前提下，以单分子精度对活细胞中蛋白质分子的生成进行成像。该方法已被用于追踪转录因子λ阻遏蛋白CI 1...

基因调控的单分子成像 在体 利用共翻译切割激活（CoTrAC）

在此，我们介绍一种表型检测方法，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化学化合物的高通量/高内涵筛选 结核分枝杆菌 突变文库。该方法依赖于荧光标记的检测 结核分枝杆菌...

一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法

ScanLag 是一种高通量方法，可并行测量数千个细胞的生长延迟（即滞后时间）以及菌落的生长速率。利用 ScanLag...

ScanLag：菌落生长与滞后期的高通量定量分析

蛋白质之间会相互作用，而这些相互作用在很大程度上决定了它们的功能。可通过基于二氢叶酸还原酶蛋白片段互补分析法（DHFR-PCA）的酵母适合度检测，在高通量条件下在活体（in...

活细胞中基于蛋白质片段互补分析法（PCA）的全基因组蛋白质-蛋白质相互作用筛选

利用简单的微生物系统可以在实验室中研究分选（空间隔离）在进化情景中的作用，这类系统能够对空间分布进行可控调节。通过改变起始细胞密度，可使用荧光标记的细菌菌株在枯草芽孢杆菌（Bacillus...

监测表面定植微生物群体中的空间分离现象

在微量滴定板中培养放射性标记的细菌，可实现高通量取样，从而对核苷酸池含量（包括(p)ppGpp）进行多次技术重复和生物学重复检测。可监测由生理应激源引发的生长转换及其从应激中恢复过程中的效应。...

使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

本文提供了使用高分辨率荧光显微镜研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

活细胞荧光显微镜技术用于研究细菌中亚细胞蛋白定位及细胞形态变化

该活细菌细胞成像方案可实现随时间推移在单细胞水平上可视化多种细菌物种之间的相互作用。通过延时成像，可观察每种细菌在单培养或共培养条件下的行为，从而研究多物种细菌群落中的种间相互作用，包括单个细胞的运动性和存活能力。...

单细胞水平细菌种间相互作用的动力学可视化

这是一种用于筛选癌症转移抑制因子或驱动因子的有效方法。将携带表达文库的细胞注入鸡胚尿囊膜血管系统，以形成转移性克隆。对侵袭能力降低或增强的克隆进行分离、扩增，并重新注射以确认其表型，最后通过高通量测序进行分析。...

利用快速定量的鸡胚尿囊膜活体模型发现转移调控因子

本方法采用96孔板形式对菌落形成单位（CFUs）进行接种，通过定量微生物丰度应用于整个果蝇匀浆样品中的Drosophila...

96孔板格式下的快速菌落形成单位计数应用于 黑腹果蝇 微生物组

本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。...

利用宽场活细胞成像进行大规模及单肿瘤类器官分析的多参数类器官药物筛选

学习高通量实时成像技术，用于追踪酵母微菌落的生长动态与基因表达异质性。该方法可量化遗传与环境因素对细胞行为的影响，为细胞生物学研究提供精确数据。

高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

探索更多视频