高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

本方案可实现高通量酵母细胞培养，能够同时追踪数千个微菌落的生长情况和基因表达。可量化不同菌株之间、不同环境之间，甚至在同一环境中生长的遗传背景完全相同的细胞之间的差异。该方案可精确估算细胞的平均生长速率以及基因表达报告系统的平均荧光强度。

此外，由于检测了大量单个微菌落，因此能够获得生长和表达值整体分布的精确估计。本实验方案包括两个主要步骤：实验平板的制备以及用于成像的细胞准备。细胞在稀释和混合后必须立即接种到平板上。

因此，我们建议首先设置好实验用的培养板。您会注意到，在本实验方案中，细胞在接种前需要多次重复混匀，这一步骤至关重要。在实验当天，所有用于检测的培养基和其他溶液都必须使用2微米滤器进行过滤，即使这些溶液已经处于无菌状态，以去除可能在显微镜图像中出现的任何晶体。

这包括实验用培养基和刀豆蛋白A溶液。接下来，准备显微镜用培养板。为了保持孔板玻璃表面无碎屑和划痕，始终应在培养板下方放置一块无尘且防静电的擦拭布。

在已灭菌的实验台上采用无菌操作技术。将25毫升1X刀豆蛋白A溶液过滤后，用移液器向显微镜板的每孔中加入200微升。建议固定移液器以确保合适的高度。

将显微镜板置于无绒且防静电的擦拭布上，以411 ×g离心两分钟，以去除可能阻碍刀豆蛋白A均匀包被孔底的气泡。让含有刀豆蛋白A溶液的板静置1至2小时。在实验过程中保持操作一致。

Concanavalin A 孵育后，使用吸液装置或用力将溶液从 96 孔板中倒出（如图所示），以去除 Concanavalin A。部分液滴会残留。接下来，向每个孔中加入 400 µL 无菌水，洗涤孔板。

在移除刀豆蛋白A溶液后立即加入水。切勿让培养板干燥。操作时应避免移液枪头接触包被的板底，以免将刀豆蛋白A从孔的玻璃表面移位或去除。

以与去除刀豆蛋白A溶液相同的方式除去水，并立即向显微镜板中加入185微升实验培养基。切勿让板子干燥。此时，该板已准备好加入50微升稀释的细胞。

取出您预先培养的随机排列的96孔板。您的实验问题将决定细胞应处于饱和期还是对数生长期，以及在检测中应使用的随机重复孔数量。以411 × g离心2分钟，以尽量减少在移除铝箔封膜时发生交叉污染的风险。

操作时切勿倾斜培养板。如果酵母和培养基接触到覆盖培养板的封口膜，可能导致不同孔之间的污染。首先准备好用于进行梯度稀释的培养板。

向每个稀释板中加入 90 µL 实验培养基。接下来准备细胞。从 96 孔板上取下箔膜时需格外小心，防止一个孔中的液滴进入另一个孔。

由于离心作用，酵母将集中在培养板底部。为确保在稀释过程中细胞充分混匀，始终将少量细胞加入较大量培养基中，然后再向混合物中加入另一份大量培养基。

每一步都务必用力吹打混匀。在本视频中，我们对处于饱和状态的酵母细胞和合成完全培养基进行了稀释，将进行 10,000 倍稀释，以达到显微镜板中每孔约 4,000 个细胞的最终浓度。为重悬细胞，需用力上下吹打，并将移液枪头在孔内以环形运动方式移动。

混匀后，各孔中均不应残留可见的沉淀酵母，如 A1 孔所示。图中其他各孔均未重新悬浮，以供对比。使用血细胞计数板等方法对预培养平板中的细胞进行计数，并将不同菌株按等比例混合后加入同一孔中。此处，我们将预培养平板中的细胞与一种荧光标记参考菌株按 1:1 的比例混合。

在细胞浓度标准化后，向第一块连续稀释板中加入10 µL细胞。然后加入100 µL培养基，使最终体积达到200 µL。在加入细胞和培养基后，均需使用移液器充分混匀，将移液器吸头在孔内以环形轨迹移动。

从此时起，直到将细胞加入显微镜载板之前，需迅速完成后续操作步骤。接下来，从第一个梯度稀释平板中取10 µL酵母加入第二个梯度稀释平板中。然后向其中加入100 µL实验培养基。

充分混匀。如果您的酵母没有明显的絮凝倾向，则在此步骤后可直接用于显微镜载片。请立即进行点样。

然而，如果你所使用的酵母菌株具有中等程度的絮凝倾向，则需要进行以下可选的超声处理步骤。如果进行超声处理，应首先再次用移液器充分混匀酵母溶液，然后再进行超声。将稀释后的酵母样品置于超声仪上，将96孔板的探针浸入每个孔的溶液中，但不要接触孔底。

设置超声处理程序，其强度应足以打散成团的酵母细胞，但不会杀死细胞或引发明显的应激反应。可能需要进行一些测试，以确定特定实验的最佳超声处理程序。程序完成后，立即取出细胞并马上进行下一步操作。

取15微升来自第二级连续稀释平板的酵母加入显微镜用培养板中。轻轻吹打混匀，注意避免扰动附着在培养板孔底部的刀豆蛋白A。随后，向显微镜用培养板中加入200微升实验培养基，使最终体积达到400微升。

小心移液混匀。用透气膜覆盖培养板，确保培养板边缘密封良好。

将显微镜载板底部朝下，用无绒且防静电的擦拭布垫在下方，以411 ×g离心两分钟，使酵母细胞附着于载板底部的刀豆蛋白A（Concanavalin A）上。此时载板已准备好用于成像。在显微镜下，用无绒且防静电的擦拭布擦拭载板的顶部和底部，并向载板底部吹入压缩空气以去除碎屑。

将培养板放置在显微镜载物台上。确保 A1 孔位于左上角，并且显微镜已加热至细胞生长所需的合适温度。同时确保培养板整齐地放入显微镜中，且培养板底部平整贴合。

如果培养板带有塑料盖，则在开始显微成像前应先将其移除。这对于获取高质量的图像以进行后续分析至关重要。我们加载一个自动生成的文件，其中包含X和Y坐标以及焦平面位置，用于对整个显微镜培养板进行成像。

若使用预先生成的文件，需在显微镜载板上随机抽查若干位置，以确保细胞位于正确的焦平面上。焦平面应略高于细胞，使细胞周围呈现暗边，且细胞亮度高于背景，这将有助于观察。设置实验所需的时间点数量及时间点间隔。

如果需要同时采集生长速率和荧光强度数据，则还需设置荧光成像程序。调整每个待成像通道的亮度，确保显微镜载板上任何位置均无过曝现象。在非实时成像模式下测试您将要使用的曝光参数。

对于荧光图像，荧光信号应能用肉眼观察到。但除此之外，我们建议设置较低的曝光值。由单个细胞接种形成的、间距适当的菌落会沿培养板表面以单层形式生长。

因此，可利用自动图像分析准确计算多个单个微菌落的生长速率。荧光标记可用于区分在同一孔中生长的不同菌株。由此，可计算出在相同环境中生长的单个微菌落的完整生长速率分布。

本实验可实现较大的样本量，从而能够精确估计不同菌株或培养条件之间的平均差异。此处展示了从一组突变累积系中在单孔内培养的成对菌落及其孔内GFP参考对照菌落的生长速率。若在显微镜平板上观察到细胞发生聚集，须在接种前通过超声处理将聚集体打散。

成团且未充分分散的细胞无法在培养皿表面形成平面的微菌落，从而导致无法准确计算生长速率。并非所有培养基都适用于微菌落生长速率检测。某些类型的培养基，包括含有酵母提取物或pH值较低的培养基，会阻碍细胞与刀豆蛋白A的结合，导致实验过程中细胞从正在生长的微菌落中漂浮脱落，进而产生错误的生长速率测量结果。

避免细胞铺板过密非常重要。当细胞铺板过于密集时，生长较快的微克隆会较早地相互融合，如图中所示的颜色追踪丢失。这种效应可能导致生长速率估计出现偏差，因为在收集到足够时间点的数据之前，生长较慢的克隆与邻近克隆融合的可能性较小。

根据培养条件的不同，部分细胞在开始生长前可能会经历一个滞后期。在利用菌落面积计算生长速率时，需要考虑这一因素，而不是将所有可用的时间点都拟合到一条生长曲线中。本方案可用于研究与酵母生长及进化相关的多种问题。

其灵活的微孔板格式意味着该方法可适用于其他酵母物种、不同的生长条件、其他微生物，甚至可能适用于培养中的其他细胞。